羅婉冰，林秋鵬，李曉霞，周澤嬌，陽輝勇，杜榮裕，李洪清

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采用Ⅰ酶粗提物高效鑒定CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因突變

羅婉冰，林秋鵬，李曉霞，周澤嬌，陽輝勇，杜榮裕，李洪清

華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院廣東省植物發(fā)育與生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510631

羅婉冰, 林秋鵬, 李曉霞, 等. 采用CELⅠ酶粗提物高效鑒定CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因突變. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(5): 775–784.Luo WB, Lin QP, Li XX, et al. Efficient identification of gene knockout mutant mediated by CRISPR/Cas9 by CELⅠ crude extracts. Chin J Biotech, 2017, 33(5): 775–784.

CRISPR/Cas9是新興的基因組編輯技術(shù)，該技術(shù)操作簡單、效率高，已成為目前最主流的基因組編輯技術(shù)。利用該技術(shù)進(jìn)行突變體創(chuàng)制，對基因功能研究和育種應(yīng)用具有重要的意義，而快速、高效、低成本的基因編輯個體鑒定是其中的重要環(huán)節(jié)。本研究對影響Ⅰ粗提物鑒定CRISPR/Cas9介導(dǎo)的水稻基因編輯個體的條件，包括蛋白用量及作用時間、PCR反應(yīng)緩沖液等條件進(jìn)行了探索，并將整個檢測體系集成于一管操作。同時，采用Ⅰ粗提物檢測了CRISPR/Cas9介導(dǎo)水稻突變的T0代植株及后代，對雜合突變、純合突變及雙等位突變的鑒定策略進(jìn)行了探討；該方法檢測正確率經(jīng)測序驗(yàn)證達(dá)100%。上述結(jié)果表明，采用Ⅰ粗提物檢測突變體與已有方法比較具有廉價、快速和高效的特點(diǎn)。

Ⅰ粗提物，CRISPR/Cas9，突變體，鑒定，

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，許多物種的全基因組測序工作已經(jīng)完成。闡明基因的功能及構(gòu)建基因調(diào)控和互作網(wǎng)絡(luò)成為現(xiàn)階段的主要任務(wù)。構(gòu)建基因突變個體是十分有效的基因功能研究手段?；蚪M編輯技術(shù)的出現(xiàn)，使得快速、高效地定點(diǎn)突變目的基因成為可能。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌的免疫系統(tǒng)，其主要作用是防御外來質(zhì)粒或噬菌體DNA的入侵。科學(xué)家在大腸桿菌發(fā)現(xiàn)了特殊的成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列[1]，并于2002年正式將其命名為CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)[2]。2013年，雜志同期刊登了兩篇關(guān)于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除的文獻(xiàn)，首次報道了CRISPR/Cas9系統(tǒng)可用于人類和小鼠細(xì)胞的基因組編輯，證明了CRISPR技術(shù)可用于編輯高等真核基因組[3-4]。此后，CRISPR技術(shù)也被應(yīng)用到植物基因組編輯中，并在模式植物擬南芥、煙草以及小麥、水稻、高粱、玉米等重要農(nóng)作物中獲得成功[5-10]，并且證明了產(chǎn)生的編輯可以在植物中穩(wěn)定遺傳[11]。此外，基因編輯過的植物可以通過自交、回交等手段，獲得不帶CRISPR元件的基因編輯株[12]。CRISPR/Cas9引入突變的方式是通過sgRNA識別靶位點(diǎn)，利用Cas9的核酸內(nèi)切酶活性使靶位點(diǎn)DNA的雙鏈發(fā)生斷裂 (Double-strand breaks，DSBs)，從而激活個體自身修復(fù)機(jī)制。編輯個體可以通過非同源末端連接介導(dǎo)的修復(fù)方式 (Non-homologous end joining，NHEJ) 和同源重組介導(dǎo)的修復(fù)方式 (Homology-directed repair，HDR) 對雙鏈斷裂處進(jìn)行修復(fù)[13]。通過NHEJ介導(dǎo)的修復(fù)方式進(jìn)行修復(fù)時，斷裂的DNA末端重新連接，這種非精確的修復(fù)會導(dǎo)致在斷裂位置上產(chǎn)生少量核苷酸的插入或刪除，進(jìn)而產(chǎn)生突變[14]。CRISPR技術(shù)與傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)相比突變效率更高，與ZFN、TALEN等基因組編輯技術(shù)相比具有耗時更短、操作簡單等特點(diǎn)，因此已被廣泛用于突變體的構(gòu)建。由于編輯效率的限制，通過CRISPR技術(shù)產(chǎn)生的大量編輯個體仍需通過進(jìn)一步的篩選鑒定，因此建立快速、高效和低成本的鑒定體系尤為重要。

