金 海，陳 晨，張明輝，吳 芹，石京山，金 鳳

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 貴州省消化病研究所，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；4.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,貴州 遵義 563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及其海馬內(nèi)TNF-α、IL-6含量的增齡性改變

金 海1,2，陳 晨4，張明輝4，吳 芹3，石京山3，金 鳳3

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 貴州省消化病研究所，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；4.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,貴州 遵義 563099)

目的 探討大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及其海馬內(nèi)神經(jīng)炎癥因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)及白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)的增齡性改變。方法 SD大鼠42只，雌雄各半，分別為2月齡15只，6月齡13只，12月齡14只，Morris水迷宮檢測(cè)不同月齡大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，real time RT-PCR法檢測(cè)大鼠海馬TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)，ELISA檢測(cè)大鼠海馬TNF-α和IL-6蛋白的含量。結(jié)果 定位航行實(shí)驗(yàn)中，6月齡大鼠的平均逃避潛伏期最短，相比于12月齡，平均逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)，相比于2月齡，平均逃避潛伏期變化不明顯(P>0.05)，12月齡大鼠的學(xué)習(xí)成績(jī)與2月齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；空間探索實(shí)驗(yàn)中，6月齡大鼠進(jìn)入平臺(tái)區(qū)次數(shù)最多、原平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比及運(yùn)動(dòng)距離百分比最高，6月齡大鼠在原平臺(tái)象限運(yùn)動(dòng)距離百分比較2月齡顯著增加(P<0.05)，而原平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比及運(yùn)動(dòng)距離百分比變化不明顯(P>0.05)，6月齡大鼠進(jìn)入平臺(tái)區(qū)次數(shù)、原平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比及原平臺(tái)象限運(yùn)動(dòng)距離百分比與12月齡大鼠比較均顯著增加(P<0.05)，12月齡大鼠的學(xué)習(xí)成績(jī)與2月齡大鼠比較差異無顯著性(P>0.05)。real time RT-PCR結(jié)果表明，與2月齡及12月齡比較，6月齡大鼠海馬TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.01)；ELISA結(jié)果顯示，相比于2月齡及12月齡，6月齡大鼠海馬TNF-α、IL-6蛋白含量均顯著增高(P<0.01)。12月齡大鼠海馬TNF-α、IL-6 mRNA及蛋白含量與2月齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的增齡性改變與海馬TNF-α、IL-6 mRNA及蛋白水平的增齡性改變呈對(duì)應(yīng)關(guān)系。

學(xué)習(xí)記憶；大鼠；增齡；炎癥；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素6

大腦在生長(zhǎng)、發(fā)育及衰老過程中，學(xué)習(xí)記憶能力也相應(yīng)變化，這種變化的機(jī)制研究是目前神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。神經(jīng)炎癥不但參與阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展過程[1-2]，而且在衰老過程中也扮演極其重要的角色[3]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子TNF-α和IL-6的水平與健康老年人群的發(fā)病率和死亡率密切相關(guān)[4]，然而，神經(jīng)炎癥和學(xué)習(xí)記憶與年齡依賴性的相關(guān)性研究尚未見報(bào)道，故本研究采用2月齡、6月齡和12月齡大鼠初步分析學(xué)習(xí)記憶能力和神經(jīng)炎癥與年齡依賴性的相關(guān)性，為闡明增齡性學(xué)習(xí)記憶障礙的腦內(nèi)機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，雌雄各半，2月齡15只(250±20)g、6月齡13只(400±20)g及12月齡14只(550±20)g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)，許可證號(hào)：SCXK(渝)20070005。

1.2 主要儀器與試劑 WMT-100 Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)，Icycler IQ實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、iMark 酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，MILLI-Q超純水純化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)，Eppendorf 5417R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，NANODROP 2000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)。ELISA檢測(cè)試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)，引物、RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程大連有限公司)。

