許女，張?zhí)煺?，陳旭峰，張浩，王如?/p>

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雞腿菇子實體多糖的分離純化、理化性質(zhì)及抗氧化活性

許女，張?zhí)煺?，陳旭峰，張浩，王如?/p>

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷 030801

許女, 張?zhí)煺? 陳旭峰, 等. 雞腿菇子實體多糖的分離純化、理化性質(zhì)及抗氧化活性. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(5): 808–816.Xu N, Zhang TZ, Chen XF, et al. Separation, purification and antioxidant activity of polysaccharide from Coprinus comatus. Chin J Biotech, 2017, 33(5): 808–816.

本研究對水溶醇沉法提取的雞腿菇粗多糖脫蛋白方法進行了比較，最終確定Sevage法為最優(yōu)的脫蛋白方法。經(jīng)DEAE-纖維素52離子交換及Sephadex G-200分子層析柱分級、純化，最終得到2個主要的多糖組分Ccp-I-A和Ccp-I-B。理化性質(zhì)測定結(jié)果表明，二者均為白色絮狀固體，能溶于水，不溶于無水乙醇、丙酮等有機溶劑；與斐林試劑，CTAB、硫酸-咔唑、碘-碘化鉀及三氯化鐵反應(yīng)均為陰性。GC測定結(jié)果可知Ccp-I-A主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為2.03∶9.52∶1；Ccp-I-B主要由巖藻糖和半乳糖組成，其摩爾比為1∶5.21。另外，Ccp-I-A和Ccp-I-B對DPPH和·OH顯示出良好的清除能力，而且，相比于Ccp-I-B，Ccp-I-A的清除能力更高，當(dāng)濃度為300 μg/mL，其對DPPH和·OH的清除能力可分別達(dá)到72.1%和55.3%。

雞腿菇多糖，純化，理化性質(zhì)，抗氧化

雞腿菇，學(xué)名毛頭鬼傘，是一種名貴的食用和藥用真菌，味甘滑性平，有益脾、清心安神，經(jīng)常食用有助消化、增加食欲和治療痔瘡[1]?，F(xiàn)代研究結(jié)果還證實其具有降血糖[2-3]、提高免疫活性[4-5]和抗腫瘤[6]等生物學(xué)功能。雞腿菇子實體含有豐富的糖類，總糖含量為57.65%，其中還原糖的含量為53.54%，多糖含量為4.11%，是雞腿菇發(fā)揮生理功能的重要組成成分[7]。

目前關(guān)于雞腿菇多糖活性的研究，大都是采用其多糖粗提物[8-9]，并未對純化、分級后的多糖各組分進行系統(tǒng)研究，而關(guān)于其單糖組分、物理化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)解析更加鮮有報道。本文主要對雞腿菇子實體多糖組分進行了分離純化，初步研究各多糖組分的理化性質(zhì)及抗氧化生物活性，以期為雞腿菇子實體多糖的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

雞腿菇子實體干粉由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌中心提供。DEAE-纖維素52購于Whatman公司。Sephadex G-200購于Pharmacia公司。DPPH購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

F22E型可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；HL-1型恒流泵(上海青浦滬西儀器廠)；真空冷凍干燥機(德國KENDRO公司)；TDL-4低速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HHS-21-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；R201D-11旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城工貿(mào)有限公司)；GC-2010型氣相色譜儀(日本島津儀器公司)。

1.3 方法

1.3.1 雞腿菇子實體多糖的提取

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的雞腿菇子實體的干粉，放入圓底燒瓶中，按照料液比為1∶25加入蒸餾水，混合均勻，在90 ℃水浴條件下浸提4 h，重復(fù)提取2次后，4 000 r/min離心15 min，取上清液，加入3倍體積的95%乙醇，4 ℃下醇沉過夜，之后4 000 r/min離心15 min，取沉淀真空冷凍干燥，研缽研碎即雞腿菇粗多糖樣品。采用苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍(lán)染色法進行多糖和蛋白質(zhì)含量的測定。

1.3.2 雞腿菇子實體多糖的脫蛋白方法

Sevage法脫蛋白：將1.3.1中得到的粗多糖樣品配制成1%的粗多糖溶液，將粗多糖溶液與Sevage試劑(氯仿：正丁醇=4∶1) 按4∶1的比例混勻，振蕩20 min后靜置30 min，3 500 r/min離心20 min去沉淀，測定上清液中多糖含量和蛋白質(zhì)含量。

