李冠，王霞，尹秀波，胡曉輝，陳靜，喬利仙，隋炯明，王晶珊

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利用離體誘變培育花生新品種宇花4號

李冠1，王霞1，尹秀波2，胡曉輝3，陳靜3，喬利仙1，隋炯明1，王晶珊1

1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島 266109 2 山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，山東濟(jì)南 250013 3 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生研究所，山東青島 266110

李冠, 王霞, 尹秀波, 等. 利用離體誘變培育花生新品種宇花4號. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(5): 766–774.Li G, Wang X, Yin XB, et al. Breeding of peanut variety Yuhua 4 by in vitro mutagenesis. Chin J Biotech, 2017, 33(5): 766–774.

為了豐富花生遺傳資源，開拓新的育種方法，本研究對離體誘變創(chuàng)造花生新種質(zhì)、培育花生新品種進(jìn)行了研究。利用花生品種花育20號胚小葉作為外植體，平陽霉素 (PYM) 作為誘變劑進(jìn)行離體誘變培養(yǎng)，然后在含有羥脯氨酸 (HYP) 的培養(yǎng)基上進(jìn)行定向篩選，最終獲得了15個再生小苗。再生小苗經(jīng)嫁接移栽田間，從后代中獲得了23個高油株系，3個產(chǎn)量顯著提高的品系，其中一個高產(chǎn)高油品系2015年通過了安徽省新品種登記鑒定，定名為宇花4號，在參試的品種中名列第一，比對照白沙1016增產(chǎn)16.63%。宇花4號為早熟、小粒、高油花生品種，經(jīng)農(nóng)業(yè)部油料及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(武漢) 化驗(yàn)，籽仁含油率達(dá)56.10%，達(dá)到高油標(biāo)準(zhǔn)，比誘變親本花育20號 (含油率49.50%) 高6.6個百分點(diǎn)，莢果產(chǎn)量比花育20號增產(chǎn)15%以上。本研究結(jié)果表明，離體誘變結(jié)合離體定向篩選是創(chuàng)造花生新種質(zhì)、培育新品種的有效途徑。

花生，離體誘變，宇花4號，產(chǎn)量，含油率

創(chuàng)造花生高油新種質(zhì)、培育高產(chǎn)高油新品種對提高花生產(chǎn)值、增加農(nóng)民收益有著重要意義[1-2]。但目前花生品種中缺乏高油品種，雜交育種難以獲得突破性進(jìn)展。誘變能夠產(chǎn)生自然界不存在的或極為罕見的新性狀、新個體[3-5]。但突變是不定向的，誘變往往產(chǎn)生大量突變體，而突變體的后續(xù)鑒定需要大量人力、物力和財力[6]。誘變結(jié)合定向篩選可解決這一難題[7-9]。利用離體誘變結(jié)合離體定向篩選創(chuàng)造新種質(zhì)已在多種植物上獲得成功，羅靜等[10]利用EMS誘變處理草莓愈傷組織并篩選得到抗灰霉病草莓植株。陳麗等[11]應(yīng)用EMS處理楊樹胚性愈傷組織，經(jīng)鹽脅迫定向篩選后獲得了耐鹽植株。李紅等[12]采用NaN3處理苜蓿愈傷組織，對誘變處理的愈傷組織進(jìn)行堿脅迫處理，獲得了耐堿的變異植株?；ㄉx體定向篩選研究也有報道，Venkatachalam等[13]以γ射線輻照處理花生愈傷組織，在培養(yǎng)基中添加黑斑病致病菌濾液進(jìn)行定向篩選，后代中獲得了對黑斑病抗性明顯提高的植株。Zhao等[14]利用化學(xué)離體誘變結(jié)合NaCl定向篩選，獲得了耐鹽突變體。但利用離體誘變培育出花生新品種尚未見報道。

本研究報道了利用離體誘變和HYP離體定向篩選培育出高產(chǎn)、高油、早熟花生新品種宇花4號。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為花生品種花育20號的成熟種子，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 離體誘變處理及HYP離體定向篩選

2009年選取100?；ㄓ?0號成熟干種子，表面殺菌后，取胚小葉培養(yǎng)在添加4 mg/L PYM和10 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 的培養(yǎng)基上進(jìn)行誘變培養(yǎng)，同時誘導(dǎo)體胚的形成。每粒種子8個胚小葉，共計培養(yǎng)約800個外植體。培養(yǎng)4周后，將存活的外植體轉(zhuǎn)移到添加4 mmol/L HYP和4 mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) 的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體胚萌發(fā)，同時進(jìn)行HYP定向篩選。篩選培養(yǎng)與恢復(fù)培養(yǎng) (培養(yǎng)基中不添加HYP) 交替進(jìn)行，直到體胚萌發(fā)長成小苗。

