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(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心,果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點實驗室,農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室,農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點實驗室,北京 100097; 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽 110866)

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響應(yīng)面分析法優(yōu)化葫蘆素B脂質(zhì)納米粒高壓均質(zhì)生產(chǎn)工藝

劉鈺瑩1，2,趙春燕2,馬越1,趙曉燕1,張超1,*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心,果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點實驗室,農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室,農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點實驗室,北京 100097; 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽 110866)

以葫蘆素B、脂質(zhì)(單硬脂酸甘油酯)和乳化劑(泊洛沙姆188和大豆卵磷脂等比例混合物)為原料,采用高壓均質(zhì)法制備葫蘆素B脂質(zhì)納米粒。以單因素實驗考察均質(zhì)壓力、脂質(zhì)含量、乳化劑含量對葫蘆素B脂質(zhì)納米粒包封率的影響,并采用響應(yīng)面實驗優(yōu)化葫蘆素B脂質(zhì)納米粒生產(chǎn)工藝。結(jié)果表明:均質(zhì)壓力對葫蘆素B脂質(zhì)納米粒包封率的影響最大,其次為脂質(zhì)和乳化劑含量。當(dāng)壓力為74.8 MPa,乳化劑、脂質(zhì)及葫蘆素B三者含量比為12.6∶10.3∶1時,葫蘆素B脂質(zhì)納米顆粒包封率達到最高值,為92.4%,與理論值僅差1.62%,模型真實可靠。

葫蘆素B,脂質(zhì)納米粒,響應(yīng)面法,包封率

葫蘆素B屬于四環(huán)三萜類化合物,是葫蘆素家族中含量最豐富的一種[1-2],具有消炎、解毒、抗腫瘤、保肝、提高機體免疫力等功能[3-5]。葫蘆素B疏水性強,難溶于水或甲醇,目前有片劑和滴丸兩種劑型,但這兩種劑型會出現(xiàn)胃腸道不良反應(yīng),生物利用度低等問題[6-9]。脂質(zhì)納米粒是指以固態(tài)的天然或合成的類脂為骨架材料,將藥物包裹于類脂中,制成粒徑為100～1000 nm的固體膠粒給藥系統(tǒng),具有生物利用度高和毒性低的特點[10-13],因此可將葫蘆素B包裹于脂質(zhì)納米粒中,提高其生物利用度。

高壓均質(zhì)法是制備脂質(zhì)納米粒的經(jīng)典方法,生產(chǎn)出的脂質(zhì)納米粒具有粒徑小、粒度分布均勻和穩(wěn)定性高等特點,該工藝已經(jīng)制備平均粒徑分別為400 nm的克霉唑脂質(zhì)納米粒[14]、125 nm的白藜蘆醇固體脂質(zhì)納米粒[15]和149 nm的水飛薊賓脂質(zhì)納米粒[16],其納米粒包封率高、穩(wěn)定性好。

本研究首先考察高壓均質(zhì)壓力、脂質(zhì)含量和乳化劑含量對葫蘆素B脂質(zhì)納米粒包封率的影響,確定最佳范圍,然后采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化高壓均質(zhì)法制備葫蘆素B脂質(zhì)納米粒的最佳工藝參數(shù),以期為葫蘆素B脂質(zhì)納米粒的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

葫蘆素B標(biāo)準(zhǔn)品 四川省維克奇生物科技有限公司;無水乙醇 色譜純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;單硬脂酸甘油酯、泊洛沙姆188、大豆卵磷脂 天津市光復(fù)精細化工研究所。

Agilent 1260高效液相色譜儀,配有四元泵及自動進樣器、DAD檢測器 Agilent公司;電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;MS7-H550-Pro磁力攪拌器 SCILOGEX 公司;NS1001L2K高壓均質(zhì)機 意大利Niro Soavi公司。

1.2實驗方法

1.2.1 葫蘆素B脂質(zhì)納米粒制備 脂質(zhì)納米粒制備參考前人的方法[17-18],并進行改進。選取單硬脂酸甘油酯為脂質(zhì),泊洛沙姆188與磷脂等比例混合物為乳化劑。稱取10 mg葫蘆素B與200 mg脂質(zhì)混合,水浴加熱至80 ℃作為油相;稱取100 mg混合乳化劑溶解于水中加熱至80 ℃作為水相,在磁力攪拌(1000 r/min)下,將熱的水相滴加入油相中,繼續(xù)攪拌30 min,采用高壓均質(zhì)機進行均質(zhì),均質(zhì)壓力85 MPa,冰水浴中冷卻,即得納米粒分散液,4 ℃冷藏備用。

