劉 為，張 琳，田 偉，鄧勝利

(1.遵義醫(yī)學院 麻醉學系 貴州省麻醉與器官保護重點實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義市播州區(qū)人民醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563100；3 遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 麻醉科， 貴州 遵義 563099)

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基礎醫(yī)學研究

Urocortin I后處理對缺氧/復氧大鼠心肌細胞線粒體膜電位及活性氧自由基的影響

劉 為1，張 琳1，田 偉2，鄧勝利3

(1.遵義醫(yī)學院 麻醉學系 貴州省麻醉與器官保護重點實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義市播州區(qū)人民醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563100；3 遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 麻醉科， 貴州 遵義 563099)

目的 觀察Urocortin I后處理對缺氧/復氧大鼠心肌細胞線粒體膜電位及活性氧自由基的影響。方法 利用ALC-HP型離體心臟灌注裝置分離成年大鼠心肌細胞，將培養(yǎng)1 d后存活狀態(tài)良好的細胞隨機分為正常組(N組)、缺氧/復氧組(HR組)、UrocortinⅠ后處理組(Ucn I組)、5-羥葵酸拮抗Urocortin Ⅰ組(5-HD+UcnⅠ組)。N組：37 ℃培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)150 min；HR組：缺氧40 min后，復氧110 min；Ucn Ⅰ組：缺氧40 min復氧10 min，然后Ucn Ⅰ處理30 min再復氧70min；5-HD+Ucn Ⅰ組：特異性線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)拮抗劑5-HD處理10 min后，在含Ucn Ⅰ的培養(yǎng)基中處理30 min，余處理同Ucn Ⅰ組。各組于復氧末加入熒光探針并用倒置相差顯微鏡觀察細胞線粒體膜電位(MMP)及活性氧自由基(ROS)的變化。結果 ①MMP變化：N組心肌細胞MMP較其余各組高(P<0.01)；Ucn I組雖低于N組，但高于HR組及5-HD+Ucn I組(P<0.05)；5-HD+Ucn I組與HR組比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。②ROS變化：N組心肌細胞ROS熒光強度低于其余各組(P<0.01)； Ucn I組及5-HD+Ucn I組較HR組低(P<0.01)，但5-HD+Ucn I組高于Ucn I組(P<0.01)。結論 Urocortin I后處理能抑制缺氧/復氧心肌細胞活性氧自由基的生成，并抑制線粒體膜電位的衰減，其機制與其開放線粒體ATP敏感性鉀通道有關。

Urocortin I后處理；活性氧自由基；線粒體膜電位；線粒體敏感性鉀通道

心肌缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是各種缺血心臟疾病治療時共有的病理生理過程，如何減輕或者避免IRI一直被臨床廣為關注。線粒體活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的爆發(fā)及膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的下降與心肌IRI關系密切。Urocortin I是一種在心臟中表達的內源性神經(jīng)肽，無論在離體或者在體條件下均被證實具有心肌保護作用[1]。但其保護作用與ROS及MMP的關系尚不清楚。本實驗擬通過分離成年大鼠心肌細胞并模擬臨床缺氧/復氧損傷過程，觀察Ucn I后處理對心肌細胞線粒體ROS生成及MMP的影響，探討其心肌保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠20只，周齡為16～20周，體重約200 g左右，由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供。許可證號：SCXK(渝)2012-0005。

1.2 試劑與儀器 UrocortinⅠ、5-羥葵酸、M199培養(yǎng)基、牛血清白蛋白(BSA)、Ⅱ型膠原酶、乙二醇雙四乙酸(EGTA)、層黏連蛋白(Laminin) 均從美國Sigma公司購置，活性氧檢測試劑盒(碧云天生物技術公司，中國)、活體細胞線粒體內膜功能/膜電位紅色熒光測定試劑盒(杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，中國)；ALC-HP型離體心臟灌注裝置(北京吉安得爾科技有限公司，中國)、超凈臺(蘇州凈化設備有限公司，中國)、高壓滅菌鍋(TOMY公司，日本)、BS224S電子天平(賽多利思公司，德國)、純水處理器(Millipore，美國)。

