胡丹，唐克軒，苗志奇

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利用紫外誘變選育楸靈素合成缺陷株

胡丹，唐克軒，苗志奇

上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240

胡丹, 唐克軒, 苗志奇. 利用紫外誘變選育楸靈素合成缺陷株. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(5): 838–848.Hu D, Tang KX, Miao ZQ.Preparation of catalitaxol-deficient defective strains by using ultraviolet mutagenesis. Chin J Biotech, 2017, 33(5): 838–848.

楸樹(shù)內(nèi)生真菌菌株FSN002次生代謝產(chǎn)物楸靈素具有優(yōu)良的抗肝癌性能，選育突變株是研究楸靈素生物合成機(jī)制的重要手段。真菌孢子預(yù)培養(yǎng)13 h左右，萌發(fā)形成4–6個(gè)細(xì)胞的幼嫩菌絲，適合作為紫外誘變的出發(fā)材料。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紫外光強(qiáng)度和照射時(shí)間對(duì)真菌致死率的影響符合線性模型，二者之間不存在明顯的交互作用。當(dāng)紫外光強(qiáng)度為90 000 μJ/cm2，時(shí)長(zhǎng)為6 s時(shí)，真菌的致死率在95%左右。在上述優(yōu)化選育誘變條件下，獲得了1株楸靈素合成能力完全喪失的突變株和1株楸靈素合成能力下降到野生型16%的突變株，為下一步研究楸靈素的生物合成機(jī)制以及高效生產(chǎn)楸靈素奠定了基礎(chǔ)。

紫外誘變，內(nèi)生真菌，突變株，致死率，楸靈素，抗癌代謝物

1993年，Stierle等從短枝紅豆杉的樹(shù)皮中分離出能夠合成治療癌癥的紫杉醇的內(nèi)生真菌，從而開(kāi)啟了一個(gè)利用藥用植物內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)生次生代謝抗癌藥物的新時(shí)代[1-2]。胡桃楸Maxim為胡桃科胡桃屬植物，又名核桃楸，屬于落葉喬木，主要分布在我國(guó)東北海拔在300?800 m的溝谷兩岸及山麓濕潤(rùn)沃土地帶，具有多種藥用價(jià)值[3]。胡桃楸中含有豐富的環(huán)烯醚萜類化合物，具有抗炎、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)等作用[4]。植物內(nèi)生真菌是指整個(gè)生活史都在植物體內(nèi)或生活史的一定階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌[5]。它們是組成植物和微生物共生系統(tǒng)的重要成分[6-7]。研究表明，內(nèi)生真菌廣泛存在于大部分植物中[8]，對(duì)其產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的研究報(bào)道也越來(lái)越多[9-10]。藥用植物內(nèi)生真菌作為新的藥物資源引起了廣泛的關(guān)注，從內(nèi)生真菌中尋找和發(fā)現(xiàn)新的活性化合物成為熱點(diǎn)[11-12]，許多學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤的活性[13-16]。近幾年，有學(xué)者從胡桃楸中發(fā)現(xiàn)一些具有抗腫瘤活性的物質(zhì)，Gao等從其樹(shù)皮中分離到一種不飽和脂肪酸JA可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[17]，Ruijun W等提取純化的水溶性多糖JRP1對(duì)s180細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用[18]，Nian等發(fā)現(xiàn)物質(zhì)HT能夠抑制細(xì)胞增殖和端粒酶活性，誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，在癌癥治療方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[19]?，F(xiàn)有從胡桃楸樹(shù)中分離到的1株木霉屬內(nèi)生真菌FSN002[20]，該菌株能夠合成分泌抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的次生代謝物楸靈素，其發(fā)酵液對(duì)肝癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用[21-23]，即使在稀釋20倍后仍能實(shí)現(xiàn)對(duì)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞HepG2的半數(shù)抑制[24]。本研究有望通過(guò)紫外誘變法獲得其突變株，為進(jìn)一步明確楸靈素的生物合成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

