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(1.揚州大學醫(yī)學院,江蘇揚州 225001;2.連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術學校,江蘇連云港 222007)

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徐蓉蓉1,高垚垚1,周云龍2,胡榮1,*

(1.揚州大學醫(yī)學院,江蘇揚州 225001;2.連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術學校,江蘇連云港 222007)

采用飽和水溶液法制備薏苡仁油β-環(huán)糊精(β-CD)包合物;Box-Behnken響應面法優(yōu)化并驗證制備條件為:包合投料質(zhì)量比(β-CD∶薏苡仁)為9∶1,包合溫度45 ℃,包合時間6 h。通過SEM、DSC、FTIR、XRD表征薏苡仁油β-CD包合物的形成;HPLC法測定β-CD對薏苡仁油包合率達63%;包合物溶液以最大濃度(63 mg/mL)、最大給藥量(0.04 mL/g)小鼠灌胃14 d后,心、肝、脾、肺、腎整體觀察和各臟器切片均無明顯病理變化,提示制備的薏苡仁油β-CD包合物食用安全,可進一步進行功效研究。

薏苡仁油,β-CD包合物,Box-Behnken響應面設計,高效液相,急性毒性實驗

薏苡(Coixlaohryma-jobiL.)是藥食同源植物[1],在古籍《本草綱目》和《神農(nóng)本草經(jīng)》都有記載。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),薏苡仁具有祛風濕,美容養(yǎng)顏,解熱養(yǎng)胃等功效[2]。據(jù)報道,薏苡仁油有抗腫瘤[3-4]、鎮(zhèn)痛[5]、抗炎[6]、降脂[7]等藥理活性。薏苡仁油的藥理作用眾多,但水溶性差、生物利用度低等缺點極大地限制其應用。目前臨床應用制劑主要有注射劑和軟膠囊(康萊特),但仍存在靜脈炎和靜脈血管硬化等不良反應。近年來,對薏苡仁油的制劑研究已初步展開,有學者曾用β-CD、羥丙基-β-CD[11-13]對薏苡仁油進行包合,但采用正交實驗優(yōu)化制備工藝精度不高、預測性不佳,且未考察薏苡仁油β-CD包合物口服安全性[14]。

因此,為增加薏苡仁油的穩(wěn)定性和溶出吸收利用度,本實驗采用飽和水溶液法制備薏苡仁油β-CD包合物,經(jīng)高效液相測定包合物的包合率,并通過Box-Behnken響應面法優(yōu)化其制備工藝,采用SEM、DSC、FTIR、XRD等對包合物進行表征。此外,本研究還進行小鼠灌胃急性毒性實驗以考察其口服安全性,意欲開發(fā)固體功能食品如粉末薏苡仁油沖劑或片劑。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

薏苡仁 北京同仁堂飲片有限責任公司;薏苡素(質(zhì)量分數(shù)≥99.7%) 上海源葉生物科技有限公司(批號YM0325YB14);β-環(huán)糊精(β-CD)、丙酮、乙醇、石油醚 均為分析純，國藥集團化學試劑公司;清潔級ICR小鼠(體質(zhì)量18～22 g) 揚州大學比較醫(yī)學中心許可證號:(SCXK(蘇)2012-0004)。

磁力攪拌器 上海滬西分析儀器廠;DSC 8500 差示掃描量熱儀 美國PerkinElmer公司;Tensor27傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司;S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本Hitachi High-Technologies公司;D8 Advance多晶X射線衍射儀 德國Bruker-AXS公司;Waters e2695高效液相色譜儀和Waters 2998 PDA檢測器 美國Waters公司。

1.2實驗方法

1.2.1 薏苡仁油的提取 將薏苡仁粉碎,丙酮為溶劑,液料比4︰1,70 ℃恒溫索氏提取器回流提取1.5 h即可[15]。按《中國藥典》2015年版記載方法測定薏苡仁油的理化常數(shù)。

1.2.2 飽和水溶液法制備薏苡仁油β-CD包合物 恒溫45 ℃,將50 gβ-CD加入1000 mL蒸餾水中,溶解后將薏苡仁油5.6 g滴入其中,300 r/min攪拌6 h,冷藏2 h,濾出包合物,稱重。

1.2.3β-CD對薏苡仁油包合率測定

1.2.3.1 薏苡仁油中指標成分薏苡素的色譜分析條件 Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);乙腈∶水=3∶7為流動相,流速0.5 mL/min;柱溫25 ℃,進樣量40 μL,檢測波長232 nm。