1.3 Morris水迷宮檢測(cè) 在進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練前1日將不同月齡大鼠置于未放安全島的水池中自由游泳2 min，使其適應(yīng)環(huán)境。檢測(cè)中將大鼠放于置有安全島的水池中游泳，并由WMT-100圖像處理系統(tǒng)自動(dòng)記錄大鼠的游泳軌跡及時(shí)間。Morris水迷宮檢測(cè)分為2步：第1步為定位航行實(shí)驗(yàn)，第1～4日，每日訓(xùn)練2次(上、下午各1次)，安全島放在同一位置，從東、西、南、北4個(gè)不同入水點(diǎn)，將大鼠面朝池壁放入水池中，檢測(cè)大鼠逃避潛伏期，取每日2次的平均成績(jī)來評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。第2步為空間探索實(shí)驗(yàn)，于實(shí)驗(yàn)第5日，移去安全島，將大鼠從同一入水點(diǎn)放入水中，記錄2 min內(nèi)大鼠進(jìn)入平臺(tái)區(qū)次數(shù)、原平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比及原平臺(tái)象限運(yùn)動(dòng)距離百分比，檢驗(yàn)大鼠憑記憶找到原安全島的能力。

1.4 ELISA檢測(cè)大鼠海馬TNF-α和IL-6的水平 水迷宮檢測(cè)結(jié)束后，每組大鼠各取6～8只，經(jīng)10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后斷頭取出腦組織，在冰盒上快速分離右側(cè)海馬于EP管中，按照1∶5比例加入預(yù)冷0.01 mmol/L PBS(pH 7.2～7.4)，勻漿后離心(1 000×g，20 min，4 ℃)，取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)TNF-α和IL-6的含量，按照試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.5 real time RT-PCR檢測(cè)大鼠海馬TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá) 待水迷宮檢測(cè)結(jié)束，每組大鼠各取4只，經(jīng)10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后斷頭取出腦組織，在冰盒上快速分離右側(cè)海馬于去酶EP管中，加入Trizol 0.5 mL，按照TaKaRa生物工程公司的RNA提取試劑盒提取RNA。按TaKaRa生物工程公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃×15 min，85 ℃×5 s，逆轉(zhuǎn)錄的cDNA于4 ℃保存?zhèn)溆?。PCR 反應(yīng)體系：SYBR superMix 7.5 μL，引物混合液(上游和下游)0.5 μL，DEPC水4 μL，稀釋2倍的cDNA 3 μL，總體積15 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。dCt=Ct average-中間值，基因的表達(dá)量=2^(-dCt)，目的基因的相對(duì)表達(dá)量=目的基因表達(dá)量/內(nèi)參基因表達(dá)量。TNF-α的上游引物：5′-TGAGCACAGAAAGCATGATC-3′，TNF-α的下游引物5′-TACAGGCTTGTCAC TCGAATT-3′；IL-6的上游引物：5′-TGTATGAACAGCGATGATG-3′，IL-6的下游引物：5′-AGAAGACCAGAGCAGATT-3′；β-actin的上游引物：5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′，β-actin的下游引物：5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′。

2 結(jié)果

2.1 不同月齡大鼠逃避潛伏期的比較 在定位航行實(shí)驗(yàn)中，6月齡大鼠學(xué)習(xí)成績(jī)最好，即平均逃避潛伏期最短，至定位航行第3、4日，與12月齡大鼠比較，平均逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)，與2月齡大鼠比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖1)。

與6月齡組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 不同月齡大鼠逃避潛伏期的比較

2.2 不同月齡大鼠空間搜索實(shí)驗(yàn)的比較 由表1可見，6月齡大鼠空間搜索成績(jī)最好，與2月齡組比較，6月齡大鼠在原平臺(tái)象限運(yùn)動(dòng)距離百分比明顯增加(P<0.05)，而通過平臺(tái)區(qū)的次數(shù)及原平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與12月齡組比較，6月齡大鼠通過平臺(tái)的次數(shù)、原平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比及運(yùn)動(dòng)距離百分比均顯著增加(P<0.05)，而2月齡與12月齡大鼠通過平臺(tái)區(qū)的次數(shù)、原平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比及運(yùn)動(dòng)距離百分比均無明顯差異(P>0.05)。

表1 不同月齡大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)的比較

組別(月齡)進(jìn)入平臺(tái)次數(shù)(次)原平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比(%)原平臺(tái)象限運(yùn)動(dòng)距離百分比(%)229.11±6.0135.51±5.2833.84±4.65*633.78±5.8941.17±8.1339.10±4.58 1225.56±4.10**32.82±6.17*32.70±6.05*

與6月齡組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 不同月齡大鼠海馬中TNF-α、IL-6蛋白含量的比較 6月齡大鼠海馬TNF-α、IL-6蛋白含量最高，與2月齡和12月齡組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而12月齡與2月齡組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖2A)。