國(guó)內(nèi)外眾多的專家學(xué)者采用紫外誘變法進(jìn)行相關(guān)研究，Liang等采用鼠李糖和丙酸鈉抑制選擇策略，利用紫外光對(duì)菌體進(jìn)行誘變，使誘變菌UV-42-13生產(chǎn)多殺菌素的能力較之野生菌得到增強(qiáng)[25]；Jin等通過(guò)亞硝基胍和紫外照射相結(jié)合的誘變方法對(duì)10株多殺菌素生產(chǎn)菌進(jìn)行誘變獲得刺糖多孢菌突變菌株4-7，生產(chǎn)能力較野生菌也顯著提高[26]；張躍群等利用紫外線照射鹽藻，獲得的突變株蛋白質(zhì)含量降低[27]。鑒于此法的有效性，我們力圖建立獲得FSN002突變株的紫外誘變方法，并通過(guò)對(duì)誘變條件的優(yōu)化提高菌株的突變率。

1 材料與方法

1.1 材料

內(nèi)生真菌FSN002分離自楸樹(shù)樹(shù)皮[20]，為長(zhǎng)枝木霉。其菌絲細(xì)長(zhǎng)，有分枝，透明、有隔，細(xì)胞壁光滑；分生孢子梗由菌絲直立生出，無(wú)色、多對(duì)，分枝與分生孢子梗呈近似直角，末端為小梗。小梗為瓶色，分生孢子呈球形或長(zhǎng)橢圓形，表面粗糙，分生孢子為綠色，種質(zhì)資源庫(kù)保存編號(hào)為CCTCC M 208102[28]。

實(shí)驗(yàn)所用的孢子懸液來(lái)源于此菌株，保存于上海交通大學(xué)植物生物技術(shù)中心–80 ℃冰箱；誘變所用的紫外誘變儀購(gòu)自美國(guó)UVP公司 (單位：×100 μJ/cm2)；實(shí)驗(yàn)所用的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA) 與馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 紫外誘變條件的優(yōu)化

內(nèi)生真菌FSN002在進(jìn)行紫外誘變獲得突變株的過(guò)程中，需要對(duì)紫外誘變條件進(jìn)行優(yōu)化，一是孢子的萌發(fā)率，二是孢子的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，三是紫外光強(qiáng)度與照射時(shí)長(zhǎng)。

孢子萌發(fā)：材料取自上海交通大學(xué)植物生物技術(shù)中心保存的菌株FSN002的孢子懸液，通過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，1 mL的原液中大概有 5×107個(gè)孢子；用無(wú)菌水對(duì)孢子原液進(jìn)行不同梯度的稀釋，獲得稀釋10 000倍、20 000倍、40 000倍、80 000倍的孢子液，并取部分置于顯微鏡下計(jì)算孢子個(gè)數(shù)；分別取200 μL不同濃度的稀釋液涂布在4個(gè)固體培養(yǎng)基上，涂布棒涂抹均勻后，用封口膜封住，倒置在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)；24 h之后進(jìn)行觀察，記錄萌發(fā)的孢子個(gè)數(shù)，獲得內(nèi)生真菌FSN002的孢子萌發(fā)率。

孢子萌發(fā)率(%)＝N0/N1×100%

(N0：萌發(fā)的孢子個(gè)數(shù)，N1：涂板的孢子個(gè)數(shù))

孢子預(yù)培養(yǎng)時(shí)間：先在超凈臺(tái)中，將濃度為5×107/mL的內(nèi)生真菌FSN002孢子懸液用無(wú)菌水稀釋100倍后，取100 μL的稀釋液分別涂布在4個(gè)固體PDA培養(yǎng)基上，涂布棒將稀釋液涂抹均勻后，用封口膜封住，倒置在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)；之后每隔5 h，取出一個(gè)培養(yǎng)皿，用切刀在培養(yǎng)皿的不同位置切下3塊2 cm×2 cm的固體培養(yǎng)基，放置在載玻片上進(jìn)行觀察，選取15個(gè)萌發(fā)的孢子，并紀(jì)錄其萌發(fā)的細(xì)胞個(gè)數(shù)。觀察的時(shí)間點(diǎn)分別為培養(yǎng)后的5、10、15和20 h。