1.2.3.2 色譜分析樣品溶液的配制 薏苡素對照品溶液:精密稱取薏苡素對照品2 mg,用20 mL乙醇溶解,制成0.1 mg/mL薏苡素乙醇溶液。

β-CD空白樣品溶液:β-CD 1.0 g溶解在100 mL蒸餾水中,定容得1%β-CD水溶液。

薏苡仁油供試品溶液:精密稱取1 g薏苡仁油于20 mL容量瓶中,乙醇溶解定容至刻度,得50 mg/mL的薏苡仁油乙醇溶液。

薏苡仁油β-CD包合物供試品溶液:精密稱取“1.2.2”項下制備的薏苡仁油β-CD包合物10 g,用10 mL石油醚分兩次洗滌,洗液濾至10 mL容量瓶中,得未包入的薏苡仁油石油醚溶液。

1.2.3.3 包合率的測定 精密分取“1.2.3.2”項下制備的0.1 mg/mL薏苡素乙醇溶液,用乙醇稀釋至質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20、25 μg/mL,按“1.2.3.1”條件分別進樣40 μL,記錄色譜圖及峰面積,繪制標準曲線。

分別吸取“1.2.3.2”項下制備的β-CD水溶液、薏苡仁油乙醇溶液及未包入的薏苡仁油石油醚溶液,按“1.2.3.1” 色譜條件分別進樣40 μL,記錄各峰面積,根據(jù)薏苡素的標準曲線,計算薏苡仁油中薏苡素含量和未包入的薏苡仁油量,進而求出β-CD對薏苡仁油的包合率。

包合率=W包/W投=(W投-W游)/W投

式中,W投為總投入薏苡仁油量,W包為包入的薏苡仁油量,W游為未包入仍游離的薏苡仁油量。

1.2.4 薏苡仁油β-CD包合物制備工藝單因素考察

1.2.4.1β-CD與薏苡仁油比例對包合率的影響 包合溫度50 ℃,包合時間6 h,攪拌速度設為300 r/min,分別以β-CD∶薏苡仁油=3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1投料比進行包合。

1.2.4.2 包合溫度對包合率的影響β-CD∶薏苡仁油=7∶1,包合時間6 h,攪拌速度300 r/min,分別在20、30、40、50、60 ℃條件下進行包合。

1.2.4.3 包合時間對包合率的影響β-CD∶薏苡仁油=7∶1,包合溫度40 ℃,攪拌速度300 r/min,包合時間分別在2、4、6、8、10 h條件下進行包合。

1.2.4.4 攪拌速度對包合率的影響β-CD∶薏苡仁油=7∶1,包合溫度40 ℃,包合時間6 h,分別在200、300、400、500、600 r/min轉(zhuǎn)速下進行包合。

1.2.5 薏苡仁油β-CD包合物制備工藝響應面實驗優(yōu)化 根據(jù)單因素影響實驗及相關文獻報道[16-18],選取β-CD︰薏苡仁油投料比、包合溫度及包合時間3個因素進行考察,以包合率為評價指標,采用Box-Behnken響應面實驗設計篩選薏苡仁油β-CD最佳工藝參數(shù),實驗因素與水平設計見表1。

表1 因素與水平表Table 1 Factors and levels table

1.2.6 薏苡仁油β-CD包合物的表征

1.2.6.1 SEM 將β-CD和薏苡仁油β-CD包合物經(jīng)導電膠粘樣、噴金鍍膜后置于場發(fā)射掃描電鏡中觀察其表面形態(tài)特征。

1.2.6.2 DSC 將薏苡仁油、β-CD、薏苡仁油與β-CD物理混合物(9 gβ-CD與1 g薏苡仁油混合攪勻),薏苡仁油β-CD包合物進行差示量熱分析。吹掃氣(N2)20 mL/min,升溫速度為10 ℃/min,溫度范圍30～300 ℃。

1.2.6.3 FTIR 分別取薏苡仁油、β-CD、薏苡仁油與β-CD物理混合物以及薏苡仁油β-CD包合物適量,與KBr混合壓片,在4000～400 cm-1范圍內(nèi)測定其紅外譜圖。

1.2.6.4 XRD 分別取適量β-CD、薏苡仁油與β-CD物理混合物、薏苡仁油β-CD包合物進行X-射線衍射檢測:Cu-Kα輻射,Lynxeye陣列探測器,管電壓為40 kV,管電流為40 mA,掃描角度范圍為5 °～40 °,掃描速度0.3 步/s。

1.2.7 薏苡仁油β-CD包合物小鼠灌胃急性毒性實驗 小鼠60只,隨機分為空白對照組20只和實驗組40只,雌雄各半,禁食不禁水12 h。在預實驗的基礎上灌胃給與薏苡仁油β-CD包合物溶液最大濃度(63 mg/mL),最大給藥容量(0.04 mL/g),空白對照組給予等體積的蒸餾水。灌胃后觀察并記錄小鼠生理反應及死亡情況,常規(guī)飼養(yǎng)14 d后處死并解剖小鼠,取其心、肝、脾、肺、腎等做病理切片觀察是否有病理變化。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 所有數(shù)據(jù)都以平均值±標準差表示,應用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。利用Design-Expert 8.06軟件對響應面實驗結果進行方差分析,p<0.05認為具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1提取的薏苡仁油理化性狀