1.3 實驗分組與處理 參照文獻[2]分離成年大鼠心肌細胞。將分離培養(yǎng)1 d后的心肌細胞隨機分為正常組(N組)、缺氧/復氧組(HR組)、Urocortin I后處理組(Ucn I組)、5-羥葵酸拮抗Urocortin Ⅰ組(5-HD+Ucn Ⅰ組)。N組：37 ℃ 95%O2+5%CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)150 min；HR組：缺氧40 min后，復氧110 min；UcnⅠ組：缺氧40 min后給予10 min的正常復氧過程，然后在含Ucn Ⅰ的培養(yǎng)基中處理30 min后復氧70 min；5-HD+Ucn Ⅰ組：缺氧后先用特異性線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)拮抗劑5-HD處理10 min后行Ucn Ⅰ后處理30 min，余處理同UcnⅠ組。各組細胞于復氧末進行ROS和MMP檢測。

1.4 檢測ROS變化 ROS檢測按碧云天活性氧檢測試劑盒進行操作：實驗前，先按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/升。吸除培養(yǎng)皿中的細胞培養(yǎng)液，加入1 mL稀釋好的DCFH-DA，覆蓋細胞孔表面，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20 min，然后用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內。細胞內的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平。其倒置顯微鏡觀察條件：488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長。若綠色熒光增強，表明ROS生成增多；同時在相同波長下使用多功能酶標儀檢測各組心肌細胞相對熒光單位(relative fluorescence units，RFU)：若RFU增高，表明ROS生成增多。

1.5 檢測MMP變化 于復氧末按照杰美基因GENMED活體細胞線粒體內膜功能/膜電位紅色熒光(TMRM)測定試劑盒產品說明書進行操作：染色液A置入冰槽里融化，稀釋液B放入37 ℃恒溫水槽里預熱。移出10 μL染色液A到1.5 mL離心管，加入890 μL稀釋液B，混勻后標記為染色工作液，置入暗室里進行如下操作。吸出培養(yǎng)皿中的細胞培養(yǎng)液到15 mL錐形離心管(收集懸浮細胞)，加入1 mL清理液C到細胞培養(yǎng)孔，作用30 s后移出清理液C到同一個15 mL錐形離心管(收集洗脫細胞)，加入0.25%胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液500 μL，37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育3 min，輕輕抖動細胞板，使細胞脫落。吸盡胰酶后，加入1 mL細胞培養(yǎng)液，移入15 mL離心管，臺式離心機離心5 min，速度300 g，吸去上清液，加入50 μL清理液C，混勻細胞顆粒群，轉入1.5 mL離心管中，加入450 μL染色工作液，輕度渦旋振蕩2 s，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中避光孵育20 min后，離心5 min，速度300 g，吸去上清液，加入500 μL清理液C。混勻后移出50 μL至載玻片上，即刻行載玻片壓片并觀察熒光變化；移出100 μL到黑色96孔板里即刻用熒光酶標儀測定相對熒光單位(RFU)。四甲基羅丹明甲酯染料(TMRM)，可選擇性地聚集在線粒體內呈現(xiàn)熒光染色，通過熒光的增強或減弱說明線粒體膜電位的變化，即內膜電負性的增高或降低。電位高，TMRM聚集于線粒體，顯示為強力紅色或桔紅色；電位破壞，TMRM則彌散在胞漿內，導致熒光減弱。其倒置顯微鏡觀察條件：540 nm激發(fā)波長，580 nm發(fā)射波長。紅色或桔紅色熒光減弱表明線粒體膜電位受到損害；于相同波長下使用多功能酶標儀測得的RFU值降低則表明線粒體膜電位受到破壞。

2 結果

2.1 各組心肌細胞MMP變化情況 各組心肌細胞MMP熒光結果(見圖1、表1)。其熒光強度變化：N組心肌細胞MMP熒光強度高于其余各組(P<0.01)；Ucn I組雖較正常組低，但高于 HR組及5-HD+Ucn I組(P<0.05)，而5-HD+Ucn I組與HR組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

A：N組；B：HR組；C：Ucn I組；D：Ucn I+5-HD組圖1 各組心肌細胞MMP熒光圖(×100)