三氯乙酸(TCA) 法脫蛋白：將1.3.1中得到的粗多糖樣品配制成1%的粗多糖溶液，向粗多糖溶液中加入終濃度為12%的TCA，振蕩20 min后靜置30 min，3 500 r/min離心15 min去沉淀，測定上清中多糖和蛋白質(zhì)的含量。

雞腿菇子實體多糖的柱層析：DEAE-纖維素52離子交換柱層析：雞腿菇粗多糖經(jīng)Sevage法去除蛋白質(zhì)后，流水透析48 h (除去無機離子、低聚糖等雜質(zhì))，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，使其濃度達(dá)到10 mg/mL。將1 mL濃縮好的雞腿菇糖液加到處理好的DEAE-纖維素52離子交換柱(30 cm×2.0 cm) 中，依次用濃度為0.15、0.25、0.35、0.45 mol/L NaCl的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4) 進行分段梯度洗脫，洗脫速率為36 mL/h，每管3 mL分布收集，每個梯度收集10管，即每個梯度的洗脫體積為30 mL。采用苯酚-硫酸法逐管檢測多糖含量。

Sephadex G-200凝膠柱層析：經(jīng)DEAE-纖維素52離子交換層析后得到的多糖峰值管中的收集液合并，濃縮5倍后經(jīng)Sephadex G-200層析柱(50 cm×1.0 cm) 層析，上樣量為1 mL，用0.005 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.2) 進行洗脫，采用苯酚-硫酸法逐管檢測多糖含量。

1.3.3 多糖基本理化性質(zhì)

測試純化后的雞腿菇多糖Ccp-I-A和Ccp-I-B在水、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿、正丁醇等有機溶劑中的溶解度，進行斐林試劑反應(yīng)，三氯化鐵反應(yīng)，CTAB反應(yīng)和硫酸-咔唑反應(yīng)，碘-碘化鉀反應(yīng)[10]。

1.3.4 多糖的單糖組成分析

取待分析的Ccp-I-A和Ccp-I-B多糖樣品10 mg于10 mL離心管中，加入2 mL CF3COOH (TFA)，充氮氣封管于120 ℃下油浴3 h。減壓蒸干水解液，加甲醇反復(fù)處理5次，以除盡CF3COOH，真空干燥水解物，然后進行衍生化。

衍生物的制備(糖腈乙酰酯化衍生法)：稱取10 mg固體水解糖樣、10 mg鹽酸羥胺和1 mL無水吡啶，待溶解后于90 ℃下水浴反應(yīng)30 min并間歇振蕩。取出后冷卻至室溫，加入1 mL無水醋酸酐，于90 ℃下繼續(xù)水浴反應(yīng)30 min進行乙?；?。取出后在冰浴中迅速冷卻，加入1 mL蒸餾水?dāng)嚢瑁寐确螺腿?次，合并氯仿層，減壓蒸干。

樣品用1 mL氯仿溶解后，用0.22 μm有機微孔濾膜過濾備用。

氣相色譜檢測條件如下：

色譜柱：毛細(xì)管柱DB-17，30 m，I.D. 0.25 μm；載氣：N2，流速：30 mL/min；燃?xì)猓篐2，流速：40 mL/min；助燃?xì)猓嚎諝猓魉伲?00 mL/min；分流比：100∶1；檢測器：FID1；汽化室溫度：320 ℃；檢測器溫度：320 ℃；色譜柱溫度：190 ℃。

1.3.5 抗氧化活性

總還原能力的測定：參考Oyaizu等[11]的方法并略做改動。基本操作步驟為：1 mL樣品溶液，加入2.5 mL的0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.6)和2.5 mL 1% K3[Fe(CN)6]于試管中混勻，50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，迅速冷卻并加入2.5 mL 10% TCA，混勻后3 500 r/min離心10 min，取3 mL上清液加入0.6 mL 0.1% FeCl3混勻，再加3 mL蒸餾水搖勻，波長700 nm測定。以蒸餾水為空白對照，Vc為陽性對照。

DPPH自由基清除能力測定：取3 mL樣品溶液，加入1 mL無水乙醇配制的DPPH溶液，振蕩后室溫條件下放置于暗處30 min，用無水乙醇調(diào)零，于517 nm波長處測定其吸光度(1)；空白組用3 mL無水乙醇代替樣品溶液，其余處理同上，在517 nm下測定吸光度(0)；對照組用1 mL無水乙醇代替DPPH溶液，其余處理同上，在517 nm下測定吸光度(2)；以Vc作陽性對照。

