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(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

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大豆粕玉米黃粉發(fā)酵物對小鼠免疫功能的影響

黃姍芬,馬海樂,楊雪,王禹程,李云亮*

(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

目的:研究大豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠免疫功能的影響。方法:實驗組以低、中、高劑量0.334、0.667和2 g/(kg·d)的大豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物灌胃小鼠,對照組以等體積純凈水灌胃,30 d后進行二硝基氟苯誘導小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應實驗、ConA 誘導小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗、抗體生成細胞檢測實驗、血清溶血素測定實驗、碳廓清實驗和NK 細胞活性測定實驗。結(jié)果:大豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠的耳廓腫脹、脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化、血清溶血素水平、吞噬指數(shù)a和NK細胞活性都有顯著影響(p<0.05),但是對小鼠脾抗體生成細胞量無顯著影響(p>0.05)。結(jié)論:大豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物具有增強免疫力的功能。

大豆粕,玉米黃粉,發(fā)酵物,枯草芽孢桿菌,增強免疫力

我國是一個農(nóng)業(yè)大國,玉米和大豆資源豐富,玉米年產(chǎn)量1.25億噸,大豆年產(chǎn)量2千萬噸。玉米黃粉是玉米加工淀粉時剩下的副產(chǎn)物,其中含有40%～60%的蛋白質(zhì)。大豆粕是大豆榨油后的副產(chǎn)物,其中蛋白含量43%～48%[1]。由于玉米蛋白中賴氨酸和色氨酸含量較低,導致其蛋白質(zhì)生物學營養(yǎng)價值較低[2]。然而,大豆蛋白中含有較為豐富的賴氨酸和色氨酸,但是含硫氨基酸較少[3-4]。玉米蛋白的含硫氨基酸比較豐富[2]。不同食物來源的蛋白質(zhì)其營養(yǎng)價值不同(取決于該蛋白質(zhì)中必需氨基酸的含量與比值)。蛋白質(zhì)的互補作用是將幾種生物學價值較低的食物蛋白質(zhì)混合食用,則混合后蛋白質(zhì)的總體生物學價值就能大大提高。由于當必需氨基酸的含量與比值接近人體組織蛋白質(zhì)氨基酸的組成和比值時,其利用率高,營養(yǎng)價值就大。但是有些蛋白質(zhì),因一種或幾種必需氨基酸的含量過低或過高,比值與人體組織不接近,則利用率低,生物學價值低。

如果將大豆粕和玉米黃粉一起發(fā)酵,能有效克服氨基酸缺陷問題。由于大豆粕中主要成分為大豆蛋白,玉米黃粉主要成分為玉米蛋白,其中大豆蛋白和玉米蛋白具有互補作用?；パa的蛋白質(zhì)氨基酸含量豐富且組成均衡,營養(yǎng)價值高,而且無論是其生物效價還是利用率都很高。王進[5]等人發(fā)現(xiàn),玉米大豆復配肽比單一原料制備的肽的ACE抑制活性高。

近年來,為促進大豆粕和玉米黃粉的高值化利用,采用微生物發(fā)酵法制備功能性多肽已成為研究熱點問題之一[6-9]。目前大量研究結(jié)果表明,大豆和玉米蛋白多肽都具有降血壓[10-15]、抗氧化[16-21]、提高免疫力[22-25]等功效。

對于大豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物增強免疫功能的研究,目前還未見報道,且大多文獻關于大豆和玉米蛋白多肽對免疫功能的影響的研究不透徹[22-25]。本文詳細探討了大豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對增強免疫功能的具體效果,為蛋白多肽高值化應用提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

枯草芽孢桿菌 本課題組實驗室提供;大豆粕(蛋白含量42.53%) 中儲糧鎮(zhèn)江糧油有限公司;玉米黃粉(蛋白含量60.17%) 山東無棣天成生物科技有限公司;小牛血清、刀豆蛋白A(ConA)、四氮唑藍(MTT)、2-巰基乙醇(2-ME)、2,4-二硝基氟苯(DNFB) Sigma試劑公司;綿羊紅細胞(SRBC) 北京百奧萊博科技有限公司;18.0～22.0 g健康雌性清潔級ICR小鼠 動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2012-0002號，上海斯萊克實驗動物有限公司。

MSS全波長酶標儀 美國熱電·芬蘭雷勃(Thermo Labsystems Co);SPX-250B生化培養(yǎng)箱 常州國華電器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物的制備 樣品豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物的制備參考朱宏志[26]等的方法。

1.2.2 實驗分組和豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物劑量設計

1.2.2.1 動物分組 分批按體重隨機各分為4組測定:二硝基氟苯誘導小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應實驗;ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗;抗體生成細胞檢測和血清溶血素測定;小鼠碳廓清實驗和NK細胞活性測定。