薏苡仁提油率5.8%,其色淡黃,澄明,油狀,氣微,味淡;相對密度0.915;折光率1.472;皂化值192 mg KOH/g;碘值102 g碘/100 g。

2.2包合率的測定

β-CD、薏苡素對照品、薏苡仁油、未包入的薏苡仁油各溶液色譜圖見圖1。以濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸,得薏苡素標準曲線方程:Y=174918X-94541(R2=0.9994),薏苡素檢測濃度在5～25 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。經(jīng)HPLC法測得薏苡仁油中指標成分薏苡素的量,計算β-CD對薏苡仁油包合率為63%。

圖1 不同樣品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of different samples注:a.β-CD空白樣品;b.薏苡素對照品;c.薏苡仁油;d.未包入的薏苡仁油。

2.3借鑒單因素考察進行響應面設計

隨著投料比(β-CD∶薏苡仁油值)的增加,包合率逐漸增大,當投料比為9∶1時,包合率最高,當投料比大于9∶1時包合率增加幅度不大。因此在響應面實驗中,將投料比設定為7∶1、9∶1、11∶1。在20～40 ℃范圍內(nèi),隨著溫度的升高,包合率明顯增加,當溫度高于40 ℃以后,包合率升高幅度不大。考慮到薏苡仁油受熱不穩(wěn)定,將包合溫度定為30、40、50 ℃。攪拌時間為2 h時,薏苡仁油包合不充分,攪拌6 h時,包合率最高,6 h后攪拌時間延長包合率下降,可能是因為β-CD分子空穴大,攪拌時間延長導致薏苡仁油從空腔析出,故將攪拌時間設定為4、6、8 h。500 r/min以下的低速攪拌速度對包合率影響不大,故在響應面實驗中將攪拌速度設定為300 r/min,不再將其作為影響因素考察。

2.4薏苡仁油β-CD包合物制備工藝優(yōu)化實驗

表2 響應面分析實驗設計及結果Table 2 Program and experimental results of response surface methodology(RSM)

薏苡仁油β-CD包合物響應面(圖2)可直觀的反映:投料比和包合溫度對薏苡仁油β-CD包合物包合率的影響顯著。在包合溫度和包合時間不變的條件下,隨著投料比的增加,包合率先上升后趨向平緩。在投料比和包合時間不變的情況下,包合率先隨著包合溫度的增大而升高,達40 ℃后包合率升高不顯著。當投料比和包合溫度不變時,隨著包合時間的增加,包合率先升高后下降,6 h達最大值。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

圖2 薏苡仁油β-CD包合物響應面和等高線圖Fig.2 Response surface and contour map of β-CD inclusion complexes of Adlay seed oil

根據(jù)等高線圖(圖2)可知,投料比和包合溫度的等高線圖呈橢圓形,說明兩者交互作用顯著;投料比和包合時間、包合溫度和包合時間的等高線圖接近圓形,說明其交互作用均不顯著。

通過回歸模型預測的薏苡仁油β-CD包合物制備最優(yōu)條件:β-CD∶薏苡仁投料比為9.28∶1,包合溫度42.00 ℃,包合時間6.26 h,包合率預測值為63.11%。為了便于操作最優(yōu)條件修正為β-CD∶薏苡仁=9∶1,包合溫度45 ℃,包合時間6 h ，在此條件下，β-CD對薏苡仁油的包合率達63%，與預測值相差不大，標準差為0.11%，模型真實可靠。

2.5薏苡仁油β-CD包合物的表征

2.5.1 SEM 圖3可見β-CD的形態(tài)為板塊狀晶體,而薏苡仁油β-CD包合物呈碎粒狀顆粒。

圖3 β-CD(a)和薏苡仁油-β-CD包合物(b)SEM圖(1000×)Fig.3 SEM pictures of β-CD(a)and β-CD inclusion complexes of Adlay seed oil(b)(1000×)

2.5.2 DSC 如圖4所示,薏苡仁油無相變峰,β-CD在T=117.2 ℃出現(xiàn)一個吸熱峰,物理混合物的熱流曲線呈現(xiàn)β-CD的特征,包合物的熱流曲線也呈現(xiàn)β-CD的特征,但因薏苡仁油的包入使其吸熱峰在T=114.6 ℃出現(xiàn)。