紫外光強(qiáng)度與照射時(shí)長(zhǎng)：將濃度為5×107/mL的內(nèi)生真菌FSN002孢子懸液用無(wú)菌水稀釋 50 000倍后，將含有1 000個(gè)左右孢子的100 μL孢子稀釋液，在超凈臺(tái)中用移液槍注射到固體PDA培養(yǎng)基上，用涂布棒涂抹均勻后，封口膜封口；倒置在28 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)10?15 h，將其取出，放入已在超凈臺(tái)中滅菌0.5 h的紫外誘變儀中，對(duì)預(yù)培養(yǎng)后的真菌進(jìn)行誘變；紫外光的能量的分別設(shè)置為10 000 μJ/cm2、30 000 μJ/cm2、60 000 μJ/cm2、90 000 μJ/cm2、120 000 μJ/cm2，5組不同光照強(qiáng)度的實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，照射時(shí)間相同，均為紫外誘變儀的最小時(shí)間單位6 s。將長(zhǎng)出菌絲的培養(yǎng)皿打開(kāi)，放進(jìn)紫外誘變儀中照射，之后，將其置于超凈臺(tái)中，吹風(fēng)2?3 min，再將培養(yǎng)皿用封口膜封住，錫箔紙包裹住，倒置在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，以防止發(fā)生光修復(fù)現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)步驟如上，準(zhǔn)備好預(yù)培養(yǎng)10?15 h的內(nèi)生真菌FSN002，將紫外誘變儀的照射光強(qiáng)設(shè)置成30 000 μJ/cm2，時(shí)間分別設(shè)置為6、12、18、24和30 s，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，減少實(shí)驗(yàn)誤差，照射完之后，不要立即將培養(yǎng)皿的蓋子蓋上，而是放在超凈臺(tái)中，吹風(fēng)2?3 min后，用封口膜封住培養(yǎng)皿，錫箔紙包裹住，倒置在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)；黑暗培養(yǎng)20?24 h后，對(duì)存活下來(lái)的真菌個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟，將紫外光強(qiáng)設(shè)置為50 000 μJ/cm2，照射時(shí)長(zhǎng)設(shè)置為10 s，實(shí)驗(yàn)后，對(duì)存活下來(lái)的菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

紫外光照射能夠引起真菌DNA結(jié)構(gòu)的變化，不同的強(qiáng)度紫外光會(huì)導(dǎo)致不同的致死率。用于誘變的紫外光的能量以及照射時(shí)間的改變都會(huì)影響內(nèi)生真菌的致死率,計(jì)算方法如下：

致死率(%)＝(N0?N1)/N0×100%[29]

(N0：誘變前平板單菌落總數(shù)，N1：誘變后平板單菌落總數(shù))

1.2.2 內(nèi)生真菌FSN002突變株的獲得

根據(jù)上述優(yōu)化后的方法，對(duì)菌株FSN002進(jìn)行紫外誘變，獲得了誘變株；取未經(jīng)誘變過(guò)的野生型真菌孢子和2株誘變株b4、b5進(jìn)行培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)來(lái)減少實(shí)驗(yàn)誤差；將真菌分別培養(yǎng)3、6、13 d進(jìn)行觀察拍照記錄；用HPLC高效液相色譜法測(cè)培養(yǎng)6 d的內(nèi)生真菌FSN002野生型菌株與2株誘變株分泌的楸靈素含量。

1.2.3 內(nèi)生真菌FSN002突變株的驗(yàn)證

提取經(jīng)紫外誘變獲得的內(nèi)生真菌FSN002突變株基因組DNA，采用通用引物ITS1 (5′-TC CGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3′) 對(duì)真菌18S rDNA ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增[20]。將測(cè)序獲得的ITS序列與出發(fā)菌株內(nèi)生真菌FSN002的ITS序列進(jìn)行雙序列比對(duì)，并與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行Blast等生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變法各相關(guān)參數(shù)對(duì)菌株FSN002的孢子致死率的影響