1.2.2.2 劑量設計 成人(按60 kg體重計)每日推薦攝入量為4 g,相當于0.0667 g/(kg·d)。實驗按低、中、高設置0.334、0.667和2 g/(kg·d)3個劑量組,分別相當于人體推薦量的5、10和30倍。溶劑對照組以等體積純凈水灌胃。

1.2.2.3 受試物的前處理 稱取樣品大豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物3.34、6.67和20 g,分別加純凈水至200 mL制成各組受試液混勻后灌胃(存放于4 ℃冰箱,每兩天配制一次)。各組小鼠以20 mL/(kg·d)的灌胃容積,連續(xù)經(jīng)口灌胃30 d后測其各項免疫指標。

1.2.3 細胞免疫功能實驗

1.2.3.1 二硝基氟苯誘導小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應 參照葛飛[27]的方法略有改動。采用1% DNFB丙酮麻油溶液涂抹受試動物耳廓,使其致敏。

1.2.3.2 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗 采用MTT測定法[28],略有改動。用于顯色測定受試動物脾淋巴細胞的增殖細胞數(shù)量。

1.2.4 體液免疫功能實驗

1.2.4.1 抗體生成細胞檢測 采用Jerne改良載片測定法[29]。通過對小鼠腹腔注射SRBC,刺激其脾細胞產(chǎn)生SRBC抗體,將該脾細胞與SRBC進行溶血空斑實驗,并計算溶血空斑數(shù)。

1.2.4.2 血清溶血素測定 采用半數(shù)溶血值(HC50)測定法[27],略有改動,其中以SA緩沖液代替血清設為對照。通過對小鼠腹腔注射SRBC,使其血清產(chǎn)生SRBC抗體,其血清與SRBC發(fā)生溶血反應,并釋放血紅蛋白,檢測其半數(shù)溶血時的光密度值。

1.2.5 非特異性免疫功能實驗

1.2.5.1 碳廓清實驗 參照白玉[28]的方法略有改動,其中印度墨汁∶生理鹽水調(diào)整為1∶7(v/v)。在一定濃度范圍內(nèi),體內(nèi)碳顆粒被清除的速率與血碳濃度呈指數(shù)函數(shù)關系。從小鼠尾靜脈注射墨汁,2 min和10 min后分別測其血液的OD值。

1.2.5.2 NK細胞活性測定 參照白玉[28]的方法略有改動。其中靶細胞最大釋放孔加2.5% Triton。通過脾細胞懸液與靶細胞反應,釋放乳酸脫氫酶,發(fā)生顯色反應,檢測其光密度值。

2 結(jié)果與分析

2.1豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠耳廓遲發(fā)性變態(tài)反應的影響

豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠耳廓遲發(fā)性變態(tài)反應的影響見表1。各劑量組小鼠耳廓腫脹程度均高于溶劑對照組,低、中、高劑量組小鼠耳廓腫脹程度與溶劑對照組相比均有統(tǒng)計學顯著性差異(p<0.05)。遲發(fā)型超敏反應是以單個核細胞浸潤和組織細胞損傷為主要特征的細胞免疫反應[30],二硝基氟苯為抗原刺激T淋巴細胞增殖分化為致敏T細胞,產(chǎn)生細胞免疫。由此說明低、中、高劑量豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠細胞免疫具有增強作用。

表1 豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠耳廓遲發(fā)性變態(tài)反應的影響Table 1 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilison mouse pinna delayed hypersensitivity

注:*與空白對照組比較,有顯著性差異(p<0.05);**與空白對照組比較,有極顯著性差異(p<0.01)，表2～表6同。

表2 豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響Table 2 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilis on mouse spleen lymphocyte blastogenesis

2.2豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響

豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響見表2。各劑量組光密度差值均高于溶劑對照組,只有高劑量組小鼠光密度差值與溶劑對照組相比有極顯著性差異(p<0.01)。由此說明高劑量豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠脾淋巴細胞具有增殖作用。

2.3豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠脾抗體生成細胞量的影響

豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠脾抗體生成細胞量的影響見表3。與溶劑對照組相比,各劑量組小鼠的溶血空斑數(shù)均無顯著性差異(p>0.05)。成熟的B細胞定居于脾臟,B細胞在抗原刺激下分化為漿細胞,漿細胞合成和分泌抗體,主要執(zhí)行機體的體液免疫。由此說明豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠的體液免疫(抗原直接作用B細胞產(chǎn)生抗體)無促進作用。

表3 豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠脾抗體生成細胞量的影響Table 3 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilison cells production of antibody of mouse spleen

