, , , ,

(長(zhǎng)春科技學(xué)院生物食品學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130000)

?

響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝孢子粉中靈芝酸的破壁提取工藝

馮印,劉喬,李巖,劉艷,沈明浩*

(長(zhǎng)春科技學(xué)院生物食品學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130000)

目的:以超聲提取法為主,漆酶破壁法為輔助提取靈芝孢子粉中的靈芝酸,對(duì)影響提取得率的幾個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。方法:借助Design-Expert軟件,利用Placket-Burman實(shí)驗(yàn)從超聲時(shí)間、超聲次數(shù)、溶劑、料液比、酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度和pH這8個(gè)影響提取得率的因素中篩選出四個(gè)主要因素,分別為超聲時(shí)間、超聲次數(shù)、溶劑和酶解時(shí)間,在此基礎(chǔ)上,用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法進(jìn)行回歸分析。結(jié)果:當(dāng)超聲時(shí)間為3.2 h,溶劑用97%的乙醇,超聲次數(shù)2次,酶解時(shí)間1.2 h時(shí),提取得率達(dá)到最高,為3.40%,與初始提取得率2.4%相比,提取得率提高了1.4倍。結(jié)論:采用漆酶破壁與超聲提取方法較大幅度提高靈芝酸的提取得率,并縮短了提取時(shí)間。

漆酶,靈芝孢子粉,靈芝酸

靈芝,又稱“靈芝草”、“仙草”、“瑞草”,為擔(dān)子菌綱多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬(Ganoderma)真菌赤芝(G.lucidum)和紫芝(G.japonicum)的總稱[1],靈芝主要成分為多糖類和三萜類。自1982年KUBOTA[2]首次從靈芝(G.lucidum)子實(shí)體中分離得到三萜類化合物靈芝酸A和靈芝酸B后,各國(guó)都展開(kāi)了對(duì)靈芝三萜類化合物的研究,三萜類成分復(fù)雜,曾祥麗等[3]報(bào)道靈芝含有122種三萜類成分,其中最主要是靈芝酸37種,林志彬等研究認(rèn)為靈芝三萜具有抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、保肝、抗腫瘤和抗艾滋病毒等藥理活性[4-9],靈芝三萜類物質(zhì)(Ganoderma lucidum,Triterpenoid)對(duì)特異性細(xì)胞免疫也具有增強(qiáng)作用,可顯著增強(qiáng)小鼠體液免疫功能,并對(duì)非特異性免疫也具有調(diào)節(jié)作用[10]。

靈芝孢子具有堅(jiān)硬的雙層外壁結(jié)構(gòu),其成分幾丁質(zhì)含量為52.08%～57.64%,無(wú)機(jī)元素構(gòu)成以Si(19.01%)、Ca(24.31%)為主,硅和鈣摻入幾丁質(zhì)使得孢壁更加結(jié)實(shí)堅(jiān)硬,且耐酸堿,極難氧化分解[11],因此未破壁的靈芝孢子不易于提取其中的有效物質(zhì),朱江[12]等人采用復(fù)合酶酶解方法生產(chǎn)破壁靈芝孢子粉,本文采用漆酶酶解及超聲波技術(shù)結(jié)合的方法從未破壁的靈芝孢子粉中提取靈芝酸,并利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)將工藝優(yōu)化,工藝操作簡(jiǎn)單且提取得率高。漆酶可以酶解靈芝孢子的堅(jiān)硬的外壁,超聲波技術(shù)也可以利用其強(qiáng)烈的振動(dòng)和空化效應(yīng)輔助靈芝孢子中的靈芝酸提取出來(lái),將兩者結(jié)合起來(lái)并做一個(gè)優(yōu)化實(shí)驗(yàn),有效提高了靈芝酸的提取得率,縮短了提取時(shí)間,且成本低。這種方法可為靈芝酸的工業(yè)生產(chǎn)提供有利的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料和儀器

漆酶(4000 U/g) 購(gòu)于Sigma公司;靈芝孢子粉 購(gòu)于吉林市豐茂山珍特產(chǎn)店;無(wú)水乙醇、檸檬酸、磷酸二氫鈉、CHCl3、NaHCO3、齊墩果酸、香草醛冰醋酸 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

