周 林，邱 敏，徐亞沙，魯艷柳，陸遠富

(遵義醫(yī)學院 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學研究

Caco-2細胞模型研究淫羊藿苷的吸收轉(zhuǎn)運

周 林，邱 敏，徐亞沙，魯艷柳，陸遠富

(遵義醫(yī)學院 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099)

目的 采用Caco-2細胞模型，研究淫羊藿苷(ICA)吸收轉(zhuǎn)運特性。方法 成功制備Caco-2細胞模型后，分為空白組、ICA組、氫離子組、無鈉離子組、ATP抑制劑組，給予ICA(10 μmol/L)3 h后，采用UPLC-MS分析，比較刷狀緣側(cè)、基底側(cè)及細胞樣本中ICA及淫羊藿次苷II(ICS II)的含量，觀察不同條件對ICA、ICS II吸收的影響。結(jié)果 與ICA組相比，氫離子組、無鈉離子組及ATP抑制劑組刷狀緣側(cè)ICA含量顯著降低(P<0.05)，基底側(cè)ICA含量顯著升高(P<0.05)，而細胞中僅無鈉離子組ICA含量顯著增高(P<0.05)；與ICA組相比，無鈉離子組刷狀緣側(cè)、基底側(cè)、細胞中ICS II含量均無顯著變化，氫離子組基底側(cè)、細胞中ICS II含量顯著升高(P<0.05)，ATP抑制劑組刷狀緣側(cè)、基底側(cè)ICS II含量顯著增高(P<0.05)。結(jié)論 氫離子、鈉離子以及ATP對ICA及ICS II的吸收轉(zhuǎn)運有顯著影響。

淫羊藿苷；淫羊藿次苷 II；Caco-2細胞模型；氫離子；鈉離子；ATP

中藥淫羊藿是小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim.)等的干燥地上部分，最早記錄在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，具有“補腎壯陽，祛風除濕”之效，臨床常用于治療陽痿、腰膝酸軟、風濕痹痛等癥。黃酮醇苷類化合物淫羊藿苷(icariin，ICA)是淫羊藿的主要活性成分之一[1]，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、調(diào)節(jié)免疫，改善心腦血管功能等多種藥理作用[2-8]，但是其口服生物利用度低(12%)[9]，研究其吸收轉(zhuǎn)運機制，有利于淫羊藿的進一步開發(fā)和利用。研究表明，ICA在腸道刷狀緣側(cè)可被代謝酶代謝成淫羊藿次苷Ⅱ(icarisideⅡ，ICS II)[8]，ICS II亦可作為有效成分發(fā)揮藥效[10]。因此，在研究ICA吸收轉(zhuǎn)運時，ICS II的吸收轉(zhuǎn)運情況也應(yīng)受到重視。Caco-2單層細胞模型的結(jié)構(gòu)和功能類似完全分化的小腸上皮細胞，具有微絨毛等結(jié)構(gòu)，并且含有與小腸刷狀緣上皮細胞相關(guān)的酶系，能很好地模擬藥物在腸道的吸收[11-12]。因此，本研究采用Caco-2細胞模型，通過改變給藥側(cè)的氫離子濃度、鈉離子濃度和抑制細胞內(nèi)ATP的生成來考察ICA的吸收轉(zhuǎn)運特性，為提高ICA口服生物利用度提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 淫羊藿苷標準品，中國藥品生物制品檢定所，批號：110737-200415；淫羊藿次苷標準品，中國食品藥品檢定研究院，批號：X45Q-NY8F；大豆苷元，南京標科生物科技有限公司；淫羊藿苷，南京標科生物科技有限公司，批號：111852-201102；色譜純乙腈、甲醇，美國Dikmapure公司；Caco-2細胞，中國昆明細胞庫提供；DMEM培養(yǎng)基，美國HyClone公司；胎牛血清，美國Gibco有限公司；青霉素/鏈霉素，中國索萊寶科技有限公司；D-hanks緩沖液，中國索萊寶科技有限公司。