2.4豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠血清溶血素水平的影響

豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠血清溶血素水平的影響見表4。各劑量組小鼠血清半數(shù)溶血值(HC50)均高于溶劑對照組,中、高劑量組小鼠血清半數(shù)溶血值(HC50)與溶劑對照組相比有顯著性差異(p<0.05)。SRBC刺激T細胞的活化增殖,在T細胞的輔助下,B細胞活化分泌抗體[31]。由此說明豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠的體液免疫(抗原作用T細胞,刺激B細胞間接產(chǎn)生抗體)有促進作用。

表4 豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠血清溶血素水平的影響Table 4 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilison serum level of hemolysin

2.5豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠碳廓清的影響

豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠碳廓清的影響見表5。各劑量組小鼠吞噬指數(shù)a均高于溶劑對照組,中、高劑量組小鼠的吞噬指數(shù)a與溶劑對照組相比有極顯著性差異(p<0.01)。由血液中碳粒消失速度反映單核-巨噬細胞吞噬異物能力,是非特異性免疫。由此說明中、高劑量豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對血液中的非特異性免疫具有促進作用。

表5 豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠碳廓清的影響Table 5 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilison mouse carbon clearance(±s)

2.6豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠NK細胞活性的影響

豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠NK細胞活性的影響見表6。高劑量組小鼠NK細胞活性與溶劑對照組相比有顯著性差異(p<0.05)。由此說明高劑量豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對NK細胞的殺傷活性有促進作用。

表6 豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠NK細胞活性的影響Table 6 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilison mouse NK cell activity(±s)

3 結(jié)論與討論

本文通過對細胞免疫功能、體液免疫功能、非特異性免疫的研究,探索了豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠免疫功能的影響。實驗結(jié)果表明,高劑量的豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠細胞免疫功能有顯著的增強作用,耳廓遲發(fā)性變態(tài)反應和脾淋巴細胞增殖反應可以作為機體細胞免疫功能的參考指標。中、高劑量的豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠間接產(chǎn)生抗體的體液免疫功能有顯著的增強作用,但是對小鼠直接產(chǎn)生抗體的體液免疫功能無明顯作用。高劑量的豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠非特異性免疫功能有顯著的增強作用,碳廓清實驗和NK細胞活性可以作為機體非特異性免疫功能的參考指標。

目前豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物增強免疫力功能的研究未見報道,富校軼[23]等人研究發(fā)現(xiàn)超濾大豆蛋白肽具有增強免疫功能中體液免疫功能和單核-巨噬細胞吞噬功能的作用,吳曉萌[24]發(fā)現(xiàn)玉米肽具有同樣的免疫功能,但是該研究對于蛋白多肽增強免疫力功能的影響機制研究不透徹。本文研究了豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對小鼠細胞免疫功能、體液免疫功能和非特異性免疫功能均有較好的增強作用,為探索將豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物應用于保健品領域,提供可靠的理論支撐。

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Effectofsoybeanmealcornyellowpowderfermentationonmouseimmunefunction

HUANGShan-fen,MAHai-le,YANGXue,WANGYu-cheng,LIYun-liang*

(School of Food and Biology Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

Objective:To study the effect of soybean meal and corn yellow powder fermentation ofBacillussubtilison immune function of mice. Methods:Low-,medium-and high-dosage group were fed with 0.334,0.667 and 2 g/(kg·d)soybean meal and corn yellow powder fermentation ofBacillussubtilis,respectively,equal volume of pure water as control group. 30 days later,the following experiments were conducted that DNFB induced mouse delayed type hypersensitivity,mouse spleen lymphocyte transformation capacity induced by ConA,antibody forming spleen cells,serum hemolysin,carbon clearance ability,NK cell activity. Results:Soybean meal and corn yellow powder fermentation ofBacillussubtilishas significant impact(p<0.05) on mouse carbon clearance ability,spleen lymphocyte transformation,serum hemolysin capacity,phagocytic index a and NK cell activity. However it had no significant effect on production of spleen cells formed by antibody(p>0.05). Conclusions:Soybean meal and corn yellow powder fermentation ofBacillussubtilishad effect on enhancing immunity.

soybean meal;corn yellow powder;fermentation;Bacillussubtilis;enhance immunity

2016-11-28

黃姍芬(1992-)，女，在讀碩士研究生,研究方向：多肽提取及功能評價，E-mail:839710769@qq.com。

*通訊作者:李云亮(1986-)，男，博士研究生,講師，主要從事功能食品、食品物理學加工方法及裝備的開發(fā)方面的研究，E-mail:liyunliang1986@126.com。

國家863計劃-高生物利用度蛋白制備關鍵技術研究與開發(fā)(2013AA102203)；江蘇大學高級人才科研啟動基金(16JDG049)。

TS201.4

:A

:1002-0306(2017)12-0319-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.059