周慧，周偉強(qiáng)

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110034；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析系統(tǒng)與傳統(tǒng)MTT法在測(cè)定乳腺癌細(xì)胞增殖中的比較

周慧1，周偉強(qiáng)2*

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110034；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

目的：通過(guò)實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析法與傳統(tǒng)MTT法對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖進(jìn)行監(jiān)測(cè)以對(duì)比確定研究細(xì)胞增殖的最佳實(shí)驗(yàn)方法手段。方法：采用MTT法、實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析法測(cè)定瘦素刺激乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的效果。結(jié)果：MTT法和實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析法結(jié)果均表明瘦素作用濃度為0.625 nmol/L、作用時(shí)間為24 h的條件下對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞有誘導(dǎo)生長(zhǎng)的效果。但實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析法能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的動(dòng)態(tài)生物學(xué)反應(yīng)過(guò)程，觀(guān)察效果更加直觀(guān)、準(zhǔn)確。結(jié)論：實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析法可較好地彌補(bǔ)MTT法的缺點(diǎn)，成為一種新的研究細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)方法。

乳腺癌；MCF-7；MTT；實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析法

實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀（real time cell analysis，RTCA）S16是一種新型的細(xì)胞自動(dòng)化分析系統(tǒng)［1］，它通過(guò)預(yù)置于特制16孔板底部的電極，應(yīng)用電阻抗傳感器原理對(duì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。由于E-Plate16的底部整合有微金電子傳感器芯片，當(dāng)貼壁生長(zhǎng)在微電極表面的細(xì)胞引起電極界面阻抗的改變時(shí)，該阻抗值的變化直接反映細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)［2］。由此，RTCA S16在細(xì)胞生理狀態(tài)下，實(shí)時(shí)、連續(xù)、定量跟蹤細(xì)胞形態(tài)和增殖分化改變，為細(xì)胞水平的分析研究提供了一個(gè)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)信息獲取的獨(dú)特方法。本文結(jié)合RTCA S16系統(tǒng)與傳統(tǒng)MTT法對(duì)Leptin誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)［3］，通過(guò)對(duì)比研究細(xì)胞增殖的最佳實(shí)驗(yàn)手段。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由本實(shí)驗(yàn)室凍存；RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；人重組Leptin蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；xCELLigence RTCA S16購(gòu)自艾森生物（杭州）有限公司；其他的化學(xué)試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司和上海生工生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100μg/m l的鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。待細(xì)胞鋪滿(mǎn)70%左右時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖將1×104/m l乳腺癌MCF-7細(xì)胞接種于96板各孔中，細(xì)胞進(jìn)行無(wú)血清同步化處理后加入不同濃度的Leptin（0、0.625、1.25、2.5、6.25、12.5、62.5 nmol/L）與細(xì)胞分別孵育24和48 h，應(yīng)用CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒進(jìn)行MTT測(cè)定MCF-7細(xì)胞增殖情況。

1.2.3 RTCA法測(cè)定細(xì)胞增殖將1×104/m l乳腺癌MCF-7細(xì)胞接種于RTCA系統(tǒng)的E-Plate 16板各孔中。無(wú)血清同步化處理各孔后分別加入不同濃度的Leptin（0、0.625、1.25、2.5、6.25、12.5、62.5 nmol/L）。通過(guò)RTCA系統(tǒng)各孔微電阻量的變化動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)0～48 h MCF-7的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，通過(guò)反映細(xì)胞增殖的動(dòng)力學(xué)變化反應(yīng)曲線(xiàn)（CI曲線(xiàn)）了解Leptin對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的作用效果，并尋找Leptin最佳作用點(diǎn)和作用時(shí)長(zhǎng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以（x±s）表示，采用單因素方差分析和Student′s t-test方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Leptin對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖影響的MTT分析MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，Leptin作用24 h后對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的誘導(dǎo)作用很明顯。當(dāng)Leptin濃度為0.625 nmol/L、1.25 nmol/L、2.5 nmol/L時(shí)表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖的效果。但這種刺激作用隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)及培養(yǎng)液養(yǎng)分的消耗，在孵育48 h后僅0.625 nmol/L Leptin還可表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用。對(duì)MCF-7細(xì)胞來(lái)說(shuō)，Leptin作用濃度為0.625 nmol/L、作用時(shí)間為24 h為最佳實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件。見(jiàn)圖1。