1.2.2 葫蘆素B脂質(zhì)納米粒包封率的測定

1.2.2.1 葫蘆素B標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 稱取葫蘆素B標(biāo)準(zhǔn)品0.207 g,溶于色譜級乙醇中,配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別稀釋至質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.1和0.15 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,使用HPLC測定峰面積。色譜柱條件:XBridge-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫25 ℃;流動相:A相:純水,B相:乙腈;梯度洗脫:0～30 min,50% B;30～45 min,50%～100% B;45～60 min,100%～50% B;流速1 mL/min;檢測波長228 nm[19]。以葫蘆素B的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 包封率的測定 準(zhǔn)確量取葫蘆素B脂質(zhì)納米粒溶液1 mL,在10000 r/min、4 ℃條件下離心30 min,收集上清液。同時,準(zhǔn)確量取葫蘆素B脂質(zhì)納米粒溶液1 mL于25 mL容量瓶中,加入20 mL乙醇,超聲波處理30 min,再使用乙醇定容至25 mL。采用HPLC測定上清液及固體脂質(zhì)納米粒中葫蘆素B濃度。色譜條件同標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法。根據(jù)式(1)計算葫蘆素B包封率[20]。

式(1)

式中:M總為葫蘆素B在脂質(zhì)納米粒溶液中的總質(zhì)量;M游為游離葫蘆素B的質(zhì)量。

1.2.3 單因素實驗 固定脂質(zhì)含量為200 mg,乳化劑含量為100 mg,考察均質(zhì)壓力(40、60、80、100、120 MPa)對包封率的影響;固定脂質(zhì)含量200 mg,均質(zhì)壓力為80 MPa,考察乳化劑含量(50、100、200、400、800 mg)對包封率的影響；固定均質(zhì)壓力為80 MPa,乳化劑含量為100 mg,考察脂質(zhì)含量(50、100、200、400、600 mg)對包封率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化制備工藝,選擇3個因素,即均質(zhì)壓力、乳化劑含量及脂質(zhì)含量為考察對象,以包封率為響應(yīng)值,進行三因素三水平的響應(yīng)面分析實驗,優(yōu)化葫蘆素B脂質(zhì)納米粒制備工藝,其因素水平編碼值見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

實驗所有數(shù)據(jù)均有三次重復(fù),計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用統(tǒng)計分析軟件DPS v7.05進行處理,Ducan’s新復(fù)極差法進行顯著性分析(p≤0.05)。采用Design-Expert 軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析,圖像繪制采用Origin 8.0軟件(美國Origin Lab Corporation公司)。

2 結(jié)果與分析

2.1葫蘆素B標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

圖1 葫蘆素B標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of cucurbitacin B

圖1顯示葫蘆素B含量與峰面積呈線性關(guān)系,其回歸方程為Y=16347 X-21.8,相關(guān)性系數(shù)R2=0.9997,葫蘆素含量在0～0.20 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2單因素對脂質(zhì)納米粒包封率的影響

2.2.1 均質(zhì)壓力對葫蘆素B包封率的影響 圖2為高壓均質(zhì)壓力對葫蘆素B包封率的影響。當(dāng)均質(zhì)壓力小于80 MPa時,隨著壓力的增加,包封率增大;超過80 MPa時,包封率隨壓力的增加而下降,原因在于當(dāng)壓力過大時,產(chǎn)生的剪切力和空穴效應(yīng),導(dǎo)致了葫蘆素B納米粒破碎[21],因此,均質(zhì)壓力中心值選在80 MPa附近。

圖2 均質(zhì)壓力對葫蘆素B包封率的影響Fig.2 Effect of homogenization pressure on the encapsulation efficiency of cucurbitacin B

2.2.2 乳化劑含量對葫蘆素B包封率的影響 圖3為乳化劑用量對葫蘆素B納米脂質(zhì)載體的包封率的影響。隨著乳化劑含量增加,乳化作用顯著提高葫蘆素B的溶解效果,葫蘆素B包封率增大;當(dāng)乳化劑比例過大,會導(dǎo)致藥物析出,降低包封程度,因此乳化劑含量中心值選在100 mg附近,這與Kovacevic等人的研究趨勢一致[22]。

圖3 乳化劑含量對葫蘆素B包封率的影響Fig.3 Effect of the emulsifier to cucurbitacin B ratio on the encapsulation efficiency of cucurbitacin B

2.2.3 脂質(zhì)含量對葫蘆素B包封率的影響 圖4為脂質(zhì)含量對葫蘆素B包封率的影響。隨著脂質(zhì)含量增大,葫蘆素B包封率也呈上升趨勢,在脂質(zhì)含量為100 mg時,包封率達到最大值。研究顯示藥物用量一定時,加入過多的脂質(zhì)會導(dǎo)致晶體析出,不能得到包封率較高的納米分散體系[23],與本文結(jié)論一致。因此脂質(zhì)含量選在100 mg附近。

圖4 脂質(zhì)含量對葫蘆素B包封率的影響Fig.4 Effect of lipid to cucurbitacin B ratio on the encapsulation efficiency of cucurbitacin B

2.3響應(yīng)面實驗分析

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析 研究選取均質(zhì)壓力、乳化劑含量、脂質(zhì)含量作為響應(yīng)面實驗因素,以葫蘆素B脂質(zhì)納米粒包封率為響應(yīng)值,運用Design-Expert 軟件設(shè)計響應(yīng)面實驗,設(shè)計方案及結(jié)果見表2所示。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計結(jié)果Table 2 Experiment result of response surface methodology