2.1.1 孢子的萌發(fā)率

紫外誘變后孢子的致死率在90%–95%之間，是成功選育誘變株的最佳誘變范圍。在本實(shí)驗(yàn)中將稀釋不同倍數(shù)的孢子液涂在PDA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)菌落數(shù)，計(jì)算菌株FSN002的萌發(fā)率，以期獲得100個(gè)萌發(fā)菌落的涂板孢子懸液的濃度。將孢子母液分別稀釋4個(gè)不同濃度之后用顯微鏡計(jì)數(shù)，孢子數(shù)分別為400、260、140和70，通過(guò)涂板統(tǒng)計(jì)萌發(fā)的菌落數(shù)，分別為50、28、17和9，得到萌發(fā)率分別為12.5%、10.7%、12.1%和12.8% (圖1)。菌株FSN002的萌發(fā)率在10%–13%之間，可以根據(jù)萌發(fā)率來(lái)計(jì)算涂板濃度，確定實(shí)驗(yàn)稀釋倍數(shù)。孢子裝在EP管中，會(huì)有不同程度的沉降現(xiàn)象，即便是呈倍數(shù)稀釋后得到的實(shí)際孢子的數(shù)量也不會(huì)呈倍數(shù)遞減，也就不能得到準(zhǔn)確的萌發(fā)率，只能是預(yù)估一個(gè)范圍。此萌發(fā)率的范圍是在孢子培養(yǎng)24 h后確定所得，由于有的孢子還沒(méi)有萌發(fā)，隨著時(shí)間的增加，萌發(fā)率會(huì)有所增加，這需要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求和實(shí)驗(yàn)環(huán)境再次確認(rèn)，此孢子是凍存于–80 ℃冰箱，萌發(fā)率會(huì)低于一般的孢子萌發(fā)率。在今后的其他真菌的誘變實(shí)驗(yàn)中，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)找到其孢子的萌發(fā)率來(lái)計(jì)算所需要的涂板濃度。

圖1 菌株FSN002的孢子在不同稀釋倍數(shù)下的萌發(fā)率

2.1.2 孢子預(yù)培養(yǎng)時(shí)間

在孢子培養(yǎng)4個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)后，將其放置在顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照，記錄萌發(fā)的菌落數(shù)，找到孢子萌發(fā)出4?6個(gè)細(xì)胞的時(shí)間段，此時(shí)間段是孢子進(jìn)行紫外誘變的最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，萌發(fā)的孢子是最佳的實(shí)驗(yàn)材料[30]。

孢子預(yù)培養(yǎng)5、10、15和20 h的結(jié)果 (圖2) 顯示，培養(yǎng)5 h孢子只有1個(gè)細(xì)胞，10 h可以清楚地看到2–3個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，15 h可以看到10個(gè)以上細(xì)胞組成的菌絲，到20 h的時(shí)候，真菌長(zhǎng)出20個(gè)以上的細(xì)胞，菌絲更長(zhǎng)。通過(guò)觀察，菌株FSN002平均每2–3 h長(zhǎng)出1個(gè)細(xì)胞 (圖3)。

統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間點(diǎn)孢子萌發(fā)的細(xì)胞數(shù)，可以看出菌株FSN002的細(xì)胞呈指數(shù)式增長(zhǎng) (圖4)，其細(xì)胞生長(zhǎng)模型為=e(x–5.73)/4.23，推導(dǎo)過(guò)程如下：

設(shè)為萌發(fā)出來(lái)的細(xì)胞數(shù)，為真菌生長(zhǎng)時(shí)間，為孢子休眠時(shí)間，為真菌細(xì)胞的分泌周期，設(shè)指數(shù)函數(shù)的系數(shù)為k，菌株FSN002的細(xì)胞生長(zhǎng)模型為=k×e(x–t)/T，通過(guò)對(duì)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并且經(jīng)過(guò)R語(yǔ)言對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行模擬，計(jì)算出指數(shù)的系數(shù)k為1，為5.73，為4.23，通過(guò)數(shù)學(xué)計(jì)算，可知菌株FSN002孢子的休眠期為5.73 h，細(xì)胞的分裂周期是4.23 h。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察得到的數(shù)據(jù)與生長(zhǎng)模型的推算，可以推斷孢子萌發(fā)出形成4–6個(gè)細(xì)胞 (圖5) 的時(shí)間在10到15 h之間，可能是13 h左右。

2.1.3 紫外光照射強(qiáng)度與照射時(shí)長(zhǎng)

通過(guò)紫外光照強(qiáng)度與照射時(shí)長(zhǎng)對(duì)真菌致死率影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出隨著紫外光強(qiáng)度或照射時(shí)長(zhǎng)的增加，真菌的致死率也隨之發(fā)生變化。

圖3 菌株FSN002孢子萌發(fā)形成的細(xì)胞

圖4 菌株FSN002的孢子預(yù)培養(yǎng)時(shí)間與萌發(fā)形成的細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系

