劉愛東，王 箐，田 琳，劉曉紅，曾俊偉

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 機(jī)能學(xué)實驗室，貴州 遵義 563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

外源性硫化氫對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

劉愛東1，王 箐2，田 琳2，劉曉紅1，曾俊偉1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 機(jī)能學(xué)實驗室，貴州 遵義 563099)

目的 觀察硫氫化鈉(NaHS,外源性的H2S供體)對低糖和高糖環(huán)境下的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)凋亡的影響。方法 傳代培養(yǎng)人近曲腎小管上皮細(xì)胞，細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基同步化24 h后，將細(xì)胞分為8組：低糖對照組(5.5 mmol/L D-葡萄糖、低糖+不同劑量NaHS組(50、100、200 μmol/L)、高糖組(40 mmol/L D-葡萄糖)、高糖+不同劑量NaHS組(50、100、200 μmol/L)。將細(xì)胞置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)24、48 h，收集細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 ①刺激培養(yǎng)24、48 h，低糖+不同劑量NaHS組HK-2細(xì)胞凋亡率明顯低于低糖對照組(P<0.05)，以NaHS中劑量組降低明顯。②高糖刺激培養(yǎng)24、48 h，高糖組細(xì)胞HK-2細(xì)胞凋亡率明顯高于低糖對照組(P<0.01)。③高糖+不同劑量NaHS組HK-2細(xì)胞凋亡率明顯低于高糖組(P<0.05)，以NaHS中劑量組降低明顯。結(jié)論 NaHS能抑制低糖條件下腎小管上皮細(xì)胞的凋亡以及高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，有助于糖尿病腎病的治療。

硫化氫；腎小管上皮細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；高劑量葡萄糖；糖尿病腎病

糖尿病患者中約30%以上會出現(xiàn)糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)，DN是導(dǎo)致終末期腎病的重要原因。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今仍未完全明確，有研究表明細(xì)胞凋亡參與DN發(fā)生機(jī)制[1]。細(xì)胞凋亡是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞死亡的重要途徑，當(dāng)細(xì)胞凋亡調(diào)控失衡時，可促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展[2]。H2S作為一種新型的氣體信號分子，具有較強(qiáng)的抗炎癥、抗氧化應(yīng)激和抗細(xì)胞凋亡等生理功能[3]。研究表明，外源性NaHS給予糖尿病大鼠能夠改善腎功能指標(biāo)和病理結(jié)構(gòu)損傷及細(xì)胞凋亡[4-5]。因此，我們在體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞，觀察NaHS在低糖條件下和高糖誘導(dǎo)下對腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人近曲腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)購于上海生命科學(xué)院；NaHS購于Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基和FBS購于Hyclone公司；青鏈雙抗購于上海生工生物工程有限公司；D-葡萄糖購于阿拉丁試劑(上海)有限公司，DMSO(二甲基亞砜)購于Sigma公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購于上海貝博生物公司。