1.2.2 再生苗的嫁接和移栽

將體胚萌發(fā)長成的小苗作為接穗，無菌萌發(fā)的花生實(shí)生苗作為砧木，采用插接法進(jìn)行嫁接。嫁接苗繼續(xù)在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2 d后，移栽于育苗基質(zhì)中，在馴化室培養(yǎng)3周后，移栽青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。成熟后按單株收獲再生植株的種子。

1.2.3 再生植株后代選育過程及產(chǎn)量比較試驗(yàn)

M2代開始按株行種植，單粒播種，采用系譜育種法進(jìn)行選擇。試驗(yàn)在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田進(jìn)行，并結(jié)合海南加代加快育種進(jìn)程。直到M5代株行基本穩(wěn)定無明顯分離，選擇優(yōu)良單株混收莢果，形成株系。

M6代對株系進(jìn)行產(chǎn)量鑒定試驗(yàn)，選出產(chǎn)量高、抗逆強(qiáng)的優(yōu)良株系形成品系。2013年對選出的高產(chǎn)品系在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田進(jìn)行品比試驗(yàn)，起壟雙粒播種，壟距90 cm，每壟播種2行，每行播種25穴，穴距16.7 cm，每個小區(qū)播種3壟。以誘變親本花育20號 (山東省區(qū)試花生小粒組對照) 作為對照，設(shè)置3次重復(fù)。按常規(guī)進(jìn)行田間管理，干旱時合理澆水，成熟后按小區(qū)混收莢果，曬干后稱重產(chǎn)量。2014年繼續(xù)進(jìn)行品比試驗(yàn)，試驗(yàn)分別在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田和萊陽市團(tuán)旺鎮(zhèn)進(jìn)行，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田干旱時合理澆水，萊陽市團(tuán)旺鎮(zhèn)整個生育期間不澆水。收獲后進(jìn)行農(nóng)藝性狀的田間和室內(nèi)考種，并稱重各小區(qū)莢果產(chǎn)量。

1.2.4 品質(zhì)性狀測定

干種子送交農(nóng)業(yè)部油料及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(武漢) 化驗(yàn)籽仁含油率，以誘變親本花育20號作為對照。

1.2.5 安徽省非主要農(nóng)作物品種鑒定登記試驗(yàn)

試驗(yàn)為夏直播，起壟雙粒播種，每壟播種2行，每個小區(qū)面積13.34 m2，重復(fù)3次，全省不同地域共設(shè)5個試驗(yàn)點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體誘變及HYP耐性體胚萌發(fā)成苗

花育20號胚小葉外植體在添加PYM和2,4-D的培養(yǎng)基上誘變培養(yǎng)4周后，800個外植體一半左右褐化，存活的外植體約75%形成了體胚。將存活的外植體轉(zhuǎn)移到含有HYP和6-BA的體胚萌發(fā)和篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后，觀察發(fā)現(xiàn)大部分外植體褐化，僅有少數(shù)外植體存活。當(dāng)存活的外植體轉(zhuǎn)移到不添加HYP的恢復(fù)培養(yǎng)基上后，部分外植體上形成的體胚恢復(fù)生長。在篩選培養(yǎng)基和恢復(fù)培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)，最終體胚萌發(fā)獲得了15個再生苗。

2.2 育種過程及含油率測定結(jié)果

將體胚萌發(fā)長成的小苗作為接穗進(jìn)行無菌嫁接后，經(jīng)馴化移栽于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田，成熟后按單株收獲種子。次年將收獲的單株種子按株行單粒播種，生育期及收獲期觀察發(fā)現(xiàn)，12個再生植株的M2代發(fā)生明顯變異和分離。選擇優(yōu)良單株，利用系譜法結(jié)合海南加代進(jìn)行選擇和自交遺傳穩(wěn)定。M5代觀察性狀已基本穩(wěn)定，同一株行的個體間無明顯分離。將同一株行的優(yōu)良單株莢果混收形成株系。