2.4 不同月齡大鼠海馬中TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)的比較 由圖2B所見，6月齡大鼠TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)與2月齡和12月齡組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而12月齡與2月齡大鼠比較差異不明顯(P>0.05)。

與6月齡組比較，**P<0.01。 圖2 不同月齡大鼠海馬TNF-α、IL-6含量(A)和mRNA表達(dá)(B)的比較

3 討論

學(xué)習(xí)、記憶功能是大腦的高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)，動(dòng)物與人類一樣進(jìn)入中年期以后，學(xué)習(xí)記憶能力隨年齡增長(zhǎng)而逐漸減退[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)不僅是機(jī)體對(duì)內(nèi)外環(huán)境的適應(yīng)和反應(yīng)體系，而且與細(xì)胞分化、發(fā)育等過程密切相關(guān)，并從根本上參與了機(jī)體老化的全過程[6]。研究表明，腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)在衰老過程中扮演重要角色，老化與細(xì)胞因子及炎癥標(biāo)記物增加有關(guān)，年齡相關(guān)的免疫系統(tǒng)變化即免疫衰老導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌增加，這是慢性炎癥的主要原因，這種現(xiàn)象被稱為“炎性衰老”[7-8]。高水平的細(xì)胞因子TNF-α和IL-6與老年人發(fā)病率和死亡率的增加相關(guān)聯(lián)。在健康的老年群體中，高水平的TNF-α和IL-6可預(yù)測(cè)死亡率，對(duì)于體弱、年長(zhǎng)者，TNF-α和IL-6也可作為疾病標(biāo)志物。循環(huán)中TNF-α的含量最能預(yù)測(cè)體弱、年長(zhǎng)者的死亡率，而IL-6的含量是健康、年長(zhǎng)者死亡率的最危險(xiǎn)標(biāo)記[4-9]。然而有關(guān)神經(jīng)炎癥的增齡性改變和學(xué)習(xí)記憶之間的聯(lián)系尚未見報(bào)道，故本研究采用2月齡、6月齡和12月齡大鼠來分析神經(jīng)炎癥和年齡依賴性以及學(xué)習(xí)記憶能力的相關(guān)性。

研究結(jié)果表明，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力從2月齡至6月齡逐漸增強(qiáng)，6月齡學(xué)習(xí)記憶能力最強(qiáng)，而2月齡與12月齡相似，說明大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力在6月齡即青年期最強(qiáng)，與王蓉等[5]報(bào)道相似。此外，從2月齡到6月齡組大鼠海馬TNF-α、IL-6 mRNA及蛋白含量亦逐漸升高，以6月齡升高最明顯，尤其IL-6的增高較2和12月齡大鼠更為顯著，2月與12月齡大鼠之間無明顯差異，該結(jié)果提示正常衰老大鼠的神經(jīng)炎癥在6月齡前隨年齡增長(zhǎng)呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，6月齡時(shí)神經(jīng)炎癥反應(yīng)最強(qiáng)，之后逐漸減弱；12月齡與2月齡相當(dāng)，提示神經(jīng)炎癥與衰老過程中學(xué)習(xí)記憶能力變化之間的聯(lián)系對(duì)年輕患者比年老患者有更緊密的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，大鼠學(xué)習(xí)記憶的增齡性改變與海馬TNF-α、IL-6含量呈對(duì)應(yīng)關(guān)系，即大鼠學(xué)習(xí)記憶能力在6月齡即青年期最強(qiáng)，而大鼠海馬內(nèi)炎癥因子TNF-α、IL-6的含量在6月齡也最高，兩者的變化趨勢(shì)相同，因此推測(cè)這種變化的原因在于大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育在不同發(fā)育時(shí)期存在差異，6月齡大鼠即青年期是機(jī)體發(fā)育的最旺盛時(shí)期，此期大腦神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育最完善，神經(jīng)突觸發(fā)育最好[5]，神經(jīng)絲蛋白含量最高，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)最完整[10]，說明神經(jīng)元之間的聯(lián)系密切，信息傳遞功能最強(qiáng)，故青年期學(xué)習(xí)記憶能力最強(qiáng)。此外，由于衰老涉及機(jī)體的多個(gè)系統(tǒng)和器官，是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過程，其中免疫系統(tǒng)在體內(nèi)發(fā)揮著防御、監(jiān)視等作用，免疫功能的減弱必將引起體內(nèi)其他系統(tǒng)的功能失調(diào)，使機(jī)體易受到各種有害因素的侵襲，從而導(dǎo)致疾病[11-12]。青年期機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)育最完善，免疫反應(yīng)能力最強(qiáng)，機(jī)體合成和分泌細(xì)胞因子的能力亦最強(qiáng)，故TNF-α、IL-6的含量最高。眾所周知，AD是一種年齡相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，隨著年齡的增加，AD發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，并且神經(jīng)炎癥參與AD的發(fā)生發(fā)展過程[13-14]。荷蘭科學(xué)家利用一批年齡為52～97歲已確診為AD患者的研究發(fā)現(xiàn)，小于80歲的AD患者中顳葉皮質(zhì)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞顯著多于年齡更大的AD患者，提示神經(jīng)炎癥與AD發(fā)病機(jī)制之間的聯(lián)系對(duì)年輕患者比年老患者有更緊密的相關(guān)性[15]，與本研究結(jié)果相似。