細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo，型號:Labserv CO-150)；超凈工作臺(蘇州安泰科技有限公司)；離心機(jī)(1.德國Eppendorf公司，型號:5418)；流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences，型號:BD FACSVerseTM)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取凍存的HK-2細(xì)胞，37 ℃快速解凍后，161.0g離心5 min，用DMEM培養(yǎng)基清洗2次后用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸后再離心；加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每天換1次培養(yǎng)基；待細(xì)胞長滿后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個/mL，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 實驗分組與處理 待同步化培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為8 組：①低糖對照組(5.5 mmol/L D-葡萄糖)；②低糖+NaHS低劑量組(5.5 mmol/L D-葡萄糖+50 μmol/L NaHS)；③低糖+NaHS中劑量組(5.5 mmol/L D-葡萄糖+100 μmol/L NaHS)；④低糖+NaHS高劑量組(5.5 mmol/L D-葡萄糖+200 μmol/L NaHS)；⑤高糖組(40mmol/L D-葡萄糖)；⑥高糖+NaHS低劑量組(40 mmol/L D-葡萄糖+50 μmol/L NaHS)；⑦高糖+NaHS中劑量組(40 mmol/L D-葡萄糖+100 μmol/L NaHS)；⑧高糖+NaHS高劑量組(40 mmol/L D-葡萄糖+200 μmol/L NaHS)；每組設(shè)3個復(fù)孔。放置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24、48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)測定HK-2細(xì)胞凋亡率 用不含EDTA的胰酶消化收集后，室溫下251.6g離心5 min，收集細(xì)胞；用4 ℃預(yù)冷1×PBS溶液重懸細(xì)胞1次，251.6g離心5 min，洗滌細(xì)胞。加入300 μL 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞。在重懸液中加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min；再加入10 μL PI染色，輕輕混勻細(xì)胞，于避光條件下室溫孵育10 min。上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，CELL Quest軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 NaHS對低糖條件下HK-2細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞培養(yǎng)24和48 h均表現(xiàn)為低糖+NaHS低、中、高劑量組HK-2細(xì)胞凋亡率明顯低于低糖對照組(P<0.05)，以低糖+NaHS中劑量組凋亡率降低明顯(P<0.01和P<0.05，見表1、圖1～2)。

組別細(xì)胞培養(yǎng)時間(h)2448低糖對照22.19±0.3522.31±0.56低糖+NaHS低劑量15.91±0.85*18.19±0.63*低糖+NaHS中劑量7.98±0.64#12.74±0.49*低糖+NaHS高劑量10.35±0.71*15.74±0.84*

與低糖對照組比較，*P<0.05，#P<0.01。

A：低糖對照組；B：低糖+NaHS低劑量組；C：低糖+NaHS中劑量組；D：低糖+NaHS高劑量組。圖1 在低糖培養(yǎng)下24 h各組HK-2細(xì)胞凋亡情況

A：低糖對照組；B：低糖+NaHS低劑量組；C：低糖+NaHS中劑量組；D：低糖+NaHS高劑量組。圖2 在低糖培養(yǎng)下48 h各組HK-2細(xì)胞凋亡情況

2.2 NaHS對高糖誘導(dǎo)下HK-2細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞培養(yǎng)24和48 h均表現(xiàn)為高糖組HK-2細(xì)胞凋亡率明顯高于低糖對照組(P<0.01)，高糖+NaHS低、中、高劑量組HK-2細(xì)胞凋亡率明顯低于高糖組(P<0.05)，以高糖+NaHS中劑量組凋亡率降低明顯(P<0.01，見表2、圖3～4)。

組別細(xì)胞培養(yǎng)時間(h)2448低糖對照22.19±0.3522.31±0.56高糖50.26±0.83**57.59±0.68**高糖+NaHS低劑量40.57±0.65#45.72±0.75#高糖+NaHS中劑量23.12±0.79##35.08±0.47##高糖+NaHS高劑量36.19±0.56#39.41±0.48#

與低糖對照組比較，**P<0.01；與高糖組比較，#P<0.05，##P<0.01。

A：低糖對照組；B：高糖組；C：高糖+NaHS低劑量組；D：高糖+NaH中劑量組；E：高糖+NaHS高劑量組。圖3 高糖誘導(dǎo)下24 h各組HK-2細(xì)胞凋亡情況

A：低糖對照組；B：高糖組；C：高糖+NaHS低劑量組；D：高糖+NaH中劑量組；E：高糖+NaHS高劑量組。圖4 高糖誘導(dǎo)下48 h各組HK-2細(xì)胞凋亡情況

3 討論

H2S作為一種新型的氣體信號分子，具有較強(qiáng)的抗炎癥、抗氧化應(yīng)激和抗細(xì)胞凋亡等生理功能[3]。NaHS是外源性H2S供體硫化鹽的一種，在溶液中可分離出Na+和HS-，隨后HS-和H+生成H2S。NaHS作為H2S供體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于H2S的研究當(dāng)中。