Ⅰ酶是芹菜中發(fā)現(xiàn)的可以特異識別DNA雙鏈中的錯配位點(diǎn)并切割雙鏈的核酸內(nèi)切酶[15]。研究表明，芹菜Ⅰ酶粗提物可以用于點(diǎn)突變的檢測[16-17]。利用該酶的特點(diǎn)，可以有效鑒定CRISPR突變體。本文以水稻為材料構(gòu)建了基因和基因的突變體，利用Ⅰ酶粗提物進(jìn)行鑒定，并對鑒定條件進(jìn)行了優(yōu)化，將PCR反應(yīng)、產(chǎn)物變性、復(fù)性處理和Ⅰ酶切整合在一管中進(jìn)行，結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳，建立了一種快速、高效和廉價的突變體檢測系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻“中花11” (L.) 由本實(shí)驗(yàn)室保存。水稻突變株由本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制[18]。r聚合酶、LA聚合酶緩沖液購自大連TaKaRa生物有限公司。B聚合酶、KOD聚合酶均購自東洋紡 (上海) 生物科技有限公司。大腸桿菌感受態(tài)菌株JM109、根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)菌株EHA105為本實(shí)驗(yàn)室保存。CRISPR載體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授提供[19]。限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自大連TaKaRa生物有限公司。質(zhì)粒抽提試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品。引物合成由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。測序由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。蛋白濃度測定BCA試劑盒由碧云天生物技術(shù)公司提供。

1.2 方法

1.2.1Ⅰ酶粗提及蛋白質(zhì)濃度測定

蒸餾水沖洗芹菜后，用無菌吸水紙擦干，去掉根部，用榨汁機(jī)榨取并收集汁液，在4 ℃的條件下用Bradley等的方法[20]進(jìn)行Ⅰ酶的粗提取，提取物保存于–20 ℃?zhèn)溆?。蛋白測定的方法采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行測定，調(diào)整蛋白濃度至1 μg/μL。

1.2.2 構(gòu)建水稻突變用的CRISPR/Cas9載體

為端粒結(jié)合蛋白CST復(fù)合體中的組分，是染色體末端的保護(hù)蛋白[21-22]。為了突變水稻中基因，首先設(shè)計(jì)用于構(gòu)建CRISPR載體的spacer序列，其gRNA靶位點(diǎn)位于基因CDS序列的第100 bp (圖1)，兩條接頭互補(bǔ)序列見表1。

圖1 CRISPR載體圖譜和stn1的CRISPR靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

表1 本研究所用的引物

將所需接頭引物等量混合，經(jīng)變、復(fù)性處理，與Ⅰ酶切的載體相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取陽性菌株的質(zhì)粒，測序。將確認(rèn)無誤的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，獲得含有用于水稻突變的農(nóng)桿菌菌株EHA105/CRISPR。

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻

參照Li等[18]的方法，利用農(nóng)桿菌EHA105/ CRISPR轉(zhuǎn)化水稻品種中花11的愈傷組織，用潮霉素篩選獲得再生組培苗。組培苗經(jīng)煉苗后，移栽盆缽，即為T0代植株。按轉(zhuǎn)基因水稻種植要求嚴(yán)格管理。

1.2.4 擴(kuò)增及突變位點(diǎn)所在片段

提取水稻葉片的基因組DNA，以引物組合-Fw/-Re和-Fw/-Re進(jìn)行PCR擴(kuò)增，理論產(chǎn)物長度約為948 bp和491 bp。反應(yīng)體系包括基因組DNA 1μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs (2 mmol/L) 2.5 μL，上游引物 (10 μmol/L) 1 μL，下游引物 (10 μmol/L) 1 μL，DNA polymerase 1 U，補(bǔ)去離子水到25 μL。PCR反應(yīng)的參數(shù)設(shè)置如下：94 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行35個循環(huán)的PCR擴(kuò)增 (94 ℃，30 s；退火溫度，30 s；72 ℃，1 min)，最后72 ℃延伸10 min。其中退火溫度為65 ℃，的退火溫度為55 ℃。

