耿 飛，孫 濤，盧癸鳳

(1.遵義醫(yī)學院 生理學教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院 病理生理學教研室，貴州 遵義 563099)

?

基礎(chǔ)醫(yī)學研究

HDJ2促進體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞的侵襲并抵抗其凋亡

耿 飛1，孫 濤1，盧癸鳳2

(1.遵義醫(yī)學院 生理學教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院 病理生理學教研室，貴州 遵義 563099)

目的 探討HDJ2對膠質(zhì)瘤細胞株U251及U261體外生物學功能的影響。方法 培養(yǎng)U251和U261細胞并瞬時轉(zhuǎn)染針對HDJ2的siRNA及過表達質(zhì)粒，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞的HDJ2 mRNA表達，CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖能力，Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞的侵襲能力，流式細胞儀觀察轉(zhuǎn)染后U251和U261細胞的凋亡情況。結(jié)果 在膠質(zhì)瘤細胞中干擾HDJ2后其體外侵襲能力顯著下降(U251細胞:P=0.02;U261細胞:P=0.001)，凋亡率明顯上升(U251細胞:P=0.027;U261細胞:P=0.001)，而過表達HDJ2后則表現(xiàn)出相反結(jié)果，但HDJ2對膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力無明顯影響(U251細胞過表達及干擾HDJ2:P=0.517，P=0.735;U261細胞過表達及干擾HDJ2:P=0.735，P=0.212)。結(jié)論 HDJ2可以有效促進膠質(zhì)瘤細胞的體外侵襲能力并誘導膠質(zhì)瘤細胞的凋亡抵抗，提示其在體外膠質(zhì)瘤的發(fā)展進程中發(fā)揮著重要的作用。

HDJ2；膠質(zhì)瘤；侵襲；凋亡

膠質(zhì)瘤是成人最常見的腦腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的81%，可見于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的任何部位[1]。作為膠質(zhì)瘤中占比最大、惡性程度高、侵襲性強的腫瘤，膠質(zhì)母細胞瘤患者5年生存率僅有5%[2]。盡管近年來針對膠質(zhì)瘤的研究取得了長足進步，但臨床上對其治療并沒有實質(zhì)性突破，膠質(zhì)瘤的預(yù)后仍然不容樂觀。因此，進一步闡明膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機制，仍然是目前針對其研究的重要方向。

熱休克蛋白(HSPs)是一類多肽類蛋白質(zhì)，根據(jù)其結(jié)構(gòu)大小分為：HSP90、HSP70、HSP60、HSP40以及小分子HSP27，HSPs參與蛋白裝配、分泌、運輸及蛋白降解和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子等多種細胞活動[3-5]。HSP40(DnaJ)是HSPs中的一個分子伴侶家族，而HDJ2又是HSP40家族成員之一[6]。DnaJ蛋白家族成員的結(jié)構(gòu)都具有一個共同特點，即均在氨基末端有一個高度保守的J結(jié)構(gòu)域、一個甘氨酸/丙氨酸富集結(jié)構(gòu)域、4個CxxCxGxG鋅指重復序列結(jié)構(gòu)域，以及一個C端底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。J結(jié)構(gòu)域是DnaJ蛋白的標志性結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含保守的組氨酸、脯氨酸和天冬氨酸殘基，可以與HSP70結(jié)合以增強其ATP活性[7]。由于HSP70在多種腫瘤中表達上調(diào)，并且通過抑制細胞死亡而強有力地促進腫瘤的發(fā)展，而HDJ2與HSP70之間聯(lián)系緊密，因此HDJ2也成為一個受人關(guān)注的靶點[8-12]。然而，目前并沒有研究報道剔除了HSP70的因素后，HDJ2基因的J結(jié)構(gòu)域在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有獨立作用[7]。而近年來，HDJ2家族可能參與腫瘤發(fā)生和惡性進程一直是人們爭論的問題。本文擬通過在體外對膠質(zhì)瘤細胞株分別沉默和過表達HDJ2并觀察其對細胞增值、侵襲和凋亡的影響，明確HDJ2在膠質(zhì)瘤細胞株中的生物學作用，以期未來揭示HDJ2影響膠質(zhì)瘤進程的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人膠質(zhì)瘤細胞株U251及U261由遵義醫(yī)學院生理學教研室保存。

