方振華 沈振國 孫倩 丁利

摘要[目的]對海南省某豬場腹瀉病死仔豬病原進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。[方法]通過臨床癥狀觀察與病理剖檢，結(jié)合RT-PCR方法和病毒的分離培養(yǎng)進(jìn)行病原鑒定。[結(jié)果]經(jīng)過RT-PCR擴(kuò)增，獲得了PRV和TGEV陽性目的片段；應(yīng)用MA-104細(xì)胞與PK-15細(xì)胞分別進(jìn)行PRV與TGEV的分離培養(yǎng)后，可見典型的細(xì)胞病變，經(jīng)過RT-PCR進(jìn)一步鑒定最終確診為PRV和TEGV混合感染。[結(jié)論]通過采用緊急接種和保守治療等綜合防治措施，獲得了較好的防控效果。

關(guān)鍵詞豬輪狀病毒；豬傳染性胃腸炎病毒；混合感染；實(shí)驗(yàn)室診斷

中圖分類號S858.28文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）14-0089-02

Abstract[Objective] To make laboratory diagnosis of dead pigs from a hoggery of Hainan Province.[Method] By using the clinical examination，pathologic autopsy，RTPCR and cell culture methods，the pathogen of dead pigs were separated and identified.[Result] The positive fragments of porcine rotavirus（PRV）and transmissible gastroenteritis virus （TGEV）were obtained by RTPCR.After PRV and TGEV were isolated and cultured in MA104 cells and PK15 cells respectively，the typical cytopathic effect displayed.The mixed infection of PRV and TGEV was further identified by RTPCR.[Conclusion] Better curative effects were obtained after comprehensive treatment measures such as emergent inoculation and conservative treatment were taken.

Key wordsPorcine rotavirus；Transmissible gastroenteritis virus；Mixed infections；Laboratory diagnosis

豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）是冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，可導(dǎo)致豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）[1-2]。該病是豬的一種高度接觸性腸道傳染病，各種年齡的豬均可發(fā)病，以嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和失水為主要特征，10日齡以內(nèi)的仔豬病死率很高，可達(dá)100%。近幾年來，我國該病的發(fā)生和流行呈上升趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PRV）屬于呼腸病毒科輪狀病毒屬的成員，是導(dǎo)致仔豬病毒性腹瀉的主要病原之一[6-7]。該病毒易感染仔豬，尤其是1～4周齡仔豬的發(fā)病率可超過80%，該病在世界范圍內(nèi)均有分布[8-9]。豬傳染性胃腸炎和豬輪狀病毒感染的發(fā)病年齡、流行特點(diǎn)、臨床癥狀及病理變化十分相似，時(shí)有混合感染[10]。傳統(tǒng)的診斷方法（如臨床觀察病變、熒光抗體檢測、免疫組織化學(xué)法等）操作步驟較為繁瑣，且較難進(jìn)行TGEV和PRV鑒別診斷。2016年12月，海南省某豬場哺乳仔豬出現(xiàn)拉稀癥狀，并迅速波及全群，排黃白色、水樣有惡臭味的糞便，病豬嘔吐物中有未消化的凝乳塊。仔豬體重減輕，脫水嚴(yán)重。10日齡內(nèi)新生仔豬多在腹瀉后2～4 d死亡，病死率達(dá)100%。筆者通過臨床癥狀觀察和病理剖檢，結(jié)合RT-PCR和病毒的分離培養(yǎng)進(jìn)行病原鑒定。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組RNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；病料來自海南某豬場。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1PRV VP4 基因引物。根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫的PRV-VP4 保守序列，設(shè)計(jì)1 對引物，并由上海生物工程股份有限公司合成。上游引物P1為5′-CACCAAACGCAACAACAGGA-3′；下游引物P2為5′-GATTAGCTGCTGGAAGTCCGT-3′。預(yù)計(jì)擴(kuò)增基因片段822 bp。

1.2.2TGEV N 基因引物。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫的TGEV-N 保守序列設(shè)計(jì)1 對引物。上游引物為5′-AGAGGCAGGCAACAATCCAA-3′，下游引物為5′-GTGACTTCTATCTGGTCGCCAT-3′。預(yù)計(jì)擴(kuò)增基因片段386 bp。

1.2.3病毒RNA 的提取。取病豬腹瀉糞便0.1 g，加入1.5 mL 離心管中，用生理鹽水2倍稀釋，反復(fù)凍融3次，4 ℃ 5 000 r/min 離心10 min，收集上清液。上清液按照總RNA 提取試劑盒的說明書進(jìn)行總RNA提取。

1.2.4RT-PCR。

1.2.4.1cDNA合成。以提取的總RNA 為模板，以O(shè)ligo（dT）18為引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)。反應(yīng)體系為：總RNA 2 μL、Oligo（dT）18（0.5 μg/μL）1 μL、2×TS Reaction Mix 10 μL、Trans Script RT/RI Enzyme Mix 1 μL、RNase-free Water 6 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃孵育 30 min，85 ℃ 5 min。最后，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃下保存，備用。