圖4 不同樣品的DSC圖Fig.4 DSC spectra of different samples注:a. 薏苡仁油;b. β-CD;c. 薏苡仁油和β-CD物理混合物;d. 薏苡仁油β-CD包合物；圖5同。

2.5.3 FTIR 圖5為薏苡仁油、β-CD、薏苡仁油與β-CD物理混合物以及薏苡仁油-β-CD包合物的FTIR譜圖在1000～750 cm-1的指紋區(qū)和4000～3000 cm-1的功能團區(qū)都有同類峰群;包合物與物理混合物的整個面貌最相似,只是歸屬于薏苡仁油的在1745～1715 cm-1的羰基峰和薏苡仁油中指標成分薏苡素的2925 cm-1的-NH-峰,包合物的較弱,說明包合后C=O、N—H鍵強減弱,形成了較穩(wěn)定的新物相。

圖5 不同樣品的FTIR譜圖Fig.5 FTIR spectra of different samples

2.5.4 XRD 圖6顯示,β-CD與物理混合物的衍射峰基本相似,后者的衍射峰較平緩;包合物與前兩者相比各衍射峰強度大幅度減弱,說明包合物的結晶度大幅度降低,由此說明β-CD包合薏苡仁油形成新的物相。

圖6 不同樣品的XRD譜圖Fig.6 XRD spectra of different samples注:a薏苡仁油和β-CD物理混合物;b薏苡仁油β-CD包合物;c. β-CD。

2.6急性毒性實驗

小鼠灌胃薏苡仁油β-CD包合物1 h內(nèi),出現(xiàn)臥縮成團、毛發(fā)豎立現(xiàn)象,與空白組相比活動減少,但5 h后兩組無明顯差異。14 d內(nèi)小鼠未有死亡例,大小便、皮毛和膚色均正常。對比灌胃和空白組小鼠的心、肝、脾、肺、腎肉眼觀察均無病變,經(jīng)固定、脫水、固體石蠟包埋、切片、H.E染色、封片觀察,見圖7,細胞形態(tài)無異常,說明薏苡仁油β-CD包合物對小鼠主要器官無明顯毒性反應。

圖7 各臟器的病理切片F(xiàn)ig.7 Pathological sections of each organ注:空白組:A心,B肝,C脾,D肺,E腎，灌胃包合物組:a心,b肝,c脾,d肺,e腎。

3 結論

本實驗采用飽和水溶液法制備薏苡仁油β-CD包合物,通過響應面實驗優(yōu)化其制備工藝,得到最佳工藝參數(shù)為β-CD∶薏苡仁=9∶1,包合溫度45 ℃,包合時間6 h,包合率達63%。包合率是經(jīng)高效液相測定薏苡仁油中薏苡素含量而推算得出,由此避免僅通過萃取稱重所帶來的稱量誤差。同時也利用薏苡素(含N—H、C=O)的結構特征,采用SEM、DSC、FTIR、XRD等方法對包合物進行驗證,科學合理,準確可靠。本文進行小鼠灌胃急性毒性實驗以保證功能食品的使用安全。本文為薏苡仁油粉末化和食品領域的應用提供基礎實驗依據(jù),其功效評價和長期毒性實驗有待于進一步完成。

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PreparationandcharacterizationofAdlayseedoilandβ-cyclodextrininclusioncomplexes

XURong-rong1,GAOYao-yao1,ZHOUYun-long2,HURong1,*

(1.School of Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225001,China; 2. Lianyungang Higher Vocational Technical College Traditional Chinese Medicine,Lianyungang 222007,China)

To prepare theβ-cyclodextrin inclusion ofAdlayseed oil with a saturated aqueous solution. The optimum by Box-Behnken response surface design were as follows-the ratio ofβ-CD toAdlayseed oil 9∶1(g/g),stirring temperature 45 ℃,inclusion time 6 h. The inclusion was characterized by SEM,DSC,FTIR and XRD. Entrapment efficiency of the inclusion determined by HPLC was 63%. In the acute toxicity test,the mice which were fed with the highest concentration(63 mg/mL)and maximum dosage(0.04 mL/g),no death was found in the experimental mice after 14 days. No organ abnormalities were found and no organ pathology in sliced observation. The prepared inclusion complexes were safety for oral administration to be better for further study of efficacy.

Adlayseed oil;β-cyclodextrin inclusion;Box-Behnken response surface design;HPLC;acute toxicity test

2016-11-28

徐蓉蓉(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：藥食兩用制劑開發(fā)，E-mail：893077009@qq.com。

*通訊作者:胡榮(1957-)，女，大學本科，教授，研究方向：藥劑學，E-mail：prhurong@163.com。

揚州大學(大學生)科技創(chuàng)新基金項目(x20160794)。

TS225

:B

:1002-0306(2017)12-0258-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.047