1.2 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、含EDTA0.25%胰酶，Gibico生物公司；Lipofectamine TM 2000試劑盒，Life Technologies公司；HDJ2 siRNA(包括NC/HDJ2-1/HDJ2-2/HDJ2-3 siRNA共4個片段)，廣州銳博生物科技公司；HDJ2過表達質(zhì)粒，美國復能基因公司；質(zhì)粒小提試劑盒，Life旗下的Invitrogen公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，TAKARA公司；GAPDH及HDJ2的RT-PCR引物由Invitrogen公司合成；CCK-8試劑盒，日本同仁公司；Boyden Transwell小室，美國BD公司；Annexin V、Propidium Iodide，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。六孔板、96孔板、培養(yǎng)瓶等，NEST公司。

CO2細胞培養(yǎng)箱，Thermo公司；顯微鏡，Olympus公司；ABI7500熒光定量PCR儀，ABI公司；ST16R型低溫高速離心機、NANODROP2000超微量分光光度計，Thermo公司；Model 680酶標儀，BIO-RAD公司；PK-8D型電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司。流式細胞儀，BD公司。

1.3 方法

1.3.1 膠質(zhì)瘤細胞株U251和U261細胞培養(yǎng) U251及U261來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫，由遵義醫(yī)學院生理學教研室保存，采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 質(zhì)粒擴增 購買回來商品化的HDJ2過表達及其空白對照質(zhì)粒經(jīng)過轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒小搖、質(zhì)粒中搖，質(zhì)粒中提等一系列擴大培養(yǎng)，以大批量獲取質(zhì)粒用于后續(xù)實驗。

1.3.3 U251和U261轉(zhuǎn)染HDJ2siRNA及HDJ2過表達質(zhì)粒 選取狀態(tài)良好的膠質(zhì)瘤細胞株U251及U261，消化吹打成均勻的細胞懸液后鋪于6孔板內(nèi)，密度達50%，24 h后待細胞長到密度達70%左右，給予每孔5 μL siRNA(濃度為20 μmol/L)瞬時轉(zhuǎn)染，分為陰性對照組(NC)及siHDJ2-1/siHDJ2-2/siHDJ2-3 4個組，轉(zhuǎn)染8 h后更換含10%胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。過表達則分為陰性對照組(MOCK)及HDJ2過表達組，其中陰性對照組轉(zhuǎn)染HDJ2過表達質(zhì)粒的空白對照質(zhì)粒，每孔給予4 μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染6 h后，更換含10%胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4 RT-PCR檢測HDJ2干擾和過表達轉(zhuǎn)染后U251和U261細胞的HDJ2mRNA表達 收集瞬時轉(zhuǎn)染24 h后的細胞，用TRIZOL抽提法提取RNA后，紫外分光光度儀測定RNA濃度及260/280值，TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37 ℃ 60 min，85 ℃滅活5 min。所得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用滅菌水稀釋5倍后-20 ℃保存?zhèn)溆?。RT-PCR檢測cDNA中HDJ2含量，引物序列為HDJ2(F：5’CCTTCATTTGGATTCTTATCAGG3’，R：5’GAGCCAAAACCACCACCTGC3’)，內(nèi)參為GAPDH(F：GTCAACGGATTTGGTCGTATTG，R：CTCCTGGAAGATGGTGATGGG)，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 34 s，40個循環(huán)，檢測各模版的Ct值，所有實驗均重復3次，結(jié)果以Ct值法計算各對照組及實驗組各基因的相對表達量，計算公式為△△Ct=(CtHDJ2-CtGAPDH)實驗組-(CtHDJ2-CtGAPDH)對照組。