KQ-250B超聲波清洗器 東京理化器械株式會(huì)社;DZF-6050真空干燥箱 上海光譜儀器有限公司;N-1001D-WA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會(huì)社;722可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光學(xué)儀器一廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝酸的提取 稱取一定質(zhì)量靈芝孢子粉,加入適量漆酶和pH為6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,在70 ℃下破壁1 h,100 ℃滅酶10 min、真空干燥去掉緩沖液,加入98%的乙醇為溶劑超聲提取,超聲功率200 W,抽濾得濾液45 ℃減壓濃縮得棕黃色固油混合物,混合物復(fù)溶于100 mL的CHCl3中,用飽和NaHCO3溶液CHCl3/NaHCO3(體積比為1∶1)萃取3次,取NaHCO3溶層,用6 mol/L鹽酸酸化至pH 3～5后用等量CHCl3再萃取3次,合并CHCl3層,減壓濃縮干燥得黃色粗靈芝酸組分(GA)[13]。

1.2.2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 采用單因素實(shí)驗(yàn),分別考察超聲時(shí)間、超聲次數(shù)、溶劑、料液比、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH和加酶量8個(gè)因素,分別得最優(yōu)值為超聲時(shí)間3 h、超聲次數(shù)2次、溶劑為95%的乙醇、料液比1∶60、酶解時(shí)間1 h、酶解溫度70 ℃、pH6.0、加酶量2.0%(w/v)。

1.2.2.2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以測(cè)量樣液的吸光值為指標(biāo),在單因素的基礎(chǔ)上,選取影響結(jié)果的因素包括超聲時(shí)間、超聲次數(shù)、溶劑、料液比、酶量、酶解時(shí)間、酶解pH、酶解溫度8個(gè)因素,進(jìn)行n=12的Placket Burman因子篩選實(shí)驗(yàn),8個(gè)因素分別對(duì)應(yīng)表中的8個(gè)列,每個(gè)因素取低水平“-1”和高水平“1”,以測(cè)量的A值為響應(yīng)值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,得出各因素的F值和可信度水平。Placket-Burman因素水平表見(jiàn)表1。

表1 PB實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table in PB experiment

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表Table 2 Factors and levels table of Box-Behnken experimental design

1.2.2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定顯著因子的最佳值 利用軟件Design-Expert,對(duì)表2超聲時(shí)間、溶劑濃度、超聲次數(shù)、酶解時(shí)間,四個(gè)因素進(jìn)行三水平的29個(gè)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),各因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定及靈芝酸含量計(jì)算

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 精確稱取0.0093 g齊墩果酸(標(biāo)準(zhǔn)品)于50 mL容量瓶中用無(wú)水乙醇定容,制成0.0186 mg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的樣液于具塞試管中80 ℃水浴揮干,分別加入新配制的5%的香草醛冰醋酸溶液0.2 mL,高氯酸1.2 mL后70 ℃水浴保溫反應(yīng)15 min,流水冷卻至室溫,分別加入3.6 mL的乙酸乙酯,振蕩后靜置15 min,550 nm波長(zhǎng)下用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其吸光度[14-15]。以齊墩果酸濃度為橫坐標(biāo),測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出線性方程為A=47.377X+0.0035(R2=0.9989),表明齊墩果酸在該濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.2.3.2 靈芝酸提取得率計(jì)算 將提取出的粗靈芝酸組分用無(wú)水乙醇定容至10 mL,精確吸取一定體積的樣液于具塞試管中作為反應(yīng)樣液,參照1.2.3.1中標(biāo)準(zhǔn)曲線中的操作方法進(jìn)行反應(yīng)并測(cè)定吸光值,靈芝酸提取得率Y計(jì)算公式為:

Y=X×V×N/M×100=(A-0.0035)/47.377×V×N/M×100

式中:Y:靈芝酸提取得率(%);A:吸光值;X:反應(yīng)樣品濃度(mg/mL);V:反應(yīng)體系的體積(5 mL);N:定容的體積與反應(yīng)樣液之比(100);M:稱取孢子粉質(zhì)量(mg)。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert軟件(Version 7.0 Stat-EaseInc.,Minneapolis,MN,USA)對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸和方差分析,模型及因素的顯著性均通過(guò)F值考察(p<0.05),所有實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PB實(shí)驗(yàn)

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響因子結(jié)果見(jiàn)表3,因素水平及效應(yīng)分析見(jiàn)表4。

表3 Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值(n=12)Table 3 Placket-Burman experiment design and response values(n=12)

表4 Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平及效應(yīng)分析Table 4 Placket-Burman factor levels of experimental design and effect analysis

