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(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083; 3.大連東霖食品股份有限公司,遼寧大連 116101)

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復(fù)合魚源乳酸菌抑制哈維氏弧菌協(xié)同作用研究

林洋1,孫夢桐1,呂欣然2,馬歡歡1,白鳳翎1,*,勵(lì)建榮1,沈琳3

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083; 3.大連東霖食品股份有限公司,遼寧大連 116101)

目的:優(yōu)化抗哈維氏弧菌魚源復(fù)合乳酸菌的組合。方法:應(yīng)用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法獲得無交叉拮抗作用的乳酸菌菌株,利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化對(duì)哈維氏弧菌具有較強(qiáng)協(xié)同抑制作用的乳酸菌組合。結(jié)果:獲得4株對(duì)哈維氏弧菌有抑制效果且無交叉拮抗作用的乳酸菌,優(yōu)化出菌株清酒乳桿菌YP4-5、清酒乳桿菌YP1-6和植物乳桿菌DY4-2組合以2∶3∶3的比例混合培養(yǎng),復(fù)合發(fā)酵液在培養(yǎng)24 h時(shí)對(duì)哈維氏弧菌的抑菌直徑為25.87 mm,分別比YP4-5、YP1-6和DY4-2單菌株的抑菌直徑提升27.06%、37.10%和36.73%,表明三株乳酸菌具有協(xié)同作用。結(jié)論:植物乳桿菌DY4-2、清酒乳桿菌YP4-5和清酒乳桿菌YP1-6具有協(xié)同抑制哈維氏弧菌作用,三者以2∶3∶3組合對(duì)哈維氏弧菌的抑菌作用較強(qiáng),可作為水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中控制哈維氏弧菌的乳酸菌復(fù)合制劑。

魚源乳酸菌,復(fù)合,協(xié)同抑制,哈維氏弧菌

哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)也稱哈氏弧菌,是一種具有發(fā)光特性的革蘭氏陰性細(xì)菌,以自由泳動(dòng)的單細(xì)胞形式存在于海洋中,依附在非生物表面[1]。通過釋放胞外產(chǎn)物、溶血素、脂多糖、粘附素等多種致病因子引起對(duì)蝦感染,也可導(dǎo)致大菱鲆、斜帶石斑魚、褐點(diǎn)石斑魚等海水魚類和貝類發(fā)病,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失;還可通過被感染的水產(chǎn)品感染人類,導(dǎo)致人類急性敗血癥、胃腸炎及壞死性軟組織感染等[2-3]。

表1 魚源乳酸菌的11種不同組合Table 1 The 11 different composes of LAB derived fish

目前主要應(yīng)用芽孢桿菌、光合細(xì)菌和乳酸菌等對(duì)水體環(huán)境中的哈維氏弧菌污染進(jìn)行控制[4-6]。其中,應(yīng)用乳酸菌及其制劑控制水產(chǎn)養(yǎng)殖中污染已取得良好的效果。乳酸菌是腸道正常菌群最主要的有益菌之一,通過產(chǎn)生乳酸、雙乙酰、3-苯基乳酸及環(huán)(苯丙氨酸-脯氨酸)、環(huán)(亮氨酸-脯氨酸)等具有抗菌活性的物質(zhì)防止外來菌在腸道內(nèi)定殖,抑制細(xì)菌和真菌的生長、維持消化道菌群平衡[7-8]。乳酸菌具有無毒、無殘留、無污染等優(yōu)點(diǎn),作為生物防腐劑已廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品的防腐保鮮和畜禽養(yǎng)殖業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域[9-10]。Zapata等[11]從羅非魚腸道分離獲得Leuconostocmesenteroides可有效抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中VibrioharveyiT34的生長。Talpur等[12]發(fā)現(xiàn)來自梭子蟹的Lb.plantarum,Lb.rhamnosus和Lb.salivarius對(duì)哈維氏弧菌抑制效果明顯。