1.3.5 CCK-8檢測HDJ2干擾和過表達轉(zhuǎn)染后U251和U261細胞增殖能力 選取生長狀態(tài)良好的膠質(zhì)瘤細胞株U251及U261鋪板，分別給予siRNA或HDJ2過表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染。24 h后，PBS洗滌2次，消化，離心，去除細胞培養(yǎng)基，加入空培(不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，下同)，重懸，計數(shù)。按每孔1 000個細胞的數(shù)量加入到96孔板中，每孔用全培(含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，下同)將細胞稀釋至約100 μL，每處理組內(nèi)分7組，每組5個復孔，同時設(shè)立僅加培養(yǎng)基的空白對照組。鋪板后24 h CCK8法測定每孔OD值，吸出全培，加入100 μL由全培及CCK8試劑按9：1的比例配好的混合液，37 ℃孵育2～4 h。酶標儀檢測每孔450 nm處的OD值，將空白對照組為基準進行調(diào)零，得出顯示細胞增殖能力的OD值，每組取5個復孔的均值，間隔24 h進行下一輪檢測，連測7 d，繪制細胞增殖曲線。

1.3.6 Transwell實驗檢測HDJ2干擾和過表達轉(zhuǎn)染后U251和U261細胞的侵襲能力 選取生長狀態(tài)良好的膠質(zhì)瘤細胞株U251及U261鋪板，分別給予siRNA或HDJ2過表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染。24 h后，PBS洗滌2次，消化，離心，去除細胞培養(yǎng)基，加入空培，重懸，計數(shù)后調(diào)整細胞密度，于每個預(yù)先用基質(zhì)Matrigel膠預(yù)處理好的8 μm 孔徑聚碳酸脂微孔濾膜的Transwell小室內(nèi)加入200 μL細胞懸液，內(nèi)含2×105個細胞。下室內(nèi)加入600～800 μL全培，37 ℃孵育24 h，取出Transwell小室，用棉花清理上室內(nèi)基質(zhì)膠及細胞，甲醇孵育固定30 min，蘇木素染色30 min后于顯微鏡(目鏡10倍，物鏡20倍)下觀察穿膜細胞，隨機取上、下、左、右、中心5個視野拍攝照片。計算5個視野中細胞數(shù)目的均值，代表成功侵襲的細胞數(shù)目。

1.3.7 流式細胞儀檢測U251和U261轉(zhuǎn)染后的凋亡情況 選取生長狀態(tài)良好的膠質(zhì)瘤細胞株U251及U261鋪板，分別給予siRNA或HDJ2過表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染，并給予1.0 μmol/L阿霉素進行凋亡誘導。24 h后，PBS洗滌2次，用不含EDTA的胰酶消化，離心，重懸，計數(shù)。收集105～106個細胞。PBS洗滌細胞2次，每次2 000 rpm離心5 min，去除PBS，濾紙上瀝干。加入500 μL Binding-buffer懸浮細胞，加入5 μL Annexin V，充分吹打混勻后，再加入5μL Propidium Iodide吹打混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min后于1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0的統(tǒng)計軟件包處理，兩組均數(shù)間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，取α=0.05為檢驗標準。

2 結(jié)果

2.1 U251和U261細胞HDJ2干擾效率 在U251及U261細胞株中分別用HDJ2不同干擾片段siRNA-1/-2/-3瞬時轉(zhuǎn)染后檢測HDJ2 mRNA水平。在U251細胞株中，與對照組NC相比，HDJ2 siRNA-1/-2/-3干擾效率分別為0.82、0.45、0.23，siRNA-2及siRNA-3為有效干擾片段(F=159.52，P<0.001)，其中siRNA-3組HDJ2 mRNA水平下降最顯著(見圖1A)。在U261細胞株中，結(jié)果顯示，siRNA-2及siRNA-3為有效干擾片段，(F=51.23，P<0.001)，3個干擾片段干擾效率分別為0.35、0.29、0.18(見圖1B)。綜合2個細胞株實驗結(jié)果，挑選在U251及U261細胞株中mRNA干擾效率均最為穩(wěn)定且效率最高的HDJ2 siRNA-3進行后續(xù)實驗。

