邊 可，雷 微，熊 琦，徐小容，陳 華，吳 璇，陳永艷

(1.杭州市第三人民醫(yī)院 皮膚科，浙江 杭州 310009；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 皮膚科，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)2012級臨床醫(yī)學(xué)系，廣東 珠海 519041)

?

臨床醫(yī)學(xué)研究

轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA-3在早期潛伏梅毒患者外周血單個核細胞中的表達

邊 可1，雷 微2，熊 琦2，徐小容2，陳 華2，吳 璇3，陳永艷2

(1.杭州市第三人民醫(yī)院 皮膚科，浙江 杭州 310009；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 皮膚科，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)2012級臨床醫(yī)學(xué)系，廣東 珠海 519041)

目的 探討轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA-3在早期潛伏梅毒免疫發(fā)病機制中的作用。方法 應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測20例早期潛伏梅毒患者、20例早期顯性梅毒患者和25例正常對照者外周血單個核細胞中T-bet和GATA-3 mRNA的相對表達量。結(jié)果 ①潛伏梅毒組T-bet mRNA相對表達量顯著低于正常對照組、顯性梅毒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，顯性梅毒組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；②潛伏梅毒組、顯性梅毒組、正常對照組之間GATA-3 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。③潛伏梅毒組T-bet/GATA-3比值顯著低于正常對照組、顯性梅毒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，顯性梅毒組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；④T-bet、GATA-3 mRNA相對表達量與血清RPR滴度之間無相關(guān)性(rs=0.19,rs=0.10,P均>0.05)。結(jié)論 T-bet/GATA-3表達失衡可能在早期潛伏梅毒免疫發(fā)病機制中具有重要作用，主要與轉(zhuǎn)錄因子T-bet低表達有關(guān)。

潛伏梅毒；外周血單個核細胞；T-bet；GATA-3

近年來，我國梅毒報告發(fā)病率呈快速增長趨勢，且以潛伏梅毒增幅最大[1]，已成為臨床醫(yī)務(wù)人員在工作中不容忽視的問題。梅毒的發(fā)病涉及復(fù)雜的免疫學(xué)變化，至今尚未完全闡明。已有的研究表明Th1/Th2細胞在梅毒免疫過程中發(fā)揮重要作用，而Th1/Th2細胞的分化及免疫應(yīng)答功能與其表達的特異性轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)。關(guān)于Th1/Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA-3在早期潛伏梅毒免疫發(fā)病機制中的作用，目前國內(nèi)外鮮見報道。本研究采用實時熒光定量PCR檢測早期潛伏梅毒患者外周血單個核細胞中Th1/Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3 mRNA的相對表達量，在轉(zhuǎn)錄因子水平探討其在早期潛伏梅毒免疫發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2015年3月至12月在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚性病門診經(jīng)梅毒血清學(xué)檢測確診的梅毒患者。潛伏梅毒組20例，男10例，女10例，年齡20～52歲，平均(34.00±11.35)歲，RPR滴度1：1～1：16，未接受過驅(qū)梅治療，病程均在2年以內(nèi)，并經(jīng)腦脊液血清學(xué)檢查排除神經(jīng)梅毒。顯性梅毒組20例，男11例，女9例，年齡16～45歲，平均(31.70±8.67)歲，RPR滴度1：4～1：128，病程均在2年以內(nèi)。正常對照組為健康獻血者共25例，男11例，女14例，年齡20～53歲，平均(30.12±8.15)歲，血清RPR及TPPA試驗均為陰性。排除標準：近期有不潔性行為者、患有其他性傳播疾病、自身免疫性疾病、合并其他感染性疾病及惡性腫瘤等。

1.2 主要實驗儀器和試劑 CFX96TM熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)、人外周血淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)、TRIzol? Reagent(美國Invitrogen公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)、紫外/可見光分光光度計(德國Eppendorf公司)、水平電泳儀(美國BIO-RAD公司)。

1.3 實驗方法 用EDTA抗凝管采集外周靜脈血5 mL，用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞。Trizol法提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度計測得RNA樣品的濃度及純度。按試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此模板進行Real-time PCR擴增。Real-time PCR特異性引物均由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計并合成。T-bet：上游：5'-TGGTCCAAGTTTAATCAGCACCAG-3'，下游：5'-CCCGGCCACAGTAAATGACAG-3'；GATA-3：上游：5'-CCTCATTAAGCCCAAGCGAAG-3'，下游：5'-TCCAGAGTGTGGTTGTGGTG-3'。β-actin：上游：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游：5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)用系統(tǒng)軟件繪制擴增曲線、熔解曲線，采用2-△△Ct法計算相對表達量，△Ct=Ct目的基因-Ct管家基因。