圖1 MTT法檢測(cè)Leptin對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響

2.2 Leptin誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)RTCA分析系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：在總共100 h的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中，低濃度Leptin對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)有刺激作用，0.625～6.25 nmol/L的Leptin均表現(xiàn)出較明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的效應(yīng)，其中以0.625 nmol/L濃度的Leptin產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用最明顯。但隨著Leptin作用時(shí)間的延長(zhǎng)，CI曲線(xiàn)在孵育48 h后趨于一致。因此，0.625 nmol/L濃度、24 h為L(zhǎng)eptin誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖的最適濃度和最適處理時(shí)長(zhǎng)。另外，在Leptin加入系統(tǒng)的開(kāi)始時(shí)長(zhǎng)（＜5 h），細(xì)胞出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)在細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)反應(yīng)性升高，但隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞曲線(xiàn)趨于平穩(wěn)，更準(zhǔn)確地代表了細(xì)胞真實(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)；與對(duì)照組（Leptin0nmol/L）相比，高濃度Leptin（12.5nmol/L和62.5 nmol/L）處理的MCF-7細(xì)胞，其CI值明顯降低，這說(shuō)明高濃度Leptin對(duì)MCF-7細(xì)胞具有毒性作用，可明顯抑制MCF-7細(xì)胞增殖。見(jiàn)圖2。

圖2 RTCA監(jiān)測(cè)Leptin對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響

3 討論

RTCA S16分析儀是艾森生物（ACEA Biosciences）自主研發(fā)的一款結(jié)構(gòu)緊湊的新型細(xì)胞自動(dòng)化分析系統(tǒng)，其能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、毒性、黏附及形態(tài)變化等動(dòng)態(tài)生物學(xué)反應(yīng)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞分析儀置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，裝有RTCA S16軟件的iPad通過(guò)無(wú)線(xiàn)模式操控整個(gè)系統(tǒng)的運(yùn)行并可進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。它可實(shí)時(shí)獲取全程動(dòng)態(tài)信息，在細(xì)胞的正常培養(yǎng)狀態(tài)下無(wú)標(biāo)記、無(wú)創(chuàng)傷、最接近生理狀態(tài)下獲得檢測(cè)結(jié)果［4］。

從本實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，RTCA系統(tǒng)可更準(zhǔn)確描述Leptin對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的誘導(dǎo)生長(zhǎng)過(guò)程。傳統(tǒng)的MTT僅從各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，存在一定的實(shí)驗(yàn)限制性，尤其是篩選和確定藥物最佳濃度及最佳作用時(shí)間等藥敏實(shí)驗(yàn)時(shí)有著先天的缺陷［5-12］。如果單從MTT結(jié)果來(lái)說(shuō)，Leptin作用濃度為0.625 nmol/L、作用時(shí)長(zhǎng)為24 h為實(shí)驗(yàn)最佳條件，這與從RTCA監(jiān)測(cè)圖中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相同，但RTCA系統(tǒng)能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的動(dòng)態(tài)生物學(xué)反應(yīng)過(guò)程，觀(guān)察效果更加直觀(guān)、準(zhǔn)確。因此RTCA系統(tǒng)較好地彌補(bǔ)了MTT實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)，其在追求更準(zhǔn)確、更可控的前提下可成為一種新的細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域的良好實(shí)驗(yàn)手段。

［1］Ebersohn K，Coetzee P，Venter EH.An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay［J］.J Virol Methods，2014，199：25-28.

［2］Kaschula CH，Hunter R，Stellenboom N，et al.Structureactivity studieson theanti-proliferation activityofajoeneanalogues in WHCO1 oesophageal cancer cells［J］.Eur J Med Chem，2012，50：236-254.