Q-Exactive四極桿-軌道阱質(zhì)譜色譜聯(lián)用儀，美國Thermo科技有限公司；Millicell-ERS細胞電阻儀，北京明陽科華生物科技有限公司；24孔transwell細胞培養(yǎng)板，康寧生命科學產(chǎn)品有限公司；細胞計數(shù)儀，艾力特國際貿(mào)易有限公司；CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Caco-2細胞模型的制備 將Caco-2細胞濃度調(diào)整到8×104個/cm2，接種于24孔Transwell小室，置37 ℃培養(yǎng)箱中，21 d左右分化形成。當電阻值大于500 Ω·cm2、表觀滲透率低于1×10-6cm/s時，表明細胞單層具有緊密性和完整性，可作為小腸吸收實驗的體外模型[9-10]。實驗前，棄去培養(yǎng)液，分別向刷狀緣側(cè)(apical side，AP)和基底側(cè)(basolateral side，BL)加入37 ℃的D-hanks緩沖液漂洗細胞3次，最后一次置于37 ℃恒溫水浴箱中孵育30 min后，棄去緩沖液，以保細胞表面無干擾物質(zhì)。

1.2.2 ICA及ICS II吸收轉(zhuǎn)運實驗 考察pH的影響：將實驗組分為空白組、ICA組和氫離子組(pH 5.5)。在刷狀緣側(cè)，氫離子組給予ICA濃度為10 μmol/L的Mes-D-hanks液(pH 5.5)100 μL，ICA組給予含相同濃度ICA的Hanks-Hepes液100 μL；在基底側(cè)，均換上600 μL Hanks-Hepes液。37 ℃孵育3 h后，分別收集刷狀緣側(cè)、基底側(cè)緩沖液及細胞樣本，供檢測。

考察鈉離子影響：將實驗組分為空白組、ICA組和無鈉離子組。在刷狀緣側(cè)，ICA組給予100 μL ICA濃度為10 μmol/L的含鈉離子試液(10 mmol/L HEPES、130 mmol/L NaCl、10 mmol/L KCl、1 mmol/L MgSO4、5 mmol/L葡萄糖、1 mmol/L CaCl2)，無鈉離子組給予100 μL ICA濃度為10 μmol/L的無鈉離子試液(10 mmol/L HEPES、130 mmol/L (CH3)3N(Cl)CH2CH2OH、10 mmol/L KCl、1 mmol/L MgSO4、5 mmol/L葡萄糖、1 mmol/L CaCl2)；在基底側(cè)，均加入600 μL含鈉離子試液。37 ℃孵育3 h后，分別收集刷狀緣側(cè)、基底側(cè)緩沖液及細胞樣本，供檢測。

考察ATP影響，將實驗組分為空白組、ICA組和ATP抑制劑組。ATP抑制劑組在刷狀緣側(cè)，先加入90 μL ATP抑制劑(5 mmol/L疊氮化鈉、50 mmol/L脫氧葡萄糖)，孵育10 min，再加入10 μL含100 μmol/L ICA的D-hanks液；ICA組在刷狀緣側(cè)，先加入90 μL D-hanks液孵育10 min，再加入10 μL含100 μmol/L ICA的D-hanks液；在基底側(cè)，均加入600 μL D-hanks液。37 ℃孵育3 h后，分別收集刷狀緣側(cè)、基底側(cè)緩沖液及細胞樣本，供檢測。

1.2.3 檢測ICA及ICS II的色譜條件及質(zhì)譜條件 色譜條件：采用Hypersil GOLD C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.9 μm)分離，流動相組成為乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫(V/V，0～1 min 5%～50% A，1～6 min 50%～95% A，6～8 min 95% A)，流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量為5 μL。質(zhì)譜條件：ESI離子源，m/z檢測范圍100～1 500，鞘氣和輔助氣流速分別為50、13 arb，霧化溫度425 ℃，毛細管溫度350 ℃，負離子全掃描檢測模式。

1.2.4 對照品溶液的配制 精確稱取ICA、ICS II標準品1.0 mg，分別置于1 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成1.5 mmol/L的ICA和2.0 mmol/L的ICS II標準品儲備液，待用。