1.2.5Ⅰ酶粗提物切割PCR產(chǎn)物

轉(zhuǎn)化株DNA經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，將產(chǎn)物(或加入等量的野生型DNA擴(kuò)增產(chǎn)物) 進(jìn)行變、復(fù)性處理，再向其中加入Ⅰ酶，42 ℃溫育，用EDTA終止反應(yīng)。取10 μL樣品進(jìn)行電泳檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1Ⅰ酶粗提物用于突變體的檢測

是水稻直立密穗控制基因[23]，本論文突變株由本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制，測序結(jié)果表明，該植株為雙位點(diǎn)突變 (–2/–5) (圖2)。為檢測Ⅰ酶粗提物是否能切割異源雙鏈DNA，取1 μLⅠ酶粗提物直接加入到經(jīng)變性、復(fù)性處理的PCR樣品中，與不加Ⅰ酶的樣品進(jìn)行對比。電泳結(jié)果顯示Ⅰ酶可以切割異源雙鏈DNA，切出條帶符合預(yù)期大小，證明Ⅰ酶粗提物適用于點(diǎn)突變的檢測。

圖2 dep1-29突變株突變位點(diǎn)的測序結(jié)果和CELⅠ酶切檢測結(jié)果 (dep1-29 a和dep1-29 b表示dep1-29突變株包含雙等位突變的兩種突變類型)

2.2Ⅰ酶用量及作用時間的優(yōu)化

酶的用量是影響酶切效果的重要因素。因此，采用不同Ⅰ酶粗提物的量對來源于的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切 (圖3)，結(jié)果表明，粗提物總蛋白用量在0.1 μg時，酶切效果達(dá)到最佳。增加粗提物的用量，酶切效果不會有顯著提升。

酶切時間是影響酶切效果的另一重要因素。采用0.1 μgⅠ酶對突變體材料的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切 (圖3)。結(jié)果表明，Ⅰ酶作用10 min時可以見到酶切的條帶，隨著時間增加，Ⅰ酶的切割效率逐漸提升，在40 min時達(dá)到最佳。繼續(xù)增加時間并不能提升Ⅰ酶的切割效率。

2.3 PCR體系對Ⅰ切割效率的影響

簡便、快捷的突變體鑒定方法要求采用Ⅰ粗提物在合適的PCR緩沖體系中進(jìn)行酶切。因此，首先選擇目前普遍使用的聚合酶和緩沖系統(tǒng)(r聚合酶、LA聚合酶、Blend聚合酶、KOD聚合酶) 進(jìn)行實(shí)驗(yàn) (圖4)。結(jié)果表明，KOD酶的擴(kuò)增效果最佳，但Ⅰ酶在該體系中的切割效果不理想。B酶體系和r酶體系中PCR擴(kuò)增效果差，電泳檢測時不能看見1 000 bp處的條帶。LA酶體系能夠擴(kuò)增到片段，且Ⅰ酶在該體系中表現(xiàn)出了切割活性。進(jìn)一步通過采用LA buffer與不同的酶組合，發(fā)現(xiàn)B與 LA buffer組合可以提高PCR 的效率和保證Ⅰ的酶切活性。

圖3 CEL Ⅰ酶粗提物用量及酶切時間對突變鑒定的影響

圖4 不同PCR體系對CELⅠ粗提物酶切效率的影響

2.4Ⅰ酶對CRISPR介導(dǎo)的基因敲除株突變進(jìn)行分型

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，我們將-CRISPR轉(zhuǎn)化水稻，獲得35個獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系。由于轉(zhuǎn)基因株中可能含有無突變、雜合突變、純合突變及雙位點(diǎn)突變等多種類型，我們根據(jù)Ⅰ酶能切割異源DNA雙鏈的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了兩種方法對上述類型進(jìn)行區(qū)分：1) 將PCR產(chǎn)物直接變性、復(fù)性、酶切；2) 將PCR產(chǎn)物與野生型植株的PCR產(chǎn)物等量混合，變性、復(fù)性，再用Ⅰ酶切。和是通過的-CRISPR轉(zhuǎn)化獲得的兩個突變株系。其中的PCR產(chǎn)物變、復(fù)性后可以被Ⅰ酶切割，其PCR產(chǎn)物與野生型植株P(guān)CR產(chǎn)物混合變、復(fù)性后也可以被Ⅰ酶切割，說明突變株為雜合突變或雙位點(diǎn)突變。的PCR產(chǎn)物變、復(fù)性后不能被Ⅰ酶切割，其PCR產(chǎn)物與野生型植株P(guān)CR產(chǎn)物混合變、復(fù)性后可以被Ⅰ酶切割，說明該突變株為純合突變。對上述兩個突變株P(guān)CR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并挑單克隆進(jìn)行測序，結(jié)果表明突變株存在兩種突變類型 (–3 bp/–1 bp)，而為單堿基缺失的純合突變 (–1 bp/–1 bp)。以上結(jié)果表明，Ⅰ酶不僅可以快速鑒定突變體，而且可以對不同的類型進(jìn)行有效區(qū)分 (圖5)。