2 結(jié)果

2.1 T-bet和GATA-3 mRNA的表達水平(見表1，圖1～9) 經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)：①潛伏梅毒組、顯性梅毒組、正常對照組之間T-bet mRNA相對表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.61,P<0.05)；進一步兩兩比較，潛伏梅毒組T-bet mRNA表達水平顯著低于正常對照組、顯性梅毒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均≤0.05)，顯性梅毒組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；②潛伏梅毒組、顯性梅毒組、正常對照組之間GATA-3 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.08,P>0.05)；③潛伏梅毒組、顯性梅毒組、正常對照組之間T-bet/GATA-3比值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.29,P≤0.05)；進一步兩兩比較，潛伏梅毒組T-bet/GATA-3比值顯著低于正常對照組、顯性梅毒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，顯性梅毒組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

組別例數(shù)T-betGATA-3T-bet/GATA-3正常對照251.03±0.341.06±0.401.02±0.26顯性梅毒200.96±0.320.95±0.411.08±0.31潛伏梅毒200.73±0.22▲#0.90±0.260.84±0.23▲#F5.611.084.29P0.000.350.02

▲與正常對照組比較P<0.05;#與顯性梅毒組比較P<0.05。

2.2 T-bet和GATA-3 mRNA表達水平與血清RPR滴度之間的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman相關(guān)分析，T-bet 和GATA-3 mRNA表達水平與血清RPR滴度之間不存在相關(guān)性(rs=0.19,P>0.05;rs=0.10,P>0.05)。

3 討論

梅毒是一種嚴重威脅全球公共健康的性傳播疾病，梅毒的盛行使成人發(fā)病率和新生兒死亡率升高[2]，并可導(dǎo)致嚴重的并發(fā)癥。T細胞免疫是機體清除梅毒螺旋體(Treponema Pallidum,TP)的主要方式，已有的研究表明梅毒患者體內(nèi)Th1/Th2平衡失調(diào)是造成其病程遷延同時也是潛伏梅毒和血清固定形成的重要原因。Th1/Th2極化受諸多因素的影響，目前已有的研究主要通過檢測血清中細胞因子的種類和濃度來判斷梅毒患者的免疫狀態(tài)[3-4]。學(xué)者們希望可以從Th1/Th2細胞分化的上游進行控制干預(yù)，以尋找影響Th1/Th2極化失衡的原因。

轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3分別作為Th1/Th2細胞分化過程中作用相反的兩個關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子[5-6]，因其能夠相互調(diào)節(jié)二者分化并參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展而廣泛受到關(guān)注，而有關(guān)T-bet、GATA-3與早期潛伏梅毒發(fā)病之間的關(guān)系尚未見報道。轉(zhuǎn)錄因子T-bet選擇性地表達于Th1細胞，通過激活Th1特征性細胞因子IFN-γ基因控制其表達，并與之形成正反饋調(diào)節(jié)機制從而促進初始Th細胞向Th1細胞分化；此外，T-bet還可在Th1細胞分化過程中抑制GATA-3的表達，從而阻止Th細胞向Th2細胞分化。轉(zhuǎn)錄因子GATA-3能調(diào)控Th2細胞分化及Th2型細胞因子IL-4等的產(chǎn)生，IL-4又能夠直接激活STAT6并活化GATA-3，當(dāng)GATA-3的表達量達到一定水平后與IL-4形成一個不依賴于STAT6的正反饋環(huán)路，進一步上調(diào)自身的表達來維持Th2細胞分化[7]。此外還可通過抑制IFN-γ的表達使Th1細胞分化受抑制，并促進Th2細胞的發(fā)展。因此，筆者推測T-bet和GATA-3的表達失衡可能在潛伏梅毒發(fā)病中起重要作用。本實驗結(jié)果顯示，潛伏梅毒組T-bet mRNA相對表達量顯著低于正常對照組和顯性梅毒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，顯性梅毒組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；潛伏梅毒組、顯性梅毒組、正常對照組之間GATA-3 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。筆者初步推斷，潛伏梅毒患者外周血中的T-bet mRNA表達降低，使其對Th1的極化作用降低，導(dǎo)致IFN-γ、IL-2等Th1型細胞因子分泌減少，并削弱了T細胞的功能，降低了機體對TP的清除能力；另一方面促進了Th2細胞亞群的分化，導(dǎo)致IFN-γ的表達受抑制從而抑制了Th1細胞的分化，使TP能夠逃避機體的免疫監(jiān)視，在無臨床癥狀或臨床癥狀已消失的情況下TP仍能在梅毒患者體內(nèi)長期潛伏，使機體進入無癥狀的潛伏階段。

現(xiàn)有研究認為T-bet/GATA-3的比值較單一檢測T-bet或GATA-3的水平能夠更加客觀地反映出Th1/Th2分化情況[8]，可作為衡量Th1/Th2平衡的新指標。本研究發(fā)現(xiàn)：潛伏梅毒組T-bet/GATA-3比值顯著低于正常對照組和顯性梅毒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，顯性梅毒組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)以往文獻資料及以上研究結(jié)果提示，潛伏梅毒患者外周血存在Th1/Th2失衡，不僅體現(xiàn)在細胞水平、細胞因子水平，還表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄因子水平。隨著病程進入梅毒的無癥狀潛伏階段，T-bet/GATA-3出現(xiàn)平衡失調(diào)，且主要與T-bet mRNA的相對表達量降低有關(guān)，而GATA-3的作用相對較弱，這可能在Th1/Th2極化失衡中起到重要作用，從而抑制機體對TP的免疫應(yīng)答，不能有效清除TP。實驗結(jié)果還表明T-bet和GATA-3 mRNA表達水平與血清RPR滴度之間不存在相關(guān)性。