精確稱取大豆苷元標準品1.0 mg，置于1 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為4.0 mmol/L的大豆苷元內(nèi)標化合物標準品儲備液，待用。

1.2.5 樣本處理 用120 μL 0.01% Triton靜置處理加藥后的細胞樣本(約5×107個/孔)15 min，取出全部樣液超聲(功率：320 W)30 min，混勻后取100 μL加入5 μL內(nèi)標溶液，300 μL甲醇，渦旋，15 000g離心10 min，取上清供UPLC-MS檢測。

吸取100 μL AP側(cè)、BL側(cè)緩沖液，分別加入5 μL內(nèi)標溶液，300 μL甲醇，渦旋，15 000 g離心10 min，取上清供UPLC-MS檢測。

2 結(jié)果

2.1 ICA、ICS II檢測方法的建立 采用UPLC-MS建立樣品分析方法，如圖1所示，在0.062 5～4.0 μmol/L濃度范圍內(nèi)，ICA及ICS II線性方程分別為：Y=2 441 774.22X+80 703.68(r=0.999 8)；Y=691 465 897.28X+90 521 629.50(r=0.999 5)，24 h內(nèi)樣品均穩(wěn)定，其RSD分別為6.1%和5.7%，重現(xiàn)性良好，RSD分別為5.9%和3.2%，平均加樣回收率分別為96.6%和102.1%，RSD分別為9.1%和3.6%，ICA日間、日內(nèi)精密度RSD分別為5.6%和6.1%，ICS II日間、日內(nèi)精密度RSD分別為5.8%和3.9%，即本方法可快速、靈敏、準確的檢測ICA及ICS II的濃度。

A：空白組；B：標準品溶液；C：ICA組；1：ICA，2：大豆苷元，3：ICS II。圖1 ICA及ICS II的選擇離子圖

2.2 pH對ICA、ICS II吸收轉(zhuǎn)運的影響 如圖2所示，與ICA組相比，AP側(cè)氫離子組ICA的濃度明顯降低(P<0.05)，BL側(cè)ICA含量明顯升高(P<0.05)，而在細胞中變化不明顯(P>0.05)；在細胞中，氫離子組ICS II濃度較ICA組高1.82倍，在BL側(cè)，較ICA組高4.8倍。

Control：ICA組，正常條件下給藥；H+(pH5.5)：氫離子組，在pH=5.5條件下給藥。n=4；*：與ICA組相比，P<0.05。圖2 pH對ICA和ICS II吸收轉(zhuǎn)運的影響

2.3 鈉離子對ICA、ICS II吸收轉(zhuǎn)運的影響 如圖3所示，與ICA組相比，無鈉離子組AP側(cè)ICS的濃度明顯降低(P<0.05)，而在BL側(cè)和細胞中，ICA含量明顯升高(P<0.05)；鈉離子濃度變化對ICS II吸收無明顯影響(P>0.05)。

Control：ICA組，正常條件下給藥；None Na+：無鈉離子組，無鈉離子條件下給藥。n=4，*：與ICA組相比，P<0.05。圖3 鈉離子對ICA和ICS II吸收轉(zhuǎn)運的影響

2.4 ATP 對ICA、ICS II吸收轉(zhuǎn)運的影響 如圖4所示，在AP側(cè)，ATP抑制劑組ICA含量較ICA組低(P<0.05)，而ICS II含量較ICA組高(P<0.05)；在BL側(cè)，ATP抑制劑組ICA、ICS II含量明顯高于ICA組(P<0.05)，在細胞中兩組無明顯差異(P>0.05)。

Control：ICA組，正常條件下給藥；ATP inhibitor：ATP抑制劑組，ATP缺乏的條件下給藥。n=4，*：與ICA組相比，P<0.05。圖4 ATP對ICA及ICS II吸收轉(zhuǎn)運的影響