2.5Ⅰ酶策略檢測CRISPR介導(dǎo)的基因突變株及驗(yàn)證

為驗(yàn)證Ⅰ酶策略檢測的正確率，利用該策略對CRISPR介導(dǎo)的突變的T0代植株 (已測序) 進(jìn)行酶切檢測。結(jié)果表明，其中#4、#9、#17為純合突變植株，#8為野生型植株，其余植株為雜合體或雙等位突變體或嵌合體 (圖6)。Ⅰ酶檢測結(jié)果與測序結(jié)果對比完全一致。以上結(jié)果表明利用Ⅰ酶策略在本次實(shí)驗(yàn)中的正確率達(dá)100%，表明該方法是一種非常理想的檢測CRISPR突變株的方法。

圖5 CELⅠ酶檢測兩種不同突變類型的突變株 (A：stn1-1和stn1-4兩種突變株的測序結(jié)果；B：利用CEL Ⅰ酶策略檢測雜合和純合突變株)

圖6 CEL Ⅰ酶策略檢測CRISPR介導(dǎo)的stn1基因突變株

3 討論

3.1Ⅰ酶策略與其他方法用于鑒定CRISPR基因敲除株的比較

Ⅰ酶具有切割異源雙鏈中非配對堿基位點(diǎn)的特性，該特性已被廣泛用于突變體的鑒定，本研究采用Ⅰ的粗提物，通過優(yōu)化酶的用量、作用時間、PCR反應(yīng)系統(tǒng)及采用檢測方法，建立了一個廉價、高效的檢測CRISPR方法創(chuàng)制的突變體，并且所有集成于一管的檢測方法，其正確率達(dá)100%。該方法可以廣泛用于CRISPR基因敲除個體初篩及后代鑒定。

商品化的產(chǎn)品Ⅰ價格較高，單個樣品檢測成本大于3元人民幣，而Ⅰ粗提物來源于廉價的芹菜，從600 g材料就能得到15–20 mL的蛋白粗提物，每次用量也只需0.5 μL，一次提取的量至少可用于30 000個樣品的鑒定。與采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法相比[24]，采用Ⅰ酶的方法，只需要使用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，操作更加方便、省時。而且，采用Ⅰ酶粗提物時，我們擴(kuò)增PCR產(chǎn)物一般為1 kb左右，有利于檢測大片段的缺失。

T7E1法[25]與Ⅰ策略法非常相似，其工作原理與Ⅰ法相同，都是通過錯配酶識別并切割異源雙鏈DNA，從而達(dá)到基因型分型的目的。該方法也是目前廣泛應(yīng)用的CRISPR突變個體檢測方法。相比于Ⅰ而言，該方法商品化程度更高，應(yīng)用面更廣。然而在大量樣品的檢測篩選方面，Ⅰ酶策略只需要獲得芹菜粗提物，大大降低了成本，更能適應(yīng)大量樣品的篩選，表現(xiàn)出比T7E1更高的性價比。

PCR-SSCP是一種簡單、快速的點(diǎn)突變篩查手段[26]，其技術(shù)原理是PCR擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈DNA，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時形成不同的立體構(gòu)象，其構(gòu)象直接影響泳動速率，相同長度的DNA單鏈其核苷酸序列僅有單個堿基的差別，就可以產(chǎn)生立體構(gòu)象的不同，產(chǎn)生不同的泳動帶。PCR-SSCP的缺點(diǎn)是存在假陰性和假陽性，對長度不超過300 bp的待測片段的檢出率為70%–80%。與PCR-SSCP相比，Ⅰ粗提物檢測法只需要簡單的瓊脂糖凝膠電泳，而且可檢測片段不受長度限制，檢出突變的效率高。