DPPH自由基清除率(%)=(1–)×100

羥自由基(·OH) 自由基清除能力測定[12]：取1 mL樣品溶液，加入1 mL硫酸亞鐵溶液 (9 mmol/L)，1 mL 水楊酸乙醇溶液(9 mmol/L) 和1 mL過氧化氫溶液(0.03%，/)，37 ℃反應(yīng)30 min，3 500 r/min離心15 min后得上清，于510 nm處測定吸光度(1)；空白組以1 mL蒸餾水代替樣品溶液，其余處理同上，于510 nm下測定吸光度(0)；對照組以1 mL蒸餾水代替過氧化氫溶液，其余處理同上，在510 nm下測定吸光度(2)；以Vc作陽性對照。

·OH清除率/%=(1–)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種脫蛋白方法的比較

2.1.1 Sevage法脫蛋白

多糖中蛋白質(zhì)的存在形式主要有兩種，一是游離蛋白，另一種是與糖鏈結(jié)合成糖蛋白或糖肽。多糖脫蛋白主要以脫除游離蛋白為主。Sevage法脫蛋白具有條件溫和、能夠有效避免多糖降解等優(yōu)點，是比較經(jīng)典的脫蛋白方法。由圖1可知，雞腿菇多糖中蛋白質(zhì)的脫除率隨著脫蛋白次數(shù)的增加而增加，當(dāng)用此法重復(fù)脫蛋白3次以后，蛋白脫除率的增加幅度漸趨于平緩；而多糖保留率隨著脫蛋白次數(shù)的增加而降低，用Sevage法脫蛋白3次，此時蛋白質(zhì)脫除率為61.30%，多糖保留率為53.12%。

2.1.2 TCA法脫蛋白

TCA法脫蛋白的結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，雞腿菇多糖中蛋白質(zhì)的脫除率隨脫蛋白次數(shù)的增加而提高，當(dāng)用此法重復(fù)脫蛋白2次以后，蛋白脫除率的增加幅度漸趨于平緩，而多糖保留率隨脫蛋白次數(shù)的增加而降低，因此選擇用TCA法脫蛋白2次，此時蛋白質(zhì)脫除率為72.27%，多糖保留率為59.23%。

表1試驗結(jié)果顯示采用Sevage法脫蛋白3次后得到的雞腿菇多糖的抗氧化活性明顯強于采用TCA法脫蛋白2次后的多糖。TCA法是根據(jù)蛋白質(zhì)在有機溶劑中容易變性沉淀的特點將其除去，具有蛋白脫除率高、操作簡單等優(yōu)點。然而用此法脫除蛋白質(zhì)時，低濃度的TCA可使變性蛋白在沉淀過程中吸附部分多糖，從而導(dǎo)致多糖的損失；高濃度的TCA會同時沉淀變性的游離蛋白和部分糖肽，并且會引起糖鏈的斷裂導(dǎo)致部分多糖降解，進而對多糖的活性造成不利影響[6]。因此從保護多糖活性等角度出發(fā)，本文采用Sevage法脫蛋白。

圖1 Sevage法脫蛋白結(jié)果

圖2 TCA法脫蛋白結(jié)果

表1 采用兩種方法脫蛋白后的雞腿菇多糖的抗氧化活性比較

Ccp-S3: deproteinization three times by Sevage method; Ccp-T2: deproteinization two times by TCA method.

2.2 雞腿菇多糖的柱層析

2.2.1 DEAE-纖維素52離子交換層析

將經(jīng)過脫蛋白和透析處理的雞腿菇多糖樣品，按照1.3.2中的方法進行DEAE-纖維素52離子交換層析，梯度洗脫，每個梯度收集10管，每管3 mL，用苯酚-硫酸法跟蹤監(jiān)測多糖含量，得到洗脫曲線，見圖3。其中1–10管為0.15 mol/L NaCl洗脫收集的組分，10–20管為0.25 mol/L NaCl洗脫收集的組分，20–30管為0.35 mol/L NaCl洗脫收集的組分，30–40管為0.45 mol/L NaCl洗脫收集的組分。共收集到3個主要洗脫峰依次命名為Ccp-I、Ccp-Ⅱ和Ccp-Ⅲ。