測定了所有30個株系含油率，結(jié)果見表1。由表1可以看出，再生植株不同其后代含油率有所差別，并且有的同一再生植株的后代含油率也不同。誘變親本花育20號含油率為49.50%，12個原始再生植株的后代株系中只有12號植株后代含油率較低 (50.00%–51.60%)，其他11個植株后代株系中均有含油率在55.00%以上的高油株系，最高達(dá)到59.52%。3號、5號、9號和10號再生植株后代含油率均在55.00%–56.00%。2號、4號和13號再生植株后代株系含油率分別為56.36%–57.22%、55.26%–56.10%和56.20%，均未超過57.50%。1號再生植株后代株系含油率均在56.00%以上，有2個株系含油率高于58.00%，其中31-13-6-4達(dá)到59.52%，不同姊妹株系間含油率有所差別。6號植株后代株系含油率也均在56.00%以上，其中36-2-4-4達(dá)59.06%。7號再生植株后代含油率均達(dá)57.00%以上，但未超過59.00%。11號再生植株后代株系含油率 (52.66%–59.38%) 明顯不同，5個株系中有4個株系含油率低于55.00%，41-23-17-1最低，為52.66%，而姊妹株系41-21-18-5含油率高達(dá)59.38%。

2.3 產(chǎn)量試驗(yàn)結(jié)果及表型性狀

對30個株系進(jìn)行產(chǎn)量鑒定試驗(yàn)，9個株系獲得較高產(chǎn)量，并形成品系。2013年對高產(chǎn)品系進(jìn)行品比試驗(yàn)，品比結(jié)果見圖1，作為對照的誘變親本花育20號平均小區(qū)莢果產(chǎn)量6.001 kg，參試的9個品系 (來源于5個原始再生植株) 中除6號再生植株后代的一個品系36-1-2-1平均小區(qū)產(chǎn)量 (5.640 kg) 低于對照外，其他品系均高于對照。6號植株后代的其他3個品系36-2-4-4、36-3-2-1和36-6-4-5平均小區(qū)產(chǎn)量為6.285–6.570 kg。1號再生植株后代品系31-3-1-1平均小區(qū)產(chǎn)量為6.015 kg，略高于對照。7號再生植株后代品系37-4-4-5平均小區(qū)產(chǎn)量為6.885 kg，顯著高于對照，另一個品系37-2-1-3為6.255 kg。11號再生植株后代品系41-21-18-5平均小區(qū)產(chǎn)量為6.915 kg，也顯著高于對照。4號再生植株后代品系34-11-1-1在參試的品系中產(chǎn)量最高，為7.020 kg，比對照高16.98%，達(dá)到了顯著水平。

表1 離體誘變及HYP定向篩選再生植株后代株系與親本籽仁含油率比較

圖1 離體誘變及HYP定向篩選再生植株后代品系產(chǎn)量品比結(jié)果 (2013年于青島農(nóng)大大學(xué)試驗(yàn)田)

2014年分別在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田和萊陽市團(tuán)旺鎮(zhèn)對上述產(chǎn)量高于誘變親本花育20號的8個品系進(jìn)一步進(jìn)行產(chǎn)量品比試驗(yàn)，以誘變親本花育20號作為對照，結(jié)果與2013年試驗(yàn)結(jié)果基本吻合 (圖2和圖3)。2013年產(chǎn)量顯著增加的3個品系34-11-1-1、37-4-4-5和41-21-18-5，2014年在這2個試驗(yàn)點(diǎn)小區(qū)莢果產(chǎn)量仍均顯著高于對照，其中34-11-1-1在2個試驗(yàn)點(diǎn)均表現(xiàn)第一位，小區(qū)莢果產(chǎn)量分別為7.17 kg和4.29 kg，分別比對照增產(chǎn)17.5%和21.8%。此外，36-2-4-4在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田小區(qū)莢果產(chǎn)量也顯著高于對照，而在萊陽市團(tuán)旺鎮(zhèn)小區(qū)莢果產(chǎn)量與對照無顯著差異。其他4個品系在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田小區(qū)莢果產(chǎn)量均高于親本，但達(dá)不到顯著水平，而在萊陽市團(tuán)旺鎮(zhèn)除31-3-1-1略低于對照外，其他3個品系略高于對照，但差異不顯著。與青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田小區(qū)莢果產(chǎn)量 (5.91–7.17 kg) 相比，萊陽市團(tuán)旺鎮(zhèn)各個品系及對照莢果產(chǎn)量 (3.21–4.29 kg) 均較低 (圖2和圖3)。