注:*差異顯著(p<0.05);**差異極顯著(p<0.01);表6同。 從表4中的主效應(yīng)分析可知,Placket-Burman的二水平范圍內(nèi),超聲次數(shù)、溶劑濃度、酶解時(shí)間、超聲時(shí)間影響極顯著,影響響應(yīng)值的因素順序依次為超聲次數(shù)、溶劑濃度、酶解時(shí)間、超聲時(shí)間。經(jīng)影響因素篩選,得到以吸光值為響應(yīng)值的線性回歸方程Y=0.93+0.056X1+3.167X5-003X2+0.065X3+0.070X4-0.027X5-0.016X6+0.016X7+0.058X8

方差分析模型Prob(P)=0.0009,表明所得回歸方程達(dá)到極顯著,即該模型在整個(gè)被研究的回歸區(qū)域擬合很好,復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9111,說(shuō)明相關(guān)性較好,本實(shí)驗(yàn)精密度達(dá)到15.092。

2.2二次回歸模型擬合及方差分析

采用Box-Behnken的中心原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以吸光值作為響應(yīng)值。以超聲次數(shù)、溶劑濃度、酶解時(shí)間、超聲時(shí)間四因素作為自變量,結(jié)果如表5所示。

表5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Box-Behnken experiment design and results

續(xù)表

表6 Box-Behnken ANOVA分析結(jié)果Table 6 Box-Behnken ANOVA analysis results

通過(guò)Design-Expert 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析,以吸光度A值為因變量(Y),超聲時(shí)間(A)、溶劑濃度(B)、超聲次數(shù)(C)和酶解時(shí)間(D)為自變量建立二次回歸方程為Y=1.49+0.095A+0.095B+0.19C+0.12D-5.000E-004AB-2.750E-003AC+0.062AD+0.072 BC+0.060BD+0.085CD-0.26A2-0.19B2-0.28C2-0.28D2

用響應(yīng)面分析軟件Design-Expert 7.0對(duì)表5的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合分析(analysis of variance,ANOVA)結(jié)果見(jiàn)表6。

2.3兩因素交互作用響應(yīng)面分析

響應(yīng)面分析圖見(jiàn)圖1,響應(yīng)面可以直接反映出各因子對(duì)響應(yīng)值的影響大小,由圖可知,AD、BC、CD的等高線形狀近乎于橢圓形,且變化稀疏,說(shuō)明AD、BC、CD即超聲時(shí)間和酶解時(shí)間、溶劑和超聲次數(shù)、超聲次數(shù)和酶解時(shí)間的二者之間交互作用顯著,且這幾個(gè)因素的值對(duì)影響值峰值影響較大。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析,響應(yīng)面分析得出一個(gè)最優(yōu)方案,即超聲時(shí)間3.22 h,溶劑乙醇濃度96.90%,超聲次數(shù)2.44次,酶解時(shí)間1.17 h;考慮到實(shí)際操作條件等情況,將最優(yōu)值調(diào)整為超聲時(shí)間3.2 h,溶劑用97%的乙醇,超聲次數(shù)2次,酶解時(shí)間1.2 h,在此條件下做三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得吸光值平均值為1.612,與理論預(yù)測(cè)值1.580接近,根據(jù)1.2.3.2中公式計(jì)算靈芝酸提取得率為3.40%,與初始提取得率2.4%相比,提取得率提高了1.4倍。預(yù)測(cè)主次因素依次為超聲次數(shù)>酶解時(shí)間>超聲時(shí)間>溶劑濃度。

圖1 各因素交互影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface graphs of factors interaction

3 結(jié)論

在前期單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用PB實(shí)驗(yàn)從八個(gè)影響因子之間篩選四個(gè)重要因子,再應(yīng)用BBD實(shí)驗(yàn)對(duì)這四個(gè)重要因素進(jìn)行優(yōu)化,建立了這四個(gè)因子之間的二次回歸模型,獲得應(yīng)用漆酶和超聲波技術(shù)提取靈芝孢子粉中的靈芝酸的最佳工藝,即超聲3.2 h,溶劑用97%的乙醇,超聲次數(shù)2次,酶解時(shí)間1.2 h,在此條件下做三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得吸光值平均值為1.612,與理論預(yù)測(cè)值1.580接近,根據(jù)1.2.3.2中公式計(jì)算靈芝酸提取得率為3.40%。有效提高了靈芝酸的提取得率,縮短了提取時(shí)間。

[1]Kubota T,Asaka Y,Miura I,et al. Structures of Ganoderic Acid A and B,Two New Lanostane Type Bitter Triterpenes from Ganoderma lucidum(FR.)KARST[J]. Helvetica Chimica Acta,1982,65(2):611-619.