綜合本研究結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道，可以推測(cè)，在臨床上年輕的AD患者比年長(zhǎng)的AD患者更適宜進(jìn)行抗炎治療，這為不同年齡AD患者的臨床抗炎治療提供導(dǎo)向，而具體的療效及更多可能的機(jī)制有待更深入研究。

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[收稿2017-03-27;修回2017-05-15]

(編輯：王靜)

The changes of learning and memory ability as well as hippocampal TNF-α and IL-6 levels in different age rats

JinHai1,2,ChenChen4,ZhangMinghui4,WuQin3,ShiJingshan3,JinFeng3

(1.Department of Gastroenterology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;2.Institute of Digestive Diseases of Guizhou Province,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;3.Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;4.College of Pharmacy,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To explore the changes of learning and memory ability and hippocampal tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and interleukin-6(IL-6)levels in different age rats.Methods 42 Sprague Dawley rats(male and female each half)were used：2 months(n=15),6 months(n=13),and 12 months(n=14).Learning and memory ability in different age rats were observed by Morris water maze,the levels of TNF-α,IL-6 mRNA and protein in the hippocampus were determined by real time RT-PCR and Western blot respectively.Results In the navigation experiment,the average escape latency in 6-month old rats was shortest,compared to 2-month rats,the change of average escape latency is not obvious (P>0.05),compared to 12-month rats,the average escape latency was significantly shortened (P<0.05),and there was no statistical significance between 12-month and 2-month rats (P>0.05).In the space exploration experiment,6-month-old rats had longer times of passing platform,percent of residence and swim distance on original platform quadrant,compared with 2-month-old rats,the percent of swim distance on original platform quadrant in 6-month-old rats was significantly increased(P<0.05),while there were no significant changes in the times of passing platform and percentage of residence time on original platform quadrant in 6-month-old rats(P>0.05).Compared with 12-month-old rats,the time of passing platform,percent of residence time and swim distance on original platform quadrant in 6-month-old rats were increased obviously(P<0.05),and there is no significant difference in 12-month-old rats compared with 2-month-old rats(P>0.05).The results of real time RT-PCR showed that TNF-α and IL-6 mRNA were significantly increased in hippocampus of 6-month-old rats compared with 2 and 12 month-old-month rats(P<0.01).The results of ELISA showed that TNF-α and IL-6 protein levels were significantly increased in the hippocampus of 6-month-old rats compared with 2- and 12-month-old rats(P<0.01).There was no significant change in hippocampal TNF-α IL-6 mRNA and protein levels in 12-month-old rats compared with 2-month-old rats(P>0.05).Conclusion The changes of learning and memory ability in different age rats showed a corresponding relationship with hippocampal TNF-α,IL-6 mRNA and protein levels.

learning and memory;rat;age-increasing;inflammation;tumor necrosis factor-alpha (TNF-α);interleukin-6 (IL-6)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81360311，81660599,81160400)；遵義醫(yī)學(xué)院基金資助項(xiàng)目(NO：2013F-686，F(xiàn)-738)；貴州省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(NO：QZYY2010-59,D274)。

金鳳，女，博士，教授，研究方向：神經(jīng)藥理及腫瘤藥理,E-mail:jinfeng1115@zmc.edu.cn。

R322.81

A

1000-2715(2017)03-0238-05