2014年收獲期于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田每個品系取10株進(jìn)行田間考種，結(jié)果列于表2。參試的8個品系中37號原始再生植株后代的2個品系 (37-2-1-3和37-4-4-5) 和41號原始再生植株后代品系 (41-21-18-5)，其主莖高和側(cè)枝長均比誘變親本花育20號高，而34-11-1-1和36-6-4-5與親本相近，其他3個品系 (31-3-1-1、36-2-4-4和36-3-2-1) 比親本矮。由表2還可以看出，這8個品系分枝數(shù)均變多，總分枝數(shù)變異范圍10.1–15.0條，而親本平均為9.5條；結(jié)果枝數(shù)變異范圍8.5–14.0條，而親本為7.1條。

圖2 離體誘變及HYP定向篩選再生植株后代品系產(chǎn)量品比結(jié)果 (2014年于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田)

圖3 離體誘變及HYP定向篩選再生植株后代品系產(chǎn)量品比結(jié)果 (2014年于萊陽市團(tuán)旺鎮(zhèn))

表2 離體誘變及HYP定向篩選再生植株后代品系農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

百果重、百仁重和出米率測定結(jié)果也列于表2，親本花育20號百果重和百仁重分別為192.4 g和74.4 g。8個品系百果重變異范圍180.9–208.7 g，百仁重變異范圍68.9–80.5 g，其中3個品系 (34-11-1-1、37-2-1-3和41-21-18-5) 莢果稍變小，其百果重和百仁重均低于親本。36-6-4-5與親本相近，而另外4個品系 (31-3-1-1、36-2-4-4、36-3-2-1和37-4-4-5) 莢果稍變大。8個品系的出米率 (74.8%–77.6%) 與親本 (76.1%) 無明顯區(qū)別。

2.4 宇花4號特征特性

根據(jù)2年3個試驗(yàn)點(diǎn)產(chǎn)量品比試驗(yàn)結(jié)果，34-11-1-1、37-4-4-5和41-21-18-5莢果產(chǎn)量均顯著高于誘變親本花育20號，含油率分別為56.10%、57.23%和59.38%，均達(dá)到高油標(biāo)準(zhǔn)。其中34-11-1-1產(chǎn)量最高，2015年參加安徽省非主要農(nóng)作物鑒定登記試驗(yàn)，并通過了試驗(yàn)，命名為宇花4號，審定編號為皖品鑒登字第1505006，在參試的品種中名列第一，平均畝產(chǎn)量260.50 kg，比對照白沙1016增產(chǎn)16.63%。

宇花4號為早熟高油小花生品種，株型直立、疏枝。春播全生育期125 d左右，夏播115 d左右?？共?、抗倒伏性、耐旱性較強(qiáng)。株莖高35.2 cm，側(cè)枝長39.3 cm，總分枝數(shù)12條，有效分枝數(shù)9條。百果重181.2 g，百仁重69.8 g，出米率76.2%。莢果普通形，種皮淺粉紅色，含油率56.10%，達(dá)到高油標(biāo)準(zhǔn)。和誘變親本花育20號相比，宇花4號分枝數(shù)多2–3條 (圖4)，產(chǎn)量顯著提高 (圖1、2和3)，含油率提高6.6個百分點(diǎn) (表1)。

圖4 宇花4號 (B) 和誘變親本花育20號 (A) 田間收獲圖

3 討論

花育20號是山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生研究所育成的高產(chǎn)小?；ㄉ贩N[15]，是山東省花生區(qū)試小粒組對照品種。本研究以花育20號胚小葉作為外植體，PYM作為誘變劑進(jìn)行離體誘變和HYP離體定向篩選，再生植株后代中，5個原始再生植株的8個品系產(chǎn)量高于誘變親本，其中34-11-1-1、37-4-4-5和41-21-18-5等3個品系2013年和2014年在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田莢果產(chǎn)量均顯著高于親本，2014年在萊陽市團(tuán)旺鎮(zhèn)較干旱沒有澆水的情況下產(chǎn)量仍顯著高于誘變親本花育20號，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐旱性。11個原始再生植株的23個品系含油率在55%以上，最高達(dá)59.52%，比花育20號(含油率為49.50%)高10.02個百分點(diǎn)。PYM是一種抗生素[16]，作為誘變劑，與其他化學(xué)誘變劑相比具有安全、高效、誘變頻率高、范圍大等特點(diǎn)[17-18]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了PYM的誘變效果。