研究表明將無相互交叉拮抗的乳酸菌菌株進(jìn)行有機(jī)組合,使其形成協(xié)同抑菌優(yōu)勢,增強(qiáng)抑菌效果。于佳弘等[13]利用從青貯飼料中獲得Lb.plantarum3,P.acidilactici7,Lb.casei9以3∶2∶1比例復(fù)合能夠優(yōu)化對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的拮抗效果。王菲等[14]研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌和植物乳桿菌以3∶1∶3比例混合培養(yǎng)能夠高效抑制大腸桿菌O157∶H7的生長,抑菌效果明顯優(yōu)于單菌株。Wu等[15]研究發(fā)現(xiàn)Lb.plantarum,P.pentosaceus,Lb.mesenteroides,Lb.acidophilus和Lb.brevis等五種乳酸菌復(fù)合能夠有效抑制咸魚中致病菌的生長繁殖。目前國內(nèi)利用復(fù)合魚源性乳酸菌控制水產(chǎn)品中致病菌的研究較少。本文應(yīng)用海水魚腸道源性乳酸菌,對(duì)抗哈維氏弧菌進(jìn)行優(yōu)化組合,為研發(fā)水產(chǎn)養(yǎng)殖中控制哈維氏弧菌的高效乳酸菌微生態(tài)制劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

供試菌株:VibrioharveyiBB170 本實(shí)驗(yàn)室保藏;應(yīng)試菌株：植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)LP1-4和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)DY4-2 分別分離自大菱鲆和刀魚腸道;清酒乳桿菌(Lactobacillussake)YP4-5和清酒乳桿菌Lactobacillussake)YP1-6 分離自牙鲆腸道,經(jīng)上海生工生物工程股份有限公司鑒定,本實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保藏;MRS培養(yǎng)基,LB肉湯,LB營養(yǎng)瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

DL-CJ-2N型超級(jí)潔凈工作臺(tái) 東聯(lián)哈爾(北京)儀器制造有限公司;賽福智能生化培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠;PHSJ-3F實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;IKA Vortex GENIUS 3振蕩器 德國IKA公司;MLS-3020高壓蒸汽滅菌 日本三洋公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗哈維氏弧菌乳酸菌菌株的篩選 從海水魚腸道中分離的乳酸菌菌株,經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基于37 ℃ 24 h靜置培養(yǎng)活化三代,獲得菌懸液并稀釋至106CFU/mL;取V.harveyiBB170經(jīng)LB肉湯37 ℃ 24 h靜置培養(yǎng)活化三代,稀釋菌懸液至106CFU/mL作為指示菌,參照文獻(xiàn)[16]利用雙層瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行拮抗性實(shí)驗(yàn)篩選拮抗性強(qiáng)的乳酸菌菌株。

1.2.2 抗哈維氏弧菌的乳酸菌交叉拮抗實(shí)驗(yàn) 采用交叉拮抗法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),選取一株乳酸菌作為指示菌,其余三株為抑制菌菌株。將106CFU/mL的指示菌菌懸液以2%的接種量接種于MRS瓊脂中,參照1.2.1的方法觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)。

1.2.3 乳酸菌生長與抗哈維氏弧菌活性曲線的測定 取0.2 mL乳酸菌菌懸液接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng),每隔4 h取菌株的菌懸液測定其pH,并于600 nm測定其OD值,參照1.2.1測定各個(gè)乳酸菌菌株的抑菌活性[17],并對(duì)抑菌直徑進(jìn)行顯著性分析。

1.2.4 乳酸菌組合對(duì)哈維氏弧菌的抑制實(shí)驗(yàn) 參照王菲等[14]的方法并稍作修改,將對(duì)哈維氏弧菌有明顯拮抗效果的乳酸菌進(jìn)行組合獲得11種不同菌株組合(見表1),將各組合中的乳酸菌以同等比例混合在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化,取24 h培養(yǎng)物稀釋至106CFU/mL,參照1.2.1的方法37 ℃靜置培養(yǎng)24、48、72 h,測量抑菌直徑。

1.2.5 乳酸菌組合抑制哈維氏弧菌的優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 對(duì)1.2.4實(shí)驗(yàn)得到的對(duì)哈維氏弧菌具有最佳拮抗效果的組合進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),設(shè)計(jì)三因素三水平表,如表2所示。利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得不同比例的乳酸菌組合,參照1.2.1的方法37 ℃靜置培養(yǎng)24、48、72 h,測量抑菌直徑。

表2 三因素三水平正交表Table 2 The orthogonal table of three factors and three levels

1.2.6 乳酸菌組合生長與抗哈維氏弧菌活性曲線 取0.2 mL按最佳配比混合后的乳酸菌菌懸液接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中,于37 ℃下恒溫、靜置培養(yǎng),每隔4 h取菌株的菌懸液測定其pH,并于600 nm測定其OD值,參照1.2.1測定組合菌株的抑菌活性。

圖3 乳酸菌生長和抗哈維氏菌活性曲線Fig.3 The growth of LAB and antagonistic activity curve on V. harveyi注:不同字母表示抑菌直徑具有顯著差異(p<0.05)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 利用軟件Origin 8.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)平行3次,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1拮抗性乳酸菌的篩選