1.2.4.2PCR。反應(yīng)體系：模板cDNA 2 μL、SuperMix 12.5 μL、上下游引物（20 μmol/L）各1 μL、用滅菌的ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共34個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完畢，PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.5病毒分離。將上述處理的病料上清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后接種于MA-104細(xì)胞和PK-15細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對照，37 ℃下吸附1 h，加入含2%胎牛血清DMEM維持液，置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并盲傳3代，觀察細(xì)胞病變，并將細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行PRV和TGEV的PCR檢測。

2結(jié)果與分析

2.1PRV檢測結(jié)果

2.1.1病料PCR檢測結(jié)果。將采集的病料經(jīng)過常規(guī)方法處理后，以提取總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。經(jīng)擴(kuò)增，得到1條822 bp 的特異性條帶（圖1），表明待測樣品為PRV陽性。

2.1.2PRV的分離培養(yǎng)及鑒定。將PRV陽性病料過濾后接種于MA-104細(xì)胞，經(jīng)盲傳3代后，培養(yǎng)48 h，細(xì)胞出現(xiàn)散在的灶狀細(xì)胞病變；培養(yǎng)72～96 h，細(xì)胞變圓，部分細(xì)胞脫落（圖2）。將細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行PRV檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所分離病毒為PRV。

2.2TGEV檢測結(jié)果

2.2.1病料PCR檢測結(jié)果。將采集的病料經(jīng)過RT-PCR擴(kuò)增，得到1條386 bp的特異性條帶（圖3），表明待測樣品為TGEV陽性。

2.2.2TGEV的分離培養(yǎng)及鑒定。將TGEV陽性病料過濾后接種于PK-15細(xì)胞，經(jīng)盲傳3代后，培養(yǎng)24 h，部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮；培養(yǎng)48～72 h，細(xì)胞聚集成團(tuán)、脫落（圖4）。將細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行TGEV檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所分離病毒為TGEV。

3討論與結(jié)論

豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒均是引起仔豬腹瀉的重要病原體，近年來，隨著我國養(yǎng)豬規(guī)模的不斷擴(kuò)大，這2種病原引起的豬病呈上升趨勢，且多呈混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4，10]。豬輪狀病毒和傳染性胃腸炎病毒的靶細(xì)胞均為豬小腸黏膜上皮細(xì)胞[1，11]。病毒混合感染時(shí)，感染病豬的小腸黏膜上皮細(xì)胞的損傷程度加劇，表現(xiàn)為大量上皮細(xì)胞變性、壞死，腸絨毛顯著萎縮變短，甚至脫落。由此可見，當(dāng)2種病毒混合感染時(shí)，仔豬的嘔吐、腹瀉和脫水等病癥遠(yuǎn)較單一病原引起的癥狀更為嚴(yán)重，病死率遠(yuǎn)比單一病毒感染引起的高，給養(yǎng)殖場造成的經(jīng)濟(jì)損失也會(huì)更大。

鑒別與診斷PRV、TGEV的傳統(tǒng)方法主要有抗原檢測、電鏡觀察、病毒的分離與鑒定、血清學(xué)診斷等[12-13]，這些方法大多操作比較繁瑣，且周期長，靈敏度不高。RT-PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便快捷等優(yōu)點(diǎn)，可以大大提高檢測效率。于曉龍[10]、閆兆吉等[13]對來自各豬場的病料進(jìn)行了PRV和TGEV調(diào)查，認(rèn)為RT-PCR方法是鑒別診斷TGEV 和PRV 最特異、敏感的方法。在該病例的診斷過程中，在進(jìn)行臨床癥狀觀察及尸體剖檢的基礎(chǔ)上，選擇RT-PCR檢測技術(shù)作為確診的依據(jù)，并對病料進(jìn)行病毒的分離和鑒定，進(jìn)一步驗(yàn)證了RT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性。筆者通過深入養(yǎng)殖場調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該養(yǎng)豬場存在飼養(yǎng)管理水平較低、養(yǎng)殖密度高、免疫程序制定不合理等問題，造成了豬只免疫力下降，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。目前，豬輪狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒感染尚無有效的治療藥物，對于患病豬只應(yīng)大量補(bǔ)充等滲葡萄糖氯化鈉溶液，供給大量清潔飲水，進(jìn)行緊急接種、保守治療，淘汰部分發(fā)病豬只等，同時(shí)養(yǎng)殖場應(yīng)采取合理的監(jiān)控措施及免疫程序，加強(qiáng)衛(wèi)生和飼養(yǎng)管理，提高豬群的抵抗力是最為有效的防治方法。

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