DN是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致慢性腎功能衰竭的主要原因。高血糖是公認(rèn)的在DN中起關(guān)鍵作用的因子，在DN發(fā)展過程中，既往研究表明，腎小球損傷是DN的主要發(fā)病機(jī)制。近來的研究表明，腎小管結(jié)構(gòu)或功能的損傷在早期糖尿病腎病的形成中具有重要作用[6]，腎小管損傷可能早于腎小球損傷[7]。有研究表明，內(nèi)源性H2S產(chǎn)生過少與糖尿病的發(fā)生有關(guān)[8-9]，在糖尿病患者以及糖尿病大鼠血液中，H2S的含量顯著降低[10-11]，高糖導(dǎo)致糖尿病大鼠和HK-2細(xì)胞凋亡，給予外源性H2S能夠減輕糖尿病大鼠腎臟的損傷和抑制細(xì)胞的凋亡[4-5]，換言之，高糖環(huán)境可引起內(nèi)源性H2S產(chǎn)生減少，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生病理改變，補(bǔ)充外源性H2S或(和)內(nèi)源性H2S的增多有效抑制了DN的病理改變，抑制細(xì)胞凋亡。

本研究顯示，高糖環(huán)境下培養(yǎng)24、48 h，HK-2細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率明顯高于低糖對照組，提示細(xì)胞凋亡參與了高糖對腎小管上皮細(xì)胞的病理過程，這與以往的研究相一致，而給予NaHS干預(yù)高糖下HK-2 24、48 h，通過流式細(xì)胞術(shù)再次證明H2S可以減輕高糖誘導(dǎo)下的細(xì)胞凋亡。在本實驗研究中，還發(fā)現(xiàn)外源性H2S可抑制低糖環(huán)境中的HK-2凋亡，此結(jié)果，進(jìn)一步說明H2S具有抗細(xì)胞凋亡的功能。至于高糖環(huán)境如何引起內(nèi)源性H2S的減少，H2S在病理條件下的生物學(xué)功能，以及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響有待深入探究。

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[收稿2017-03-21;修回2017-04-24]

(編輯：王靜)

Influence of exogenous hydrogen sulfide on cell apoptosis induced by high glucose in human proximal renal tubular epithelial cells

LiuAidong1,WangQing2,TianLin2,LiuXiaohong1,ZengJunwei1

(1.Department of Physiology, Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;2.Function Laboratory of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To investigate the influence of sodium hydrosulfide(NaHS,was taken as a donor of H2S)on cell apoptosis induced by high glucose in human proximal renal tubular epithelial cells(HK-2).Methods Human renal proximal tubular cells were cultured and divided into eight groups:low glucose as control group(5.5 mmol/L D-Glucose),low glucose + NaHS pretreatment group with dose of 50,100 and 200 μmol/L,high glucose group(40 mmol/L D-Glucose),high glucose + NaHS pretreatment group with dose of 50,100 and 200 μmol/L.Each group has three samples,cultured in 37 ℃ and 5%CO2incubator for 24 and 48 h,collected cells and cell supernatant fluid.Apoptosis rate was measured by flow cytometry.Results When cells were cultured 24 and 48 h,the apoptosis rate of low glucose + NaHS pretreatment groups were significantly lower than low glucose group (P<0.05),and decreased significantly in low glucose + NaHS (100μmol/L) dose group.The apoptosis rate of high glucose group was significantly higher than low glucose group(P<0.05),high glucose + NaHS pretreatment groups were significantly lower than high glucose group(P<0.05),and decreased significantly in high glucose + NaHS(100 μmol/L)dose group.Conclusion NaHS can suppress cell apoptosis induced by low glucose and high glucose in human proximal renal tubular epithelial cells,which could be a novel approach of treating diabetic nephropathy.

hydrogen sulfide;renal tubular epithelial cell;cell apoptosis;high glucose;diabetic nephropathy

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項目(NO：黔科合J字[2011]2259)；遵義醫(yī)學(xué)院重點學(xué)科建設(shè)項目(NO：XZXK-20120702)。

R334.1

A

1000-2715(2017)03-0264-04