3 討論

小腸是口服藥物吸收的主要部位，分布在腸道的轉(zhuǎn)運蛋白包括ATP結(jié)合盒式膜轉(zhuǎn)運體家族和溶質(zhì)轉(zhuǎn)運體超家族[13]。ATP結(jié)合盒式膜轉(zhuǎn)運體家族，須利用ATP的能量來實現(xiàn)對相關(guān)藥物的轉(zhuǎn)運[13-14]，而溶質(zhì)轉(zhuǎn)運超家族需借助氫、鈉及鈣等離子在胞內(nèi)、外形成電位差，才能完成對相關(guān)藥物的轉(zhuǎn)運[15-16]。ICA、ICS II在腸道的吸收需要轉(zhuǎn)運蛋白的參與[9,14]。因此，細胞外環(huán)境pH、鈉離子濃度以及細胞中產(chǎn)生的ATP會對ICA、ICS II的吸收轉(zhuǎn)運起到重要影響。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過增加刷狀緣側(cè)氫離子的濃度，基底側(cè)ICA、ICS II含量顯著升高(P<0.05)，提示氫離子依賴型轉(zhuǎn)運蛋白可能參與了ICA及ICS II的吸收轉(zhuǎn)運，腸道pH偏堿性不利于ICA、ICS II的吸收，可能是ICA口服生物利用度低的一個原因；減少刷狀緣側(cè)鈉離子的濃度，基底側(cè)ICA含量顯著升高(P<0.05)，而對ICS II的含量無明顯影響，提示鈉離子依賴型轉(zhuǎn)運蛋白可能參與了ICA的外排轉(zhuǎn)運；通過抑制細胞內(nèi)ATP的生成，基底側(cè)ICA含量顯著升高(P<0.05)，同時刷狀緣側(cè)和基底側(cè)的ICS II含量顯著增高(P<0.05)，提示ICA的主動轉(zhuǎn)運吸收過程中外排轉(zhuǎn)運可能占主要地位，這也可能是其口服生物利用度低的另一個原因。

通過Caco-2細胞模型，發(fā)現(xiàn)氫離子、鈉離子以及細胞內(nèi)產(chǎn)生的ATP對ICA及ICS II的吸收轉(zhuǎn)運有顯著影響，為進一步研究改善ICA口服生物利用度提供理論依據(jù)。

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[收稿2017-02-09;修回2017-05-14]

(編輯：王靜)

Absorption and transportation of icariin across Caco-2 cell model

ZhouLin,QiuMin,XuYasha,LuYanliu,LuYuanfu

(Key Lab for Basic Pharmacology of Ministry of Education and The Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To study the absorption and transportation of icariin (ICA) using Caco-2 cell model.Methods The experiments included the control group,the ICA group,the hydrogen ions group,the sodium ion free group and the ATP inhibitor group.ICA(10 μmol/l)was administrated for 3 h.The concentrations of ICA and icariside II(ICS II)in the apical side(AP),the basolateral side(BL)and the cell were measured by UPLC/MS.The effects of hydrogen ion,sodium ion,and ATP on the absorption and transportation were observed.Results Compared with ICA group,the contents of ICA were reduced in AP and increased in BL of the hydrogen ions group,the sodium ion free group,and the ATP inhibitor group(P<0.05),and only increased in cells of the sodium ion free group (P<0.05).And there were no significant differences on the contents of ICS II in AP,BL,and cells of the sodium ion free group.For the hydrogen ions group,the contents of ICS II were increased in BL and cells (P<0.05).For the ATP inhibitor group,the contents of ICS II were increased in AP and BL(P<0.05).Conclusion Hydrogen ion,sodium ion and ATP significantly affect the absorption and transportation of ICA and ICS II.

icariin;icariside II;Caco-2 cell model;hydrogen ion;sodium ion;ATP

國家自然科學基金資助項目(NO：81460632)。

魯艷柳，女，博士，副教授，研究方向：藥物代謝動力學與毒理學研究，E-mail:lyl206979@sina.com；陸遠富，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物代謝動力學與毒理學，E-mail: yflu@zmc.edu.cn。

R969

A

1000-2715(2017)03-0234-04