***：與對照組比較，P<0.001。 圖1 3個HDJ2-siRNA在U251(A)和U261(B)細胞株中的干擾效率

2.2 U251和U261細胞HDJ2過表達效率 分別在U251、U261中給予HDJ2過表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染后，用熒光定量-PCR檢測HDJ2過表達效率。結(jié)果顯示，瞬時轉(zhuǎn)染48 h后，在U251及U261中，與對照組MOCK相比，過表達HDJ2后mRNA水平(見圖2)均明顯提高(t=-5.63，P=0.03；t=-16.18，P=0.004)，表明過表達成功，HDJ2過表達質(zhì)?？捎糜诤罄m(xù)實驗。

**：與對照組比較，P<0.01。圖2 U251和U261細胞HDJ2過表達效率

2.3 HDJ2干擾和過表達后U251和U261細胞的增殖能力 在U251及U261細胞株中分別瞬時轉(zhuǎn)染HDJ2 siRNA或過表達質(zhì)粒后，CCK8法檢測細胞增殖能力并繪制生長曲線，結(jié)果顯示，干擾HDJ2后2株膠質(zhì)瘤細胞增殖能力沒有顯著變化(F=0.433，P=0.517；F=4.052，P=0.735)；而在過表達HDJ2后，2株膠質(zhì)瘤細胞增殖能力與MOCK組相比，差異無統(tǒng)計學意義(F=0.117，P=0.735；F=1.647，P=0.212)。綜合干擾及過表達HDJ2后膠質(zhì)瘤細胞增殖能力結(jié)果分析，HDJ2對膠質(zhì)瘤細胞體外增殖能力沒有顯著影響(見圖3)。

A、B：HDJ2干擾；C、D：HDJ2過表達；A、C：U251細胞；B、D：U261細胞。圖3 HDJ2干擾和過表達對U251和U261細胞增殖的作用

2.4 HDJ2干擾或過表達后對U251和U261細胞侵襲能力的影響 在U251及U261中分別瞬時轉(zhuǎn)染siRNA或過表達質(zhì)粒后，Boyden Transwell小室檢測細胞體外侵襲能力的變化。結(jié)果顯示，在干擾HDJ2后，與NC組相比，HDJ2 si-RNA組U251及U261細胞穿膜數(shù)目均顯著降低(t=7.126，P=0.02；t=8.792，P=0.001)。而與MOCK組相比，過表達HDJ2后U251及U261細胞的穿膜數(shù)目顯著上調(diào)(t=-7.164，P=0.002；t=-5.653，P<0.005；見圖4)。

**：與對照組比較，P<0.01。圖4 HDJ2干擾和過表達對U251和U261細胞侵襲能力的影響(×200)

2.5 HDJ2干擾或過表達后對U251和U261細胞凋亡的影響 分別在U251、U261中給予干擾片段HDJ2 siRNA或過表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染處理，并給予1.0 μmol/L阿霉素進行凋亡誘導，24 h后流式細胞儀檢測膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。結(jié)果顯示，在U251及U261細胞株中干擾HDJ2后，細胞凋亡率升高(t=-3.392，P=0.027；t=-10.702，P=0.001)，而過表達HDJ2后則結(jié)果相反(t=10.952，P=0.001；t=9.445，P=0.001；見圖5)。

**：與對照組比較，P<0.01;***：與對照組比較，P<0.001。圖5 HDJ2干擾或過表達后對U251和U261細胞侵襲能力的影響

3 討論

在本文中，為了探討HDJ2對U251及U261細胞生物學行為的影響，我們首先構(gòu)建并篩選出了針對HDJ2的特異性siRNA及過表達質(zhì)粒。體外實驗顯示HDJ2可促進U251、U261的侵襲，同時可以抵抗阿霉素對U251、U261的凋亡誘導作用；但對它們的增殖能力沒有影響。