圖5 菌株FSN002的孢子萌發(fā)形成4–6個(gè)細(xì)胞

將照射時(shí)間設(shè)置為紫外誘變儀的最小照射時(shí)間6 s，通過(guò)4個(gè)不同能量強(qiáng)度的紫外光對(duì)預(yù)培養(yǎng)后的真菌進(jìn)行誘變，統(tǒng)計(jì)經(jīng)紫外照射后存活下來(lái)的菌落數(shù)并計(jì)算其致死率，分別為61%、73%、87%、95%和99% (圖6)，隨著紫外光照射強(qiáng)度的增大，致死率呈線性增加，呈線性正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)誘變劑量為 (90 000 μJ/cm2，6 s) 時(shí)，真菌的致死率在95%左右。將誘變光強(qiáng)設(shè)置為儀器的最小能量值10 000 μJ/cm2，統(tǒng)計(jì)5個(gè)不同紫外照射時(shí)長(zhǎng)的真菌致死率，分別為61%、70%、79%、88%和97% (圖7)，從圖中可以看出隨著照射時(shí)間的增加，致死率呈線性增加，兩者為線性正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)誘變劑量為 (10 000 μJ/cm2，25–29 s) 時(shí)，真菌的致死率在95%左右。紫外光強(qiáng)為50 000 μJ/cm2，照射時(shí)長(zhǎng)為10 s的真菌致死率是94%。

為了明確紫外光強(qiáng)度與照射時(shí)長(zhǎng)兩個(gè)因素對(duì)真菌致死率影響的相關(guān)性，對(duì)上述實(shí)驗(yàn)得到的11組數(shù)據(jù)采用R語(yǔ)言對(duì)其進(jìn)行了分析，建立了兩個(gè)數(shù)學(xué)模型，即交互模型，紫外光強(qiáng)度與照射時(shí)長(zhǎng)的共同作用與真菌致死率相關(guān)；非交互模型，紫外光強(qiáng)度與照射時(shí)長(zhǎng)的共同作用與真菌致死率不相關(guān)，演算過(guò)程如下：

在數(shù)學(xué)模型中，設(shè)是真菌的致死率，是紫外光強(qiáng)項(xiàng)，是照射時(shí)長(zhǎng)項(xiàng)，是紫外光強(qiáng)與照射時(shí)長(zhǎng)共同作用項(xiàng)，則交互模型的數(shù)學(xué)方程為=A+B+C，式中A、B、C為模型方程的系數(shù)，非交互模型的數(shù)學(xué)方程為=A+B，式中A、B為模型方程的系數(shù)。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)R語(yǔ)言進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示，在非交互模型中，光強(qiáng)與時(shí)間兩個(gè)因素對(duì)致死率的影響顯著，但它們兩者的共同作用對(duì)致死率幾乎沒(méi)影響；在交互模型中，僅有時(shí)間因素對(duì)致死率的影響顯著，照射光強(qiáng)對(duì)結(jié)果的影響不顯著，光強(qiáng)與時(shí)長(zhǎng)的共同作用項(xiàng)的影響也不顯著。結(jié)合實(shí)際的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，光強(qiáng)對(duì)致死率的影響不能夠被忽略，非交互模型更加符合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)，非交互模型的R-squared (0.942) 較小，說(shuō)明模型的擬合度更好，因此，可以認(rèn)為在紫外光強(qiáng)度和時(shí)長(zhǎng)與致死率之間的關(guān)系的數(shù)學(xué)模型為=0.083+3.703。在紫外光能量一定的情況下，照射時(shí)間越長(zhǎng)，真菌的致死率越高，照射時(shí)間不足，致死率下降，得不到突變株；紫外光照強(qiáng)度與時(shí)長(zhǎng)對(duì)致死率的影響是兩個(gè)不相關(guān)的因素。根據(jù)此模型可以做出當(dāng)致死率在90%–95%范圍內(nèi)的紫外光照強(qiáng)度范圍與光照時(shí)長(zhǎng)的函數(shù)圖 (圖8)，在今后的紫外誘變?cè)囼?yàn)中，可以根據(jù)此模型來(lái)確定光強(qiáng)和時(shí)長(zhǎng)兩個(gè)因素的大小。此外，該數(shù)學(xué)模型的函數(shù)圖 (圖8) 顯示，隨著光照時(shí)長(zhǎng)的增加，真菌的致死率為100%，這可能有兩方面原因，一是紫外光照射時(shí)長(zhǎng)增加，真菌受照的能量過(guò)多，導(dǎo)致全部死亡，二是隨著紫外光照射時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)產(chǎn)生出臭氧，臭氧對(duì)真菌具有強(qiáng)烈的殺滅 作用。