脯氨酸是最重要和有效的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[19]，幾乎所有的逆境 (如干旱、低溫、高溫、冰凍、鹽漬、低pH、營養(yǎng)不良、病害和大氣污染等) 都會造成植物體內(nèi)脯氨酸的積累，尤其干旱脅迫時脯氨酸積累最多，因此脯氨酸含量常用作抗旱的生理指標(biāo)，也可用于鑒定植物遭受干旱的程度[20]。HYP是脯氨酸的類似物, 能夠與脯氨酸競爭性地反饋抑制脯氨酸合成途徑中的谷氨酸激酶[21]。以HYP作為選擇壓力，通過組織培養(yǎng)手段，已先后在多種植物上獲得耐HYP的變異細(xì)胞系，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗逆性。李紅等對紫花苜蓿進(jìn)行離體誘變和HYP定向篩選，獲得的變異體表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性和抗寒性[22]。胡博然等以枸杞胚性愈傷組織為輻照材料，經(jīng)60Co輻照后進(jìn)行HYP篩選，細(xì)胞變異系耐鹽性明顯提高[23]。張棟梁等利用無性系變異篩選茄子耐HYP突變體，再生植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐冷性[24]。本研究經(jīng)離體誘變的外植體在含有HYP的培養(yǎng)基上定向篩選，獲得的耐性突變再生植株后代含油率明顯提高，其突變位點(diǎn)及遺傳機(jī)理有待進(jìn)一步研究。突變體的耐鹽性、耐冷性、抗旱性等也有待進(jìn)一步鑒定。

花生是我國重要的油料作物之一，目前花生籽仁含油率在55%以上則定為高油品種[25]。據(jù)報道，含油率每提高1個百分點(diǎn)，純利潤可提高7%[26]。本研究培育出了高產(chǎn)高油花生新品種宇花4號，其他高油突變體也將為高產(chǎn)高油花生新品種培育以及遺傳研究提供重要的材料。

4 結(jié)論

本研究利用花生品種花育20號胚小葉作為外植體，PYM作為誘變劑和HYP作為篩選壓進(jìn)行離體誘變和離體定向篩選，再生植株后代中3個品系莢果產(chǎn)量顯著高于誘變親本花育20號，23個品系含油率達(dá)到高油標(biāo)準(zhǔn) (含油率55%以上)。育成的高產(chǎn)高油花生新品種宇花4號含油率為56.10%，達(dá)到高油標(biāo)準(zhǔn)，莢果產(chǎn)量比花育20號增產(chǎn)15%以上，比安徽省區(qū)試對照品種白沙1016提高16.63%。本研究證明離體誘變結(jié)合離體定向篩選是花生育種的一條有效途徑。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Breeding of peanut variety Yuhua 4 bymutagenesis

Guan Li1, Xia Wang1, Xiubo Yin2, Xiaohui Hu3, Jing Chen3, Lixian Qiao1, Jiongming Sui1, and Jingshan Wang1

1 College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong, China 2 The Agricultural Technology Extension Station of Shandong Province, Ji’nan 250013, Shandong, China 3 Peanut Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266110, Shandong, China

The embryonic leaflets of peanut () variety Huayu 20 were used as explants and pingyangmycin as a mutagen to induce somatic embryos. Four weeks after the inoculation, the survived explants were transferred to somatic embryo germination medium containing screening reagent hydroxyproline, and finally 15 regenerated plants were obtained. Pedigree breeding method was used during the following selection breeding, and three lines with significantly increased yield and 23 lines with high oil content were obtained from these mutant offsprings. The line with both high yield and high oil content has passed peanut variety multi-location in Anhui province and was named “Yuhua 4”. Its yield was 16.63% higher than that of the control variety Baisha 1016, ranking the first in all the testing varieties. Yuhua 4 showed the characteristics of early maturity, small pod and high oil content. The oil content of kernels was 56.10%, higher than that of original parent Huayu 20 with 49.50% oil content, tested by the Ministry of Agriculture of Oil and Products Quality Supervision, Inspection and Test Center (Wuhan), and the yield was 15% higher than that of Huayu 20. It was concluded thatmutagenesis and target screening was an effective way on creating new germplasm and breeding new variety in peanut.

peanut,mutagenesis, Yuhua 4, yield, oil content

November 14, 2016; Accepted: January 6, 2017

Jingshan Wang. Tel: 15963291167; E-mail: jswang316@126.com

10.13345/j.cjb.160444

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 31471542, 31571705, 31301356), Shandong Province Science and Technology Development Plan Project (No. 2014GNC110002).

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31471542, 31571705, 31301356)，山東省科技發(fā)展計劃 (No. 2014GNC110002) 資助。