陳文明，錢(qián)民章

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

絞股藍(lán)總苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷及NF-κB p65信號(hào)通路的影響

陳文明1，錢(qián)民章2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

目的 研究絞股藍(lán)總苷(GPs)對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法 將65只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組(20 mg/kg/d)、GPs低劑量組(100 mg/kg/d)和高劑量組(200 mg/kg/d)。建立大鼠腦缺血2 h-再灌注模型，待大鼠麻醉清醒后，根據(jù)神經(jīng)功能評(píng)分篩選出模型成功的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，按各組劑量連續(xù)灌胃7 d后，2,3,5-三苯基四唑化氯(TTC)染色法觀(guān)察各組腦組織梗死體積；HE染色觀(guān)察腦組織病理學(xué)變化；免疫組織化學(xué)法觀(guān)察大鼠大腦皮層白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達(dá)及核因子-κB p65(NF-κB p65)核轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果 與模型組比較，GPs低、高劑量組梗死體積小于模型組(P<0.01)，且IL-1β和MCP-1表達(dá)降低(P<0.01)，NF-κB p65核轉(zhuǎn)位減少(P<0.01)。結(jié)論 GPs對(duì)腦缺血2 h-再灌注損傷大鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制NF-κB p65的激活，降低炎性因子IL-1β及MCP-1的表達(dá)有關(guān)。

絞股藍(lán)總苷；腦缺血再灌注；核因子-κB p65；白介素-1β；單核細(xì)胞趨化蛋白-1；大鼠

絞股藍(lán)系葫蘆科絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán)[Gynoacemmapentaphyllum(Thunb)Mak]，為多年生草質(zhì)藤本植物，藥用干燥全草?！侗静菥V目》中記載，絞股藍(lán)以“烏蘞莓”之名入藥，具有清熱解毒、止咳化痰、補(bǔ)氣生津、健脾安神之功效，為我國(guó)常用中藥。絞股藍(lán)總苷(Gypenosides,GPs)是從絞股藍(lán)中提取分離的有效成分。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，GPs具有抗腫瘤、抗衰老、抗腦缺氧、抗動(dòng)脈粥樣硬化和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[1]。

腦缺血后再灌注損傷是一種嚴(yán)重的腦血管病變，危害極大。已有報(bào)道GPs通過(guò)抗氧化、減輕大鼠神經(jīng)元DNA/RNA損傷等對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[2-3]。腦缺血再灌注損傷時(shí)存在炎癥病理改變，炎性分子的表達(dá)量增加[4]，GPs能否抑制調(diào)控多種炎性分子表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB p65(NF-κB p65)的激活，進(jìn)而減少炎性分子的表達(dá)量而減輕組織損傷，未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在更全面地認(rèn)識(shí)GPs的藥理作用機(jī)制，為其用于腦缺血再灌注損傷的防治提供更充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器 絞股藍(lán)總苷(GPs)，純度99.7%(西安飛達(dá)生物技術(shù)有限公司)；尼莫地平片(規(guī)格：每片20 mg，批號(hào)：130443，亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)；大腦中動(dòng)脈阻塞(Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO)栓線(xiàn)(北京沙東生物技術(shù)公司)；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)及NF-κB p65抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；2,3,5-三苯基四唑化氯(TTC，上海山浦化工有限公司)；中性樹(shù)膠(上海標(biāo)本模型廠(chǎng))；冰箱(海爾股份有限公司)；微波爐(美的集團(tuán)有限公司)；恒溫箱(廣東中野精科儀器設(shè)備有限公司)；Leica光學(xué)顯微鏡(德國(guó)，Leica Microsystems Ltd)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及處理 清潔級(jí)SD大鼠，65只，雄性，體重(300±20)g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(渝)2007-0005。待動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周，隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組(n=11)、模型組(n=15)、尼莫地平組(20 mg/kg/d，n=13)、GPs低劑量組(100 mg/kg/d，n=13)和高劑量組(200 mg/kg/d，n=13)。動(dòng)物造模成功后，開(kāi)始按劑量灌胃給藥，假手術(shù)組和模型組大鼠給予生理鹽水(1 mL/kg/d)，連續(xù)7 d。

1.3 模型制備根據(jù)改進(jìn)的Zea Longa方法[5-6]動(dòng)物用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位固定，經(jīng)頸正中切口，然后分離右側(cè)頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)、外動(dòng)脈。將MCAO栓線(xiàn)圓頭端栓線(xiàn)經(jīng)頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，阻斷大腦中動(dòng)脈的所有血供來(lái)源。栓塞2 h后抽出栓線(xiàn)，繼之再灌注。待大鼠麻醉清醒后，根據(jù)神經(jīng)功能評(píng)分篩選出模型成功動(dòng)物，按各組劑量連續(xù)灌胃7 d。假手術(shù)組只分離血管，不結(jié)扎。