圖6 不同紫外光強(qiáng)照射強(qiáng)度對(duì)菌株FSN002的致死率

圖7 紫外光不同照射時(shí)長(zhǎng)對(duì)菌株FSN002的致死率

表1 不同紫外光照射強(qiáng)度與照射時(shí)長(zhǎng)與致死率的R語(yǔ)言分析模型

Add: ***: extremely significant; **: highly significant; *: significant; Without *: not significant.

圖8 紫外光照射強(qiáng)度和時(shí)長(zhǎng)與真菌致死率的非交互模型函數(shù)圖

經(jīng)過(guò)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，當(dāng)時(shí)間設(shè)置為6 s，能量在900 J時(shí)，孢子誘變的致死率在95%左右，達(dá)到實(shí)驗(yàn)致死率的要求。因此，最佳的實(shí)驗(yàn)誘變劑量是 (90 000 μJ/(cm2·6 s))，在今后的實(shí)驗(yàn)中，可以結(jié)合模型嘗試不同的紫外光強(qiáng)與照射時(shí)長(zhǎng)組合，紫外照射時(shí)長(zhǎng)不應(yīng)過(guò)長(zhǎng)，但誘變劑量效果應(yīng)該在 (90 000 μJ/(cm2·6 s)) 左右，可以通過(guò)適當(dāng)增加照射時(shí)長(zhǎng)，降低紫外光強(qiáng)，或者減少照射時(shí)長(zhǎng)，提高紫外光強(qiáng)來(lái)組合紫外誘變的劑量。

2.2 菌株FSN002突變株產(chǎn)楸靈素的HPLC鑒定

根據(jù)條件優(yōu)化后的誘變方法對(duì)菌株FSN002進(jìn)行誘變，獲得了2株可能的突變菌株b4和b5，將其與野生型菌株分別同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng) (圖9) 后發(fā)現(xiàn)，野生型菌株與菌株b5在培養(yǎng)到第6天時(shí)，培養(yǎng)液的顏色均變成了黃色，誘變株b4的培養(yǎng)液顏色呈現(xiàn)出透明淡黃色；在培養(yǎng)到第13天時(shí)，野生型菌株與b5菌株的培養(yǎng)液均變?yōu)榱咙S色，b4菌株的培養(yǎng)液仍然呈現(xiàn)透明淡黃色，表觀上可以判斷b4菌株分泌次生代謝物楸靈素的量少于野生型和b5菌株，或者也可能沒(méi)有產(chǎn)生楸靈素，此外，b4菌株的生長(zhǎng)速度也明顯慢于野生型菌株和b5菌株，菌株b4可能是突變株。

為了更加科學(xué)地對(duì)b4、b5菌株是否分泌楸靈素進(jìn)行判斷，采用HPLC高效液相色譜法檢測(cè)了3株菌株經(jīng)培養(yǎng)6 d后分泌的楸靈素含量，結(jié)果 (圖10) 顯示，在289 nm色譜圖中，楸靈素的出峰時(shí)間是20 min左右。從圖中可以看出在20 min左右，對(duì)照野生型菌株CK和b5菌株的色譜圖有峰，b4菌株則沒(méi)有峰，再?gòu)钠浞置诘拈膘`素含量 (圖11) 可以看出，b5菌株和野生型菌株都具有明顯的楸靈素合成能力，b5的楸靈素平均含量?jī)H比野生型的降低了16%，不具有顯著差異，而b4菌株的培養(yǎng)液中沒(méi)有檢測(cè)到楸靈素，因此可以進(jìn)一步確定b4為突變株。