組別相對熒光強度N2.314±0.359HR0.283±0.045aUcnI1.043±0.064abUcnI+5-HD0.289±0.064ac

a：與N組相比，P<0.01；b：與HR組相比，P<0.05；c：與Ucn I組相比，P<0.05。

2.2 各組心肌細胞ROS變化情況 各組心肌細胞ROS熒光結果(見圖2、表2)。其熒光強度變化：與其余各組相比，N組心肌細胞熒光強度相對較低(P<0.01)；Ucn I組及5-HD+Ucn I組雖高于N組，但低于HR組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；Ucn I組低于5-HD+Ucn I組，兩者之間仍表現(xiàn)出統(tǒng)計學意義(P<0.01，見表2。)

A：N組；B：HR組；C：Ucn I組；D：Ucn I+5-HD組。圖2 各組心肌細胞ROS熒光圖(×100)

組別相對熒光強度N0.835±0.058HR1.341±0.077aUcnI1.157±0.054abUcnI+5-HD1.249±0.091abc

a：與N組相比，P<0.01；b：與HR組相比，P<0.01；c：與Ucn I組相比，P<0.01。

3 討論

如何減輕或者避免IRI一直是臨床與科研工作的重點。目前研究發(fā)現(xiàn)：在缺血后再給予幾次短暫、反復的“缺血-再灌注”處理可以顯著減少缺血心肌梗死面積且能有效地防止內皮細胞功能的紊亂，從而對缺血心肌產生保護作用[3]；這種策略被稱為“缺血后處理”(ischemic postconditioning，IPC)。隨著研究的深入，學者又發(fā)現(xiàn)給予某些作用于特異靶點的藥物進行藥物后處理同樣具有抗IRI作用[4]。因此近來研究逐漸圍繞著藥物后處理進行，并逐漸成為研究的新熱點與新方向[5]。

線粒體作為細胞活動的“能量工廠” ，細胞的多種需能過程及生長與凋亡均受到線粒體的調控。其膜上線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)在生理狀態(tài)下的周期性開放與維持線粒體內外電化學的平衡狀態(tài)及線粒體膜電位的形成等方面具有重要的意義[6]。線粒體氧化磷酸化生成ATP、運輸線粒體蛋白、維持鈣離子穩(wěn)態(tài)、回收質子等功能的實現(xiàn)有賴于正常線粒體膜電位的維持。此外，線粒體也是ROS產生的主要場所。生理狀態(tài)下，ROS是線粒體呼吸鏈的必然產物，在體內抗氧化酶和抗氧化劑的作用下保持著動態(tài)平衡。而在缺血再灌注過程中，線粒體通透性轉換孔(mPTP)在大量ROS產生的不利因素下開放，造成線粒體膜電位降低，最終使細胞在增多的細胞色素C等促凋亡蛋白的影響下趨于凋亡[7-8]。本實驗前期研究證實：Urocortin I可通過保持線粒體呼吸功能與呼吸酶的活性[9]及穩(wěn)定線粒體膜電位[10-11]從而發(fā)揮抗IRI效應。但其心肌保護效應與ROS及MMP的相關性尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)：與HR組相比，N組心肌細胞MMP熒光強度相對較高，說明缺氧復氧可導致線粒體膜電位下降，這與王亞東等[12-13]研究結果一致。而Ucn I組較HR組及5-HD+Ucn I組高，但5-HD+Ucn I組與HR組相比MMP熒光值無統(tǒng)計學差異。說明Ucn I后處理能在一定程度上抑制MMP的下降，且抑制作用與mitoKATP通道有關。其機制可能是：mitoKATP通道的活性在Ucn I的作用下增強，K+順電化學梯度進入線粒體，線粒體基質由于基質內滲透壓的增高而發(fā)生腫脹，維持了膜間隙結構的相對穩(wěn)定，阻止腺嘌呤核苷酸進入細胞內，從而維持了缺氧復氧過程中的能量供給；同時，腫脹的線粒體基質使肌酸激酶和腺嘌呤核苷酸移位酶的功能性耦聯(lián)增強，更多的肌酸將被線粒體磷酸化，這有利于能量向細胞漿的轉移，從而減少了線粒體ATP的耗竭，兩者均能抑制mPTP開放[14]，從而維持線粒體膜電位的穩(wěn)定。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)：與其余各組相比，N組心肌細胞ROS濃度相對較低，HR組較其余各組高，表明缺氧復氧可導致ROS生成增多。而Ucn I組ROS濃度低于HR組，提示Ucn I后處理能在一定程度上抑制缺氧復氧心肌細胞 ROS的生成。同時，5-HD+Ucn I組心肌細胞ROS濃度較Ucn I組高，但低于HR組，表明Ucn I后處理抑制ROS的生成與其開放mitoKATP通道有關。因mitoKATP的開放可促進鉀離子內流，增加線粒體基質容積，使鈣離子內流受到抑制，從而減輕鈣超載，提高氧代謝率和促進線粒體呼吸，呼吸功能的增強則能顯著減少ROS的產生[15]；另mitoKATP通道的開放，可改善線粒體電子傳遞鏈，減少ROS等過氧化物生成，同時可激活SOD2等抗氧化酶的活性，起到抗氧化應激的作用[16]。而既往通過基因芯片已經(jīng)證實Ucn I可使mitoKATP通道的Kir6.2亞基表達增強[17]，這為Ucn I能開放mitoKATP通道打下了分子基礎。此外，表2結果顯示：5-HD并沒有完全消除Ucn I后處理抑制ROS生成的作用，這是否與細胞膜ATP敏感性鉀通道(sarcKATP)相關還有待進一步研究。