2.2.2 Sephadex G-200凝膠層析

將經(jīng)DEAE-纖維素52離子交換層析柱純化后所得主要多糖洗脫峰Ccp-I (9–14管) 合并收集，濃縮5倍過Sephadex G-200層析柱，用0.005 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.2) 進行洗脫，苯酚-硫酸法跟蹤監(jiān)測多糖含量，洗脫曲線如圖4。收集到2個主要洗脫峰Ccp-I-A和Ccp-I-B。

2.3 雞腿菇多糖的一般理化性質(zhì)

雞腿菇純化多糖Ccp-I-A和Ccp-I-B的一般理化性質(zhì)測定結(jié)果如表2所示。Ccp-I-A和Ccp-I-B均為白色絮狀固體，能溶于水，不溶于無水乙醇、乙醚、丙酮、氯仿及正丁醇等有機溶劑；兩種多糖與斐林試劑和三氯化鐵反應(yīng)均為陰性，說明不含游離單糖和多酚類物質(zhì)；與CTAB和硫酸-咔唑反應(yīng)陰性，說明不含有糖醛酸；與碘-碘化鉀反應(yīng)陰性，說明不是淀粉類 多糖。

圖3 DEAE-52離子交換柱梯度洗脫圖

圖4 Sephadex G-200柱層析洗脫圖

表2 雞腿菇多糖的一般理化性質(zhì)

Note：“–”, negative.

2.4 雞腿菇多糖的單糖組成

雞腿菇純化多糖Ccp-I-A樣品經(jīng)酸水解并進行糖腈乙酸酯衍生化，在1.3.4的檢測條件下所得結(jié)果如圖5和圖6所示。各單糖峰面積/對應(yīng)分子量所得的比值即為各單糖的摩爾比，由分析可知，Ccp-I-A由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為2.03∶9.52∶1。相似地，吳艷兵等[13]采用高效陰離子色譜法(HPAEC)，對經(jīng)乙醇分級沉淀及DEAE Sephadex A-25離子交換純化后的雞腿菇子實體多糖組分CCP60中的單糖組成進行分析，結(jié)果表明其主要由葡萄糖和半乳糖組成。

Ccp-I-B由巖藻糖和半乳糖組成，其摩爾比為1∶5.21。姚毓婧等[14]也對雞腿菇子實體多糖組分CC30w-l完全酸水解后進行HPAEC-PAD分析，結(jié)果表明其主要由巖藻糖和半乳糖組成，其摩爾比為1∶4.02。Fan等[15]也曾在雞腿菇菌絲體中獲得巖藻半乳聚糖。另外，其他真菌也曾被報道存在巖藻半乳聚糖，如樹舌中的巖藻半乳聚糖[16]、擬層孔菌屬[17]、絨狀火菇s[18]、豬苓[19]、火絨蕈和桑黃[20]中的甘露巖藻半乳聚糖，以及硫磺多孔菌[21]中的巖藻甘露半乳聚糖。

圖5 Ccp-I-A多糖樣品的氣相色譜圖

圖6 Ccp-I-B多糖樣品的氣相色譜圖

2.5 雞腿菇多糖兩種組分的體外抗氧化活性

2.5.1 Ccp-I-A和Ccp-I-B對DPPH的清除作用

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，且在乙醇溶液中517 nm處存在最大吸收峰。當(dāng)DPPH遇到抗氧化劑等能提供質(zhì)子的物質(zhì)時，自由基被清除同時吸光度值降低。圖7為不同濃度下為Ccp-I-A和Ccp-I-B對DPPH的清除作用，可見，隨著雞腿菇多糖組分的濃度越高，對DPPH的清除作用越強，當(dāng)濃度為300 μg/mL時，Ccp-I-A和Ccp-I-B對DPPH的清除率分別為72.1%和38.6%，高于分級純化前Ccp-S3 (27.1%) 的清除率，其中，Ccp-I-A對DPPH的清除率與VC相當(dāng)(70%) (表1)。本文中報道的Ccp-I-A對DPPH的清除率高于文獻(xiàn)[22]報道中平菇多糖分級組分PSPO-1a (41%，1 mg/mL) 的清除率，但低于靈芝菌糠[23]及茶樹菇多糖[24]分級組分GRPS-2 (74.21%，100 μg/mL) 和EPS-2 (88%，100 μg/mL)對DPPH的清除率。