PCR/RE (PCR/restriction enzyme) 檢測法是將靶點(diǎn)切割位點(diǎn)設(shè)計(jì)在限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)上，CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的突變會改變該酶切位點(diǎn)，被突變的靶序列不能被限制性內(nèi)切酶切斷，從而可以通過對酶切基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增來鑒定突變。其檢測特定是：操作簡單，突變檢出效率高。缺點(diǎn)是CRISPR系統(tǒng)作用的靶點(diǎn)選擇受到限制，尤其是需要對特定堿基進(jìn)行突變時。各種酶的使用也需要一定的費(fèi)用。與采用PCR/RE (PCR/restriction enzyme) 檢測法鑒定CRISPR突變個體相比[27]，使用Ⅰ酶鑒定的方法可以靈活選擇靶位點(diǎn)，使用的是能針對所有位點(diǎn)的廉價的酶。

DNA序列測定法(Direct sequencing，DS) 是PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測序或直接對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，可以直接提供突變的位點(diǎn)和序列。在采用CRISPR系統(tǒng)獲得高效率突變的情況下，可以采用PCR 產(chǎn)物直接測序的方法進(jìn)行鑒定。但在突變效率不高或進(jìn)行子代突變體遺傳規(guī)律分析時，與DNA序列測定法相比，Ⅰ酶策略具有廉價的特點(diǎn)。

3.2 不同PCR體系對Ⅰ酶策略效果有影響

采用Ⅰ酶粗提物進(jìn)行突變體的鑒定，除廉價外，還需要做到快速和高效。為此，通過整合檢測過程的各個環(huán)節(jié)包括PCR、產(chǎn)物變復(fù)性和酶切，達(dá)到在同一管中操作。我們發(fā)現(xiàn)，不同的PCR體系對基因的擴(kuò)增效果有影響，且不同的緩沖液對Ⅰ酶的粗提物的切割效率也有影響。其中Blend聚合酶在LA聚合酶所配套的LA buffer中能表現(xiàn)出更加優(yōu)越的PCR效率以及切割效率。由于不同緩沖液的組成成分不同，對聚合酶和Ⅰ酶切的作用效率存在差異。因此在進(jìn)行Ⅰ酶策略鑒定的時候應(yīng)重視PCR體系的選擇，建議先通過預(yù)實(shí)驗(yàn)挑選最適合的PCR體系。

3.3Ⅰ酶策略對CRISPR突變材料進(jìn)行鑒定和分型

采用CRISPR創(chuàng)制的突變個體多數(shù)表現(xiàn)為少量的堿基缺失或增加，且創(chuàng)制的個體在T0代可能為野生型、雜合突變、純合突變或雙位點(diǎn)突變。Ⅰ具有可以切割異質(zhì)雙鏈DNA的特點(diǎn)，可以對DNA雙鏈中不配對的核苷酸所在的位置進(jìn)行切割。利用Ⅰ酶的這一特點(diǎn)，可以對CRISPR突變動植物材料進(jìn)行鑒定。采用該方法還可以對突變類型進(jìn)行區(qū)分。其原理是：雜合突變和雙位點(diǎn)突變個體的PCR產(chǎn)物變性、復(fù)性后能被Ⅰ酶識別。純合突變個體PCR產(chǎn)物與野生型個體PCR產(chǎn)物混合后經(jīng)變、復(fù)性處理后可以被Ⅰ酶識別。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Efficient identification of gene knockout mutant mediated by CRISPR/Cas9 byⅠ crude extracts

Wanbing Luo, Qiupeng Lin, Xiaoxia Li, Zejiao Zhou, Huiyong Yang, Rongyu Du, and Hongqing Li

Guangdong Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, Guangdong, China

CRISPR/Cas9, emerged as an efficient and powerful gene editing technology, has become the mainstream genome editing technology. Constructing mutants using CRISPR/Cas9 system is of great significance to the functional study and breeding application of useful genes. As the basis of the technology, a method for identification of mutation with efficiency and lower cost is needed. In this report, we studied the factors influencing mutation detected byⅠ crude extracts, such as the amount of protein, enzyme incubation time, PCR buffers. Under the optimized conditions, we can integrate the mutation detection steps into one-tube reaction. We used this system to examine the mutation types and frequency of ricemediated by CRISPR/Cas9. We also used this method to identify different mutation types including homozygous, heterozygous and bi-allelic mutations. The accuracy of this method reached 100% verified by sequencing. Altogether, our results showed that usingⅠ crude extracts was an efficient and low cost method for identification of CRISPR/Cas9 mediated mutation.

Ⅰ crude extracts, CRISPR/Cas9, mutant, identification,

October 18, 2016; Accepted:January 3, 2017

Hongqing Li. Tel/Fax: +86-20-85211375; E-mail: hqli@scnu.edu.cn

10.13345/j.cjb.160388

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31571759).

國家自然科學(xué)基金 (No. 31571759) 資助。