綜上所述，Urocortin I后處理能抑制缺氧/復氧心肌細胞活性氧自由基的大量生成，并抑制線粒體膜電位的衰減，其機制與其開放線粒體ATP敏感性鉀通道有關。

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[收稿2017-04-20;修回2017-05-10]

(編輯：王靜)

The effect of urocortin I postconditioning on mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in rat heart during hypoxia/reoxygenation

LiuWei1，ZhangLin1，TianWei2，DengShengli3

(1 Department of Anesthesiology of Zunyi Medical University，Guizhou Key Laboratory of Anesthesia and Organ Protection ，Zunyi Guizhou 563099，China;2 Department of Anesthesiology of People’s Hospital of Bozhou District, Zunyi Guizhou 563100，China ;3.Department of Anesthesiology，Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099，China)

Objective To explore the effect of urocortin I postconditioning on mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in rat heart during hypoxia/reoxygenation.Methods Isolated rat myocytes by using ALC-HP type isolation heart perfusion device. Myocytes after being continuously cultivated 24 h were randomly divided into four groups: Nor group,HR group,UcnI postconditioning group and mitochondrial ATP-sensitive potassium channel blocker 5-HD+Ucn I group. Nor group: cultivated in a 37 ℃ incubator continuously for 150 min; HR group: suffered from hypoxia for 40 min, then reoxggenation for 110 min;Ucn I group: reoxygenation for 10 min after being hypoxia for 40 min, then cultivated in a nutrient medium containing Ucn I for 30 min, and then reoxygenation for 70 min. 5-HD+Ucn I group: cultivated in the nutrient medium containing 5-HD for 10 min before reoxygenation, the rest managements were the same as Ucn I group. Observing the change of MMP and ROS by using inverted phase contrast microscope at the end of reoxygenation.Results 1)Fluorescence intensity change of MMP：Nor group was higher than other three groups(P<0.01)；Ucn I group was lower than Nor group，but higher than groups HR and 5-HD+Ucn I(P<0.05)；but there was no significant difference between groups HR and 5-HD+Ucn I(P>0.05. 2)Fluorescence intensity change of ROS: Nor group was lower than other three groups(P<0.01); HR group was higher than groups Ucn I and 5-HD+UcnI(P<0.01); while 5-HD+Ucn I group was higher than Ucn I group(P<0.01).Conclusion Urocortin I postconditioning can restrain the excessive generation of ROS and attenuation of MMP，these effects relate to the opening of mitochondrial ATP-sensitive potassium channel.

Urocortin I postconditioning；reactive oxygen species；nitochondrial membrane potential；mitochondrial ATP-sensitive potassium channel

貴州省科學技術基金資助項目( NO:黔科合SY 字[2013]3024) 。

鄧勝利，男，教授，碩士生導師，研究方向：心肌保護，E-mail:zydsl2004@163.com。

R614

A

1000-2715(2017)03-0268-05