總之，早期潛伏梅毒患者存在T-bet/GATA-3表達失衡并且可能在梅毒免疫發(fā)病機制中起重要作用。二者還與其他轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控著復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)，通過動態(tài)調(diào)節(jié)決定T細胞最終分化方向[9]。由于轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子眾多且相互影響，至于T-bet、GATA-3如何與其他轉(zhuǎn)錄因子一起在潛伏梅毒患者體內(nèi)動態(tài)調(diào)節(jié)T細胞的分化還有待進一步研究。

[1] 龔向東,岳曉麗,滕菲,等.2000～2013年中國梅毒流行特征與趨勢分析[J].中華皮膚科雜志,2014,47(5):310-315.

[2] Tipple C,Taylor G P.Syphilis testing,typing,and treatment follow-up:a new era for an old disease[J].Curr Opin Infect Dis,2015,28(1):53-60.

[3] 傅琳玲,丁琦,方晶,等.不同感染狀態(tài)下梅毒患者血清白介素2、10和12檢測結(jié)果分析[J].臨床皮膚科雜志,2012,41(6):351-353.

[4] 劉敏,王郡甫,郝明巨.梅毒患者外周血Th1/Th2類細胞因子mRNA表達及臨床意義[J].中國麻風(fēng)皮膚病雜志,2010,26(7):530-531.

[5] Jayaraman S.T-bet in the spot light:roles in distinct T-cell fate determination[J].Cell Mol Immunol,2013,10(4):289-291.

[6] Tindemans I,Serafini N,Di Santo J P.GATA-3 function in innate and adaptive immunity[J].Immunity,2014,41(2):191-206.

[7] Ouyang W,L?hning M,Gao Z,et al.Stat6-independent GATA-3 autoactivation directs IL-4-independent Th2 development and commitment[J].Immunity,2000,12(1):27-37.

[8] Yao R,Lin Y,Li Q,et al.Down regulation of T-bet/GATA-3 ratio induced by IL-11 treatment is responsible for Th1/Th2 balance restoration in human immune thrombocytopenic purpura(ITP)[J].J Thromb Thrombolysis,2014,38(2):183-189.

[9] Yu F,Sharma S,Edwards J,et al.Dynamic expression of transcription factors T-bet and GATA-3 by regulatory T cells maintains immunotolerance[J].Nat Immunol,2015,16(2):197-206.

[收稿2017-03-23;修回2017-04-20]

(編輯：王福軍)

Research on the expression of transcription factors T-bet/GATA-3 in peripheral blood mononuclear cells from patients with early latent syphilis

BianKe1,LeiWei2,Xiongqi2,XuXiaorong2,ChenHua2,WuXuan3,ChenYongyan2

(1.Department of Dermatology,The Third People’s Hospital of Hangzhou,Hangzhou Zhejiang 310009,China;2.Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;3.Department of 2012 Chinical Medical,Zhuhai Campus of Zunyi Medical University,Zhuhai Guangdong 519041,China )

Objective To investigate the role of transcription factors T-bet/GATA-3 in the immunological pathogenesis of patients with early latent syphilis.Methods The expression levels of T-bet mRNA and GATA-3 mRNA was determined by real-time quantitative polymerase chain reaction in the peripheral blood from 20 early latent syphilis patients,20 early symptomatic syphilis patients and 25 healthy controls.Results 1)The expression level of T-bet mRNA in latent syphilis group was significantly lower than that in symptomatic syphilis group and control group(P<0.05),and there was no difference between symptomatic syphilis group and control group(P>0.05).2)No difference of the expression level of GATA-3 mRNA was found among latent syphilis group,symptomatic syphilis group and control group(P>0.05).3)The ratio of T-bet/GATA-3 in latent syphilis group was significantly lower than those in symptomatic syphilis group and control group(P<0.05).There was no difference between symptomatic syphilis group and control group(P>0.05).4)Spearman correlation analysis suggested that there was no association between the expression level of T-bet mRNA or GATA-3 mRNA and serum RPR titre(rs=0.19,P>0.05;rs=0.10,P>0.05).Conclusion The imbalance of T-bet/GATA-3 may play an important role in the immunological pathogenesis of early latent syphilis,especially the low expression of T-bet might be involved in the imbalance of T-bet/GATA-3.

latent syphilis；peripheral blood mononuclear cell；T-bet；GATA-3

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項目(NO：黔科合J字[2010]2157)。

陳永艷，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：皮膚分子生物學(xué)，E-mail:cyyzy@126.com。

R759.1

A

1000-2715(2017)03-0285-04