對表2實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析,得到各因子對葫蘆素B提取率影響的二次回歸模型:Y=50.22+0.27A+7.96B+2.63C+7.22AB+0.28AC+6.43BC-9.83A2+12.58B2+3.36C2。

對響應(yīng)面分析結(jié)果進行方差分析(表3),模型的p=0.0021<0.01,該模型極顯著,方差的失擬項不顯著p=0.1700>0.05,說明表面模型回歸擬合較好;決定系數(shù)R2=0.9747,說明葫蘆素B包封率與模型回歸值有較好的一致性[24-27]。

各因素對葫蘆素B包封率影響排序為:壓力>脂質(zhì)含量>乳化劑含量。A、AB、AC、A2、B2對葫蘆素B包封率有顯著影響(p<0.05),其余因子均不顯著;各因素對葫蘆素B包封率的影響不是簡單的線性關(guān)系。

表3 擬合二次多項式模型的方差分析Table 3 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

圖5 條件參數(shù)交互作用對葫蘆素B脂質(zhì)納米粒包封率的影響Fig.5 Response surface plots for the interactive of 3 factors on the encapsulation efficiency cucurbitacin B

注：*,影響顯著(p<0.05),**,影響極顯著(p<0.01)。2.3.2 各因素交互作用的影響 均質(zhì)壓力、乳化劑含量、脂質(zhì)含量對包封率的交互影響見圖5。均質(zhì)壓力對葫蘆素B包封率影響最顯著,脂質(zhì)含量次之,乳化劑含量影響最小。圖5可知,當(dāng)脂質(zhì)含量一定時,在不同乳化劑含量條件下,隨著壓力的增大,包封率呈先急速上升而后下降的趨勢;當(dāng)乳化劑含量一定時,在不同脂質(zhì)含量條件下隨著壓力的增大,葫蘆素B包封率呈上升趨勢;當(dāng)壓力一定時,在不同乳化劑含量條件下,脂質(zhì)含量的變大會導(dǎo)致葫蘆素B包封率的增加。

2.3.3 葫蘆素B脂制裁納米最優(yōu)制備條件與驗證 回歸模型分析得出最佳生產(chǎn)工藝為:當(dāng)壓力為74.8 MPa;乳化劑含量為126 mg;脂質(zhì)含量103 mg時,葫蘆素B脂質(zhì)納米粒的包封率可達92.4%。驗證實驗結(jié)果顯示葫蘆素B脂質(zhì)納米粒的包封率90.9%,實際值與理論值的相對偏差僅為1.62%,模型真實可靠。

3 結(jié)論

響應(yīng)面回歸模型顯示均質(zhì)壓力對葫蘆素B脂質(zhì)納米粒包封率影響最大,其次是脂質(zhì)含量和乳化劑含量,當(dāng)均質(zhì)壓力為74.8 MPa,乳化劑、脂質(zhì)及葫蘆素B的比例為12.6∶10.3∶1時,即泊洛沙姆188含量為63 mg,大豆卵磷脂含量63 mg,單硬脂酸甘油酯含量103 mg,葫蘆素B 10 mg,葫蘆素B脂質(zhì)納米粒包封率可達92.4%,與理論值僅差1.62%,模型真實可靠。

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OptimizationofsolidlipidnanoparticleofcucurbitacinBbyresponsesurfacemethodology

LIUYu-ying1,2,ZHAOChun-yan2,MAYue1,ZHAOXiao-yan1,ZHANGChao1,*

(1.Beijing Vegetable Research Center,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing Key Laboratory of Fruits and Vegetable Storage and Processig,Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops(North China),Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Ubran Agriculture(North),Ministry of Agriculture,Beijing 100097,China; 2.College of Food Science,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

The solid lipid nanoparticle of cucurbitacin B was prepared by high pressure homogenization with the lipid of monoglyceride,the emulsifier of mixture of the soybean lecithin and poloxamer 188(1∶1). The parameters of the high pressure homogenization were optimized by response surface methodology with the homogenization pressure,lipid content and emulsifier content as the main factors,and the encapsulation efficiency as the response. The homogenization pressure was the key factor affecting the encapsulation efficiency of cucurbitacin B,followed by the lipid content and emulsifier content. When the homogenization pressure was 74.8 MPa,and the ratio of the lipid-emulsifier-cucurbitacin B was 12.6∶10.3∶1,the encapsulation efficiency of cucurbitacin B reached the maximum of 92.4%. The validation experiment showed that the relative deviation between real and theoretical value was only 1.62%. The regression model was reliable.

cucurbitacin B;solid lipid nanoparticles;response surface methodology;encapsulation efficiency

2016-11-04

劉鈺瑩(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品深加工，E-mail：18515344964@163.com。

*通訊作者:張超(1978-)，男，博士，副研究員，研究方向：果蔬深加工，E-mail：zhangchao@nercv.org。

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-26)；北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(KJCX20170205)；果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點實驗室專項(Z141105004414037)。

TS201.2

:B

:1002-0306(2017)12-0254-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.046