1.4 腦組織梗死部分體積比計(jì)算方法 將腦組織冠狀切成5片，厚度約2 mm/片，置于1%TTC溶液中，37 ℃水浴30 min。染色后用10%中性甲醛溶液避光固定。根據(jù)公式：梗塞百分比(%)=蒼白區(qū)重量/(蒼白區(qū)重量+非蒼白區(qū)重量)×100%，計(jì)算腦梗死體積。

1.5 病理學(xué)觀(guān)察 腦組織經(jīng)石蠟包埋，切片行HE染色，采用Leica光學(xué)顯微鏡觀(guān)察病理學(xué)的變化。

1.6 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)大鼠缺血周邊區(qū)IL-1β、MCP-1的表達(dá)和NF-κB p65轉(zhuǎn)位 石蠟切片厚度約4 μm，脫蠟至水合，3%H2O2室溫孵育后進(jìn)行抗原修復(fù)，根據(jù)SABC免疫組化染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，滴加一抗(IL-1β1：200、MCP-1 1：200、NF-κB p65 1：200)，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗，滴加二抗(生物素化山羊抗兔IgG)37 ℃孵育1 h，PBS沖洗，用DAB顯色，陽(yáng)性結(jié)果為棕色，返藍(lán)，脫水封片。用Leica光學(xué)顯微鏡觀(guān)察免疫組化結(jié)果，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野(400倍)進(jìn)行拍照。利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)切片中免疫組化染色的陽(yáng)性細(xì)胞(細(xì)胞漿和核內(nèi)含棕黃和/或褐色顆粒的細(xì)胞)進(jìn)行定量分析，計(jì)算陽(yáng)性染色的積分光密度(Integrated Optical Density，IOD)值。

2 結(jié)果

2.1 GPs對(duì)腦缺血-再灌注損傷大鼠模型腦梗死體積的影響 TTC染色發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組大鼠未見(jiàn)梗死灶形成，模型組大鼠缺血范圍較大，梗死體積百分比達(dá)(16.28±2.49)%；與模型組比較，GPs高低劑量組梗死范圍明顯縮小(P<0.01)，分別為(8.89±1.55)%和(9.58±3.73)%，與尼莫地平組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖1)。

與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖1 絞股藍(lán)總苷對(duì)腦缺血-再灌注模型大鼠腦梗死體積的影響±s)

2.2 GPs對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠模型腦組織形態(tài)的影響 HE染色可見(jiàn)假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)致密，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列規(guī)整，核膜完整，核仁清晰(見(jiàn)圖2A)。模型大鼠缺血區(qū)腦組織大部分神經(jīng)細(xì)胞萎縮、變性、甚至壞死，胞質(zhì)呈空泡變性、胞核出現(xiàn)不同固縮、溶解，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞水腫明顯(見(jiàn)圖2B)。給藥7 d后與模型大鼠比較，GPs各劑量組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞核固縮、核溶解、細(xì)胞腫脹有不同程度的減輕(見(jiàn)圖2C、D)，與尼莫地平組作用相近(見(jiàn)圖2E)。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：GPs低劑量組；D：GPs高劑量組；E：尼莫地平組。圖2 絞股藍(lán)總苷(GPs)對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織病理組織學(xué)的影響(n=5，HE×400)

2.3 GPs對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠模型IL-1β表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組大鼠腦組織IL-1β陽(yáng)性表達(dá)稀少，模型組腦組織胞核IL-1β陽(yáng)性表達(dá)較假手術(shù)組明顯增強(qiáng)(P<0.01)。給藥7 d后與模型組比較，GPs低、高劑量組的IL-1β陽(yáng)性表達(dá)明顯下降(P<0.01，見(jiàn)表1、圖3)。

組別IL-1βMCP-1NF-κBp65假手術(shù)3.8±0.2066.7±7.3模型24.5±1.9**28.7±1.5**390.7±50.2**GPs低劑量20.0±0.9##25.9±0.5##275.0±27.1##GPs高劑量18.5±0.7##24.3±1.2##229.1±50.6##尼莫地平17.1±0.8##24.0±0.7##227.0±28.8##

與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：GPs低劑量組；D：GPs高劑量組；E：尼莫地平組。圖3 絞股藍(lán)總苷(GPs)對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織IL-1β表達(dá)的影響(×400)

2.4 GPs對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織MCP-1表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組腦組織皮層未見(jiàn)MCP-1陽(yáng)性表達(dá)，模型組胞漿的MCP-1陽(yáng)性表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)；給藥7 d后與模型組比較，GPs低、高劑量組和尼莫地平組MCP-1陽(yáng)性表達(dá)明顯下降(P<0.01，見(jiàn)表1、圖4)。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：GPs低劑量組；D：GPs高劑量組；E：尼莫地平組。圖4 絞股藍(lán)總苷(GPs)對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷腦腦組織MCP-1表達(dá)的影響(×400)