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典[M]. 一部. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:137.

[3]曾祥麗,包海鷹.靈芝三萜類成分與藥理學(xué)研究進(jìn)展[J]. 菌物研究,2004,2(1):68-77.

[4]羅俊,林志彬. 靈芝三萜化合物藥理作用研究發(fā)展[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào),2002,37(7):42-46.

[5]El-Mekkawy S,Meselhy,Nakamura N,et al.Anti-HIV-1 and anti-HIV-1-protease from Ganoder maluciduma[J]. Phytochemistry.1998,49(5):1651-1657.

[6]王 斌,胡岳山,李杰芬. 靈芝三萜對(duì)小鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞增殖的影響[J].中藥材,2005,28(7):21-25.

[7]周昌艷,唐慶九,楊焱,等.靈芝中有效成分靈芝酸的抑制腫瘤作用研究[J].茵物學(xué)報(bào),2004,23(2):275-279.

[8]H H,C M,M R,et al. Effect of 26-oxygenosterols from Ganoderma lucidum and their activity as cholesterol synthesis inhibitors.[J]. Appl Environ Microbiol,2005,71(7):3653-3658.

[9]SB L,CH L,SS L,et al. Triterpene-Enriched Extracts From Ganoderma Lucidum Inhibit Growth Of Hepatoma Cells Via Suppressing Protein Kinase C,Activating Mitogen-Activated Protein Kinases And G2-Phase Cell Cycle Arrest[J]. Life Sciences,2003,72(21):2381-2390.

[10]姚雪坤,張玥,羅俊,等.靈芝三萜類物質(zhì)對(duì)環(huán)磷酰胺免疫抑制模型小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[A]. 2011 國(guó)際靈芝研究學(xué)術(shù)會(huì)議文集[C].2011.

[11]馬晶晶. 高速離心剪切粉碎對(duì)靈芝孢子粉破壁及特性的影響[D]. 武漢：武漢理工大學(xué),2006.

[12]朱江,梅躍明,李玉龍，等. 靈芝孢子粉的生產(chǎn)工藝研究[J]. 江西食品工業(yè),2006(4):29-29.

[13]李承范. 野生與種植靈芝中靈芝酸和總黃酮的提取及其含量測(cè)定[J]. 延邊大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2013,39(4):269-272.

[14]楊義芳. 中藥提取分離新技術(shù)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2010.

[15]楊林,林鵬,錢(qián)嬌玲,等.響應(yīng)面法優(yōu)化鎖陽(yáng)總黃酮超聲提取工藝[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2013,41(5):76-80.

Optimizationofwall-breakingextractiontechnologyofGanodericacidfromGanodermaSpores(GS)usingresponsesurfacemethodology

FENGYin,LIUQiao,LIYan,LIUYan,SHENMing-hao*

(College of Biological and Food,Changchun Science and Technology University,Changchun 130000,China)

Objective:Ganoderma Spores(GS)was used as raw material as the ultrasonic extraction as the main method and laccase wall-breaking method the secondary one to extract Ganoderic acid,the extraction factors affected the extraction ratio were optimized. Methods:Ultrasonic time,ultrasonic frequency,solvent and enzymolysis time were identified as the main factors from asonic time,ultrasonic frequency,solvent,solid-liquid ratio,enzyme amount,enzymolysis time,digestion temperature and pH which influenced the extraction ratio using experimental design of Placket-Burman(PB)by design-expert software. On this basis,the experimental design of Box - Behnken(BBD)and response surface analysis method was used for regression analysis. Results:When the ultrasonic time was 3.2 h,the solvent was 97% ethanol,ultrasonic frequency of 2 times,enzymolysis time for 1.2 h,reached the highest extraction rate was 3.40%,and the extraction yield increased 1.4 times compared with the initial design. The extraction rate of ganoderma lucidum acid was increased greatly and the extraction time was shorten by the combined ues of cell wall disruption with lasscase and ultrasonic extraction.

laccase;GS;Ganoderic acid

2016-12-12

馮印(1986-)，女，碩士，研究方向：食品微生物與功能性食品，E-mail：113889523@qq.com。

*通訊作者:沈明浩(1963-)，男，博士，教授，研究方向：食品毒理與安全，胚胎毒理，E-mail：shenmh2003@163.com。

TS255.1

:A

:1002-0306(2017)12-0191-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.035