圖1是乳酸菌菌懸液對(duì)哈維氏弧菌的抑菌效果圖,從中可以看出菌懸液對(duì)哈維氏弧菌有顯著抑制作用。植物乳桿菌LP1-4、植物乳桿菌DY4-2、清酒乳桿菌YP1-6和清酒乳桿菌YP4-5菌懸液對(duì)哈維氏弧菌的抑菌直徑分別為17.39、18.92、18.87 mm和20.36 mm。

圖1 乳酸菌菌懸液對(duì)哈維氏弧菌的拮抗作用Fig.1 Antagonistic effects of cell suspension produced by LAB against V. harveyi

2.2抗哈維氏弧菌乳酸菌的交叉拮抗實(shí)驗(yàn)

將4株乳酸菌進(jìn)行交叉拮抗實(shí)驗(yàn),圖2是4株乳酸菌之間的拮抗效果圖,從中可以看出4株乳酸菌之間均不存在明顯相互作用。因此選擇菌株植物乳桿菌LP1-4、植物乳桿菌DY4-2、清酒乳桿菌YP1-6、清酒乳桿菌YP4-5作為后續(xù)研究菌株。

圖2 乳酸菌菌株交叉拮抗效果圖Fig.2 Effect picture of LAB cross antagonism

2.3乳酸菌生長與拮抗哈維氏弧菌活性曲線

圖3是植物乳桿菌LP1-4、植物乳桿菌DY4-2、清酒乳桿菌YP1-6和清酒乳桿菌YP4-5菌懸液經(jīng)37 ℃靜置培養(yǎng)40 h的pH、生長曲線及對(duì)哈維氏弧菌的抑菌活性的動(dòng)態(tài)變化情況,從圖3中可得出,4株乳酸菌菌株對(duì)哈維氏弧菌抑菌活性與細(xì)胞生長量兩者之間呈現(xiàn)同步增長趨勢,但在穩(wěn)定期呈平穩(wěn)狀態(tài)。隨著抑菌活性與細(xì)胞生長量的增加,pH呈現(xiàn)迅速下降在20 h左右逐步趨于平穩(wěn)。結(jié)果表明,到達(dá)穩(wěn)定期后,其次級(jí)代謝產(chǎn)物保持較高抗菌活性且對(duì)哈維氏弧菌的最大抑菌作用為培養(yǎng)24 h的菌懸液。

2.4抗哈維氏弧菌復(fù)合乳酸菌抑菌實(shí)驗(yàn)

表3是對(duì)哈維氏弧菌具有明顯抑制效果的4株乳酸菌:LP1-4、DY4-2、YP1-6、YP4-5以所有不同組合方式復(fù)合后對(duì)哈維氏弧菌的抑菌直徑,從表中可以看出11種不同組合中,第8組(YP4-5、YP1-6、DY4-2)對(duì)哈維氏弧菌產(chǎn)生了最佳的抑菌效果。

表4 不同配比的乳酸菌組合對(duì)哈維氏弧菌的抑制效果(mm)Table 4 Antibacterial effect of the different proportions of LAB on V. harveyi(mm)

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 The result of verifying tests

表3 乳酸菌組合對(duì)哈維抑菌的抑菌效果(mm)Table 3 Antibacterial effect of the different composes of LAB on V. harveyi(mm)

注:同列不同字母表示顯著差異(p<0.05)，表3～表5同。

2.5抗哈維氏弧菌乳酸菌組合優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

表4是對(duì)具有最佳抑菌效果的由YP4-5、YP1-6、DY4-2三株菌組合成的復(fù)合乳酸菌,采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化不同配比對(duì)哈維氏弧菌的抑制效果。從表4中可以看出,在9組不同配比的復(fù)合乳酸菌中,第6組A2B3C1組合時(shí),對(duì)哈維氏弧菌的抑菌效果達(dá)到最佳;而由k值可得,A2B3C3對(duì)哈維氏弧菌的抑菌效果最好。表5為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果,從表中可以看出A2B3C3的抑菌效果較優(yōu),但兩組差異不顯著。綜上,植物乳桿菌DY4-2、清酒乳桿菌YP4-5和清酒乳桿菌YP1-6的最佳添加量分別為2×106、3×106、3×106CFU/mL,即三者的最佳比例為2∶3∶3。