2.5 GPs對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織NF-κB p65激活的影響 免疫組織化學(xué)結(jié)果可見(jiàn)，假手術(shù)組大鼠腦組織胞核顏色淺淡，提示NF-κB p65核移位少。與假手術(shù)組比較，模型組缺血區(qū)腦組織胞核NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)，表明NF-κB p65核移位明顯增強(qiáng)。與模型組比較，GPs低、高劑量組NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)明顯下降(P<0.01，見(jiàn)表1、圖5)。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：GPs低劑量組；D：GPs高劑量組；E：尼莫地平組。圖5 絞股藍(lán)總苷(GPs)對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織NF-κB p65激活的影響(×400)

3 討論

腦缺血-再灌注損傷的病理過(guò)程極為復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)在這一過(guò)程中起重要作用。大量炎癥介質(zhì)在腦缺血早期即可產(chǎn)生，在白細(xì)胞聚集、游出血管發(fā)揮細(xì)胞毒過(guò)程中起重要作用。促炎細(xì)胞因子IL-1β在正常生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞見(jiàn)有少量表達(dá)。在腦缺血或缺血性腦損傷等病理狀態(tài)下，IL-1β主要在腦損傷區(qū)域及周邊區(qū)域的單核細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量表達(dá)。IL-1β的致?lián)p作用與其誘導(dǎo)和加強(qiáng)再灌注過(guò)程中的炎癥反應(yīng)有著密切關(guān)系[4]。MCP-1對(duì)單核細(xì)胞有很強(qiáng)的趨化活性，對(duì)活化的T細(xì)胞、NK細(xì)胞等也有趨化募聚作用。正常腦組織中MCP-1表達(dá)水平極低，但已發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注腦組織中MCP-1表達(dá)量增加[7]，過(guò)度表達(dá)的MCP-1誘導(dǎo)炎性細(xì)胞向腦組織浸潤(rùn)，可加重缺血性腦損傷。本研究發(fā)現(xiàn)GPs能抑制腦缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)IL-1β和MCP-1蛋白的表達(dá)，表明GPs治療腦缺血再灌注損傷的機(jī)制與IL-1β和MCP-1等炎性因子有關(guān)，是否影響這些炎性分子的釋放尚需進(jìn)一步研究。NF-κB參與多種炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的基因調(diào)控，與腦缺血后炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[8]。在正常情況下，無(wú)活性的NF-κB大多以p65-p50-IκB三聚體形式存在于細(xì)胞漿中，其中IκB為抑制性亞單位，在刺激作用下，IκB磷酸化降解，活化的NF-κB迅速移入細(xì)胞核，與靶基因上啟動(dòng)子區(qū)域的κB序列發(fā)生特異性結(jié)合，從而啟動(dòng)相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)GPs能減少NF-κB p65核移位，說(shuō)明其激活受到抑制，且NF-κB是調(diào)控IL-1β、MCP-1等炎性分子表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，故二者的表達(dá)下調(diào)與GPs抑制NF-κB p65激活有密切關(guān)系。

總之，GPs對(duì)腦缺血再灌注損傷具有治療作用，本研究揭示了GPs抑制炎癥相關(guān)因子的表達(dá)與其防治大鼠腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)。

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[收稿2017-03-23;修回2017-04-17]

(編輯：王靜)

Influence of gypenosides on the injury induced by ischemia-reperfusion and NF-κB p65 signaling pathway in rat brain

ChenWenming1,QianMinzhang2

(1.Department of Cardiology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;2.Department of Biochemistry,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To investigate the protective effects and potential mechanism of gypenosides(GPs)on brain ischemia-reperfusion injury in rats.Methods Sixty-five SD rats were randomly divided into the sham group,ischemia-reperfusion model group,GPs low-dose(100 mg/kg/d)and high-dose(200 mg/kg/d)groups and nimodipine group(20 mg/kg/d).Ischemia-reperfusion injury model was performed according to Zea Longa method and scored according to the neurological function standard.GPs were orally administrated for 7 days after ensuring the success in ischemia-reperfusion model.Brain sections were stained by TTC to evaluate the area of infarct lesion.The pathological changes of rat brain were observed by HE staining.The immunohistochemistry was performed to detect the expressions of interleukin-1β(IL-1β),monocyte chemotactic protein 1(MCP-1)and the nuclear translocation of NF-κB in the cerebral cortex of rats.Results The areas of infarct lesions in GPs low-dose and high-dose groups were significantly smaller than those in the model group(P<0.01).Compared with the model group,the expressions levels of IL-1β and MCP-1 were decreased and the nuclear translocation of NF-κB p65 were reduced significantly in the GPs low-dose and high-dose groups(P<0.01).Conclusion GPs may improve the brain ischemia-reperfusion injury through inhibiting the activation of NF-κB signaling pathway and decreasing the expressions of inflammatory factors,such as IL-1β and MCP-1.

gypenosides;cerebral ischemia-reperfusion;NF-κB p65;IL-1β;MCP-1;rats

貴州省科技廳基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合丁字[2009]2-178)。

錢(qián)民章，女，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：天然產(chǎn)物防治心腦血管疾病的作用及機(jī)理，E-mail:qian_mzh@hotmail.com。

R285.5

A

1000-2715(2017)03-0273-05