2.5.2 Ccp-I-A和Ccp-I-B對·OH的清除作用

Ccp-I-A和Ccp-I-B對·OH的清除作用見圖8，由圖8可知雞腿菇多糖組分對羥基自由基的清除效果也與濃度呈正相關(guān)。在濃度為300 μg/mL時，Ccp-I-A和Ccp-I-B對·OH自由基的清除率分別為55.3%和15.5%，高于分級純化前Ccp-S3 (10.1%) 的清除率，而且，Ccp-I-A對·OH自由基的清除率高于VC(30%) (表1)。本文中報道的Ccp-I-A和Ccp-I-B對DPPH的清除率高于文獻(xiàn)[22]中報道的平菇多糖的分級組分PSPO-1a (10.5%，2.5 mg/mL)[22]的清除率；但低于靈芝菌糠[23]及茶樹菇多糖[24]分級組分GRPS-2 (69.94%，100 μg/mL) 和EPS-2 (90%，100 μg/mL) 對羥基自由基的清除率。

2.5.3 Ccp-I-A和Ccp-I-B的還原力測定

如圖9所示，在300 μg/mL時，Ccp-I-A和Ccp-I-B在700 nm處測得的還原力分別為0.55和0.22，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同濃度下Vc的還原力(1.2) (表1)，并且也低于文獻(xiàn)報道中靈芝菌糠和茶樹菇多糖分級組分GRPS-2 (0.42，100 μg/mL) 和EPS-2 (0.91，100 μg/mL) 的還原力[23-24]。

圖7 雞腿菇多糖組分對DPPH的清除作用

圖8 雞腿菇多糖對·OH自由基的清除作用

圖9 雞腿菇多糖的還原力

經(jīng)分級純化后多糖組分的抗氧化活性可能降低，也可能升高。對于前者，一方面可能是因為粗多糖在分級純化過程中除去了許多具有抗氧化能力的糖蛋白、糖肽等活性成分而導(dǎo)致整體抗氧化能力下降[25]；另一方面也可能是由于粗多糖中各級組分的協(xié)同作用使其具有較強的抗氧化能力，經(jīng)柱層析分離后此協(xié)同作用減弱所致。對于后者，層析分級步驟使得某些具有強氧化活性的多糖單元等組分得到了富集與純化，使得單位濃度的活性增強。另外，經(jīng)柱層析分級純化后的各種多糖組分的抗氧化活性大小也不相同，這可能與其各自的空間結(jié)構(gòu)、所含糖單元類型及糖苷鍵構(gòu)型、取代基不同有關(guān)[26]。

今后需對雞腿菇兩個分離純化后的多糖組分進行進一步的結(jié)構(gòu)解析及抗氧化活性的動物實驗，深入研究其構(gòu)效關(guān)系，為其作為天然抗氧化劑奠定一定理論基礎(chǔ)，也為雞腿菇水溶性多糖藥物的開發(fā)及相關(guān)功能性食品的研制開辟一條新的路徑。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Separation, purification and antioxidant activity of polysaccharide from

Nü Xu, Tianzhen Zhang, Xufeng Chen, Hao Zhang, and Rufu Wang

Food Science and Engineering College, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi,China

We compared the ways of deproteinization for crude polysaccharides of, and finally selected Sevage method as the optimal method. Two main fractions of Ccp-I-A and Ccp-I-B were obtained after DEAE-52 cellulose and Sephadex G-200 chromatography, both were white-floc, soluble in water, insoluble in absolute ethyl alcohol, acetone and other organic solvents. Additionally, Fehling reagent, CTAB, Sulphuric acid-carbazole, I-KI and FeCl3reaction were all negative. GC analysis showed Ccp-I-A was composed of mannitose, glucose and galactose in molar ratios of 2.03:9.52:1, whereas Ccp-I-B was composed of fucose and galactose with molar ratios of 1:5.21. Antioxidant activity test showed that Ccp-I-A and Ccp-I-B had good scavenging abilities on DPPH and ·OH. Compared to Ccp-I-B,the scavenging activity of Ccp-I-A was much stronger, and the scavenging rate could reach 72.1% and 55.3% respectively when the concentration was 300 μg/mL.

polysaccharides, purification, physico-chemical property, antioxidation

November 10, 2016; Accepted:March 15, 2017

Rufu Wang. Tel: +86-354-6288325; E-mail: wrf558@126.com

10.13345/j.cjb.160440

Supported by: Research and Development Projects of Shanxi Provincial Science and Technology (No. 2015-TN-10).

山西省科技重點研發(fā)計劃項目 (No. 2015-TN-10) 資助。