2.3 內(nèi)生真菌FSN002的突變株的ITS序列鑒定

為了進(jìn)一步確認(rèn)突變株b4是否與出發(fā)菌株FSN002為同一個(gè)種，我們提取了突變株b4的基因組DNA，對(duì)其nrDNA的ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，得到其ITS序列 (GenBank登錄號(hào)：KY123648)，并與出發(fā)菌株FSN002的ITS序列 (GenBank登錄號(hào)：JX119024) 進(jìn)行了序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩者的ITS序列相似性為99.6%，說(shuō)明突變株b4與菌株FSN002為同種，菌株b4是菌株FSN002的突變株。

圖9 培養(yǎng)不同天數(shù)的野生型菌株與突變株的生長(zhǎng)情況

圖10 對(duì)照菌株(CK)、b4及b5菌株培養(yǎng)6 d時(shí)分泌楸靈素的色譜圖(289 nm)

圖11 對(duì)照菌株(CK)、b4及b5菌株培養(yǎng)6 d時(shí)的楸靈素含量

3 結(jié)論與展望

通過(guò)對(duì)選育內(nèi)生真菌長(zhǎng)枝木霉FSN002突變株的紫外誘變方法的建立和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)該真菌的孢子在培養(yǎng)24 h的萌發(fā)率在10%–13%之間，可以據(jù)此來(lái)確定實(shí)驗(yàn)的涂板濃度；在對(duì)真菌進(jìn)行誘變時(shí)，當(dāng)孢子萌發(fā)出4?6個(gè)細(xì)胞時(shí)是最佳的誘變時(shí)間；通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌FSN002在預(yù)培養(yǎng)13 h左右可以萌發(fā)出4?6個(gè)細(xì)胞，此時(shí)是最佳的誘變時(shí)間；紫外光強(qiáng)度與光照時(shí)長(zhǎng)均能夠引起真菌致死率的變化，兩個(gè)因素均與真菌的致死率呈線性正相關(guān)關(guān)系，但兩者之間的相關(guān)性可以忽略，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)學(xué)模型來(lái)設(shè)置致死率在95%左右的紫外誘變劑量。

本研究用建立優(yōu)化后的紫外誘變法對(duì)內(nèi)生真菌FSN002進(jìn)行多次誘變，篩選突變菌株，發(fā)現(xiàn)1株不分泌楸靈素的突變株b4，采用ITS序列對(duì)該突變株進(jìn)行了分子鑒定，確認(rèn)b4為長(zhǎng)枝木霉，是由菌株FSN002經(jīng)過(guò)紫外誘變而來(lái)，由此可以看出經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的紫外誘變法對(duì)于此木霉菌進(jìn)行突變育種是可行的。該方法的建立為今后通過(guò)突變株來(lái)研究抗癌次生代謝物楸靈素的生物合成機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，具有重要意義。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Preparation of catalitaxol-deficient defective strains by using ultraviolet mutagenesis

Dan Hu, Kexuan Tang, and Zhiqi Miao

The Agricultural and Biological School, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China

Secondary metabolites of endophytic fungi FSN002 fromMaximhave excellent liver cancer resistance. Preparation of mutant strains is an important means to study the biosynthesis mechanism of catalitaxol. Fungal spores germinating young hyphae with 4 to 6 cells after culturing for 13 hours were used as starting materials of ultraviolet (UV) mutagenesis. UV light intensity and irradiation time have a linear relationship with fungal mortality. The two factors had no obvious interactions. When UV light was 90 000 μJ/cm2and irradiation time for 6 s, the mortality of fungi was around 95%. Under the optimization mutation condition, two mutant strains were obtained, of which one lost the synthesis ability of catalitaxol completely, and the another synthetized only 16% catalitaxolof the wild strain. Our findings may serve basis for further study on the biosynthesis mechanism and efficient production of catalitaxol.

ultraviolet mutagenesis, endophytic fungi,mutant strains, mortality, catalitaxol, antitumor metabolites

November 15, 2016; Accepted: December 22, 2016

Kexuan Tang. E-mail: kxtang@sjtu.edu.cn Zhiqi Miao. Tel: +86-21-34205017; E-mail: zamiao@sjtu.edu.cn

10.13345/j.cjb.160447

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30700061), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (No. 144319057001), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2015CB755700).

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 30700061)，上海市科技支撐項(xiàng)目(No. 144319057001)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973 Program) (No. 2015CB755700) 資助。

2017-01-09

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170109.1246.004.html