HDJ2作為HSP40家族成員之一，首先是作為HSP70的分子伴侶被發(fā)現(xiàn)的。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，HSP40家族成員的特征性結(jié)構(gòu)域J-domain可與HSP70結(jié)合，這種結(jié)合可以激活其自身的ATP酶活性，ATP酶活性增強后促進ATP水解，生成的ADP可以穩(wěn)定HSP70與其底物結(jié)合的穩(wěn)定性，從而保持HSP70的活性。因此，HSP40與HSP70處于一種相輔相成的協(xié)同狀態(tài)[9-10]。有文獻報道稱HSP70可以增強WASF3的活性進而促進前列腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移[13]。而HSP40另一家族成員HLJ1(DNAJB4)可以通過影響E-cadherin的表達進而調(diào)控肺癌細胞株CL1-0,CL1-1,CL1-5及CL1-5-F4的侵襲能力[14]。因此，我們推測HDJ2可能通過提高HSP70與其底物WASF3結(jié)合的穩(wěn)定性進而起到促進U251、U261的侵襲能力，也可能通過影響EMT的發(fā)生而促進膠質(zhì)瘤的侵襲。

在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，HDJ2被認為對腫瘤的放療抵抗性起著一定的作用，在膠質(zhì)瘤細胞中抑制HDJ2的表達，細胞的放療敏感性大大增強，而過表達HDJ2則顯著降低了膠質(zhì)瘤的放療敏感性，表現(xiàn)出放療抵抗[15]。該研究指出，射線照射膠質(zhì)瘤細胞后可以促進HDJ2從細胞漿轉(zhuǎn)移到細胞核及線粒體等有膜的細胞器中,也有文獻報道，HDJ2可以將某些蛋白質(zhì)從胞漿運輸?shù)骄€粒體，從而增強胰腺癌細胞的凋亡抵抗能力。而眾所周知的是，大部分細胞凋亡通常都是通過線粒體途徑完成的[16-17]。我們在膠質(zhì)瘤細胞株U251及U261中干擾HDJ2后，細胞凋亡率顯著上升，和上述結(jié)果吻合，從而比較明確地揭示了HDJ2在膠質(zhì)瘤中的凋亡抵抗作用的功能。

本研究利用膠質(zhì)瘤細胞株U251及U261，說明HDJ2在膠質(zhì)瘤中扮演著凋亡抵抗及促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的角色，提示其可能是促癌基因，為膠質(zhì)瘤的治療提供可能的靶點，而具體的作用機制還有待于進一步的探討。

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[收稿2017-03-12;修回2017-04-27]

(編輯：王靜)

HDJ2 promotes the progression of glioma cell lines in vitro

GengFei1，SunTao1，LuGuifeng2

(1.Department of Physiology,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;2.Department of Pathophysiology,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To investigate the effects of HDJ2 on the biological behavior of glioma cell line U251 and U261 in vitro.Methods Fluorescence quantitative PCR was used to verify the interference or over-express efficiency after transfection of siRNA or HDJ2 over-expression plasmid.A Boyden chamber assay aimed to detect the cell migration abilities of glioma cells was used.CCK-8 assay and apoptosis assay were used to detect the cell proliferation abilities and apoptosis.Results Results showed that transfection of HDJ2 siRNA in U251 and U261 cells effectively attenuated their migration abilities and triggered apoptosis,while over expression of HDJ2 led to the opposite results.Moreover,HDJ2 siRNA or over-expression of HDJ2 had no significant effects on U251 and U261 cell proliferation when compared to control groups.Conclusion These results provide evidence that HDJ2 promotes migration and inhibits apoptosis in glioma cell lines in vitro,thus playing a tumor-promotive role in vitro.

HDJ2;glioma;invasion;apoptosis

R739.41

A

1000-2715(2017)03-0243-06