2.6復(fù)合乳酸菌生長與抗哈維氏弧菌活性曲線

圖4是復(fù)合菌株對(duì)哈維氏弧菌的pH、生長曲線及對(duì)哈維氏弧菌的抑菌效果的動(dòng)態(tài)變化情況,由圖可知,復(fù)合菌株對(duì)哈維氏弧菌抑菌活性與細(xì)胞生長量兩者之間呈現(xiàn)同步增長的趨勢,但在24 h后呈平穩(wěn)狀態(tài)。隨著抑菌活性與細(xì)胞生長量的增加,pH呈現(xiàn)迅速下降在20 h后逐步趨于平穩(wěn),表明4株乳酸菌在4～8h內(nèi)處于對(duì)數(shù)增長期,達(dá)到穩(wěn)定期后其次級(jí)代謝產(chǎn)物達(dá)到較高水平。植物乳桿菌DY4-2和清酒乳桿菌YP4-5、清酒乳桿菌YP1-6組合成的復(fù)合乳酸菌產(chǎn)生的抑菌效果大于單株乳酸菌的抑菌效果,抑菌直徑最高達(dá)25.87 mm,分別比清酒乳桿菌YP4-5、清酒乳桿菌YP1-6和植物乳桿菌DY4-2的抑菌直徑高出了27.06%、37.10%和36.73%。

圖4 復(fù)合乳酸菌生長和抗哈維氏弧菌活性曲線Fig.4 The growth of complex LAB and antagonistic activity curve on V. harveyi

3 結(jié)論

通過對(duì)來自大菱鲆、刀魚和牙鲆等海魚腸道的乳酸菌進(jìn)行優(yōu)化組合,篩選出抗哈維氏弧菌的植物乳桿菌DY4-2、清酒乳桿菌YP4-5和清酒乳桿菌YP1-6以2∶3∶3比例組合時(shí),抑菌直徑達(dá)到25.87 mm,該復(fù)合乳酸菌的抑菌效果顯著高于單一菌株抑菌效果。結(jié)果表明,通過相互間無拮抗作用的乳酸菌進(jìn)行抗菌效應(yīng)疊加,以實(shí)現(xiàn)高效生物防腐作用,為進(jìn)一步應(yīng)用乳酸菌研發(fā)微生態(tài)制劑控制海水養(yǎng)殖中致病菌具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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SynergyinhibitioneffectofcomplexlacticacidbacteriaderivedfishonVibrioharveyi

LINYang1,SUNMeng-tong1,LVXin-ran2,MAHuan-huan1,BAIFeng-ling1,*,LIJian-rong1,SHENLin3

(1.College of Food Science and Technology,Bohai University,Food Safety Key Lab of Liaoning Province, National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China; 2.College of Biology Science and Technology,Beijing Forest University,Beijing 100083,China; 3.Dalian Donglin Food Co.,Ltd.,Dalian 116101,China)

Objective:The aims of this study were to optimize an efficient combination of lactic acid bacteria(LAB)with strong antagonistic activity againstVibrioharveyifrom the marine fish intestine. Methods:LAB with no cross antagonism were obtained using the method of Oxford cup agar diffusion. Complex LAB with strong synergy inhibition activity againstV.harveyiwas optimized by orthogonal experiment. Results:Lactic acid bacteria were obtained from the marine fish intestine,which had strong inhibition activity againstV.harveyiand had no cross antagonism. The bacterial suspension of strain YP4-5,YP1-6 and DY4-2 combined with the ratio of 2∶3∶3 reached the maximum zone of inhibitory diameter and reached 25.87 mm at 24 h,which increased 27.06%,37.10% and 36.73% than that strain YP4-5,YP1-6,DY4-2 respectively. It indicated that the three strains LAB had the synergetic effects. Conclusion:Lb.plantarumDY4-2 andLb.sakeYP4-5,Lb.sakeYP1-6 had synergetic effects. againstV.harveyi,which combined with the ratio of 2∶3∶3 had strong antagonistic activity againstV.harveyi. Therefore,the complex LAB can be used as the composite microbial agent for the control ofV.harveyiin aquaculture.

lactic acid bacteria derived fish;complex;synergy inhibition;Vibrioharveyi

2016-11-28

林洋(1994-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制，E-mail：linyang19940109@163.com。

*通訊作者:白鳳翎(1964-)男，博士，教授，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制和食品微生物學(xué)，E-mail：baifling@163.com。

泰山學(xué)者藍(lán)色產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才團(tuán)隊(duì)支撐計(jì)劃項(xiàng)目(魯政辦字(2015)19號(hào))；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃課題(2015BAD17B05)。

TS254.4

:A

:1002-0306(2017)12-0196-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.036