［3］王春勝，周偉強(qiáng).Leptin促進(jìn)乳腺癌發(fā)生的機(jī)制研究［J］.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，15（4）：234-237.

［4］Hunsawong T，Singsuksawat E，In-chon N，et al.Estrogen is increased in male cholangiocarcinoma patients'serum and stimulates invasion in cholangiocarcinoma cell lines in vitro［J］.J Cancer ResClin Oncol，2012，138（8）：1311-1320.

［5］夏想厚，谷俊朝，杜松濤，等.乳腺癌組織瘦素與凋亡調(diào)節(jié)因子表達(dá)相關(guān)性的研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2011，18（20）：1598-1602.

［6］范杰，劉冰，高衛(wèi)國(guó)，等.血清抵抗素、脂聯(lián)素和瘦素水平與乳腺癌的相關(guān)性研究［J］.實(shí)用腫瘤雜志，2010，25（6）：656-660.

［7］張志寧，趙亞恒，鄭麗華，等.瘦素及瘦素受體與乳腺癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究［J］.中國(guó)腫瘤外科雜志，2014，6（6）：378-381.

［8］AlshakerH，KrellJ，F(xiàn)ramptonAE，etal.Leptininducesupregulation of sphingosine kinase 1 in oestrogen receptor-negative breast cancer via Src family kinase-mediated，janus kinase 2-independent pathway［J］.Breast Cancer Res，2014，16（5）：426.

［9］Alshaker H，Wang Q，F(xiàn)ramptonAE，etal.Sphingosine kinase 1 contributes to leptin-induced STAT3 phosphorylation through IL-6/gp130 transactivation inoestrogen receptor-negativebreastcancer［J］.BreastCancerRes，2015，149（1）：59-67.

［10］DuboisV，Jarde T，Delort L，etal.Leptin inducesaproliferative response in breast cancer cells but not in normal breast cells［J］.NutrCancer，2014，66（4）：645-655.

［11］Khanal T，Kim HG，Do MT，et al.Leptin induces CYP1B1 expression in MCF-7 cells through ligand-independentactivation of the ERαpathway［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2014，277（1）：39-48.

［12］Nejati-Koshki K，Akbarzadeh A，Pourhasan-Moghaddam M，et al.Inhibition of leptin and leptin receptor gene expression by silibinin-curcumin combination［J］.Asian Pac JCancer Prev，2014，14（11）：6595-6599.

Com parison between RTCA and M TT for Detecting the Proliferation of Breast Cancer Cell

ZHOUHui1，ZHOUWeiqiang2*
（1.Depatementof Histology and Embryology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Shenyang Medical College，Key Laboratory of EnvironmentalPollution and Microecology of Liaoning Province）

Objective：To detect the proliferation ofbreastcancerMCF-7 cellby real time cellanalysis（RTCA）and traditional MTTmethod to identify the bettermethods.Method ethod：MTT and RTCAmethodswere used tomonitor the proliferation ofbreast cancer cellMCF-7 induced by different concentrationsof Leptin（0-62.5 nmol/L）.Results sults：MTTand RTCA all showed that Leptinwith the concentration of 0.625 nmol/L and 24 h of the incubation could get the optimal effect for MCF-7 cell proliferation.But the result of RTCA wasmore intuitive and accurate.Conclusion usion：RTCAmay be a betterway to offset the shortcomings of the MTT assay，and it willbecomean appliedmeans for cellproliferation.

breastcancer；MCF-7；MTT；real time cellanalysis

R394.3

A

1008-2344（2017）03-0198-03

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.03.004

2017-02-09

（文敏編輯）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81172509）；沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院科技基金項(xiàng)目（No.20143056）

周慧（1982—），女（漢），講師.研究方向：腫瘤學(xué).E-mail：zhouhui8013@163.com

周偉強(qiáng)（1970—），男（漢），教授.研究方向：乳腺癌發(fā)生與調(diào)控.E-mail：zhouwq@hotmail.com