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(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014; 2.四川旅游學(xué)院食品學(xué)院,四川成都 610100; 3.四川省植物工程研究院,四川成都 611700)

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川秋葵1號采后菌核病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性研究

辛松林1,2,焦露2,徐曉雪2,王輝3,秦文1,*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014; 2.四川旅游學(xué)院食品學(xué)院,四川成都 610100; 3.四川省植物工程研究院,四川成都 611700)

為明確引起川秋葵采后菌核病的病原菌種類及其主要生物學(xué)特性,從自然發(fā)病的川秋葵上分離到1株絲狀致病真菌,經(jīng)形態(tài)學(xué)特征觀察及rDNA ITS序列分析確定為腐皮鐮孢霉菌(Fusariumsolani),并對其進行了生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明:該菌生長的最適溫度為28 ℃,最適為pH7,最適生長NaCl濃度為0.5%;所考察的碳源、氮源、微量元素中,乳糖、天冬酰胺、檸檬酸鐵能顯著增加(p<0.05)腐皮鐮孢霉菌的菌落直徑,表明其對腐皮鐮孢霉菌的生長有益。

川秋葵1號,菌核病,鑒定,生物學(xué)特性

秋葵[Abelmoschusesculentus(L.)Moench]又名補腎草、羊角豆,屬于錦葵科秋葵屬一年生草本植物,原產(chǎn)于非洲,是一種廣泛種植于熱帶及亞熱帶的植物。2006～2015年,四川省植物工程研究院引種非洲黃秋葵成功,并從中選育出適合四川省栽培的黃秋葵新品種——川秋葵1號[1-2]。由于秋葵栽培范圍小、上市時間較為集中、不耐貯運、民眾認知度較低等原因,造成了秋葵在推廣、應(yīng)用的困難[3-4]。

菌核病病原菌屬[真菌子囊菌亞門盤菌綱(Discomycetes)核盤菌屬(Sclerotinia)核盤菌(Sclerotiorum)],寄主范圍十分廣泛,菌核病一旦傳入,很難根除。菌核病主要危害植物的莖稈,其次危害葉片和莢果,發(fā)病率為10%～30%,高者達80%以上。一般減產(chǎn)10%以上,高者達30%～50%,甚至絕產(chǎn),給農(nóng)村農(nóng)業(yè)經(jīng)濟造成了巨大的損失。菌核病常見的重要寄主包括油菜、向日葵、大豆等油料作物和萵苣、胡蘿卜及多種十字花科、豆科蔬菜[5]。關(guān)于秋葵菌核病病原菌的報道比較鮮見,秋葵菌核病發(fā)病初期,在病部產(chǎn)生綿絮狀白霉;隨著病害發(fā)展,病部萎蔫干腐;發(fā)病后期,常在干腐的髓腔內(nèi)形成鼠糞狀菌核[6]。本實驗擬通過形態(tài)學(xué)特征和rDNA ITS序列分析對其病原菌進行鑒定,分析致病菌種類并研究其代謝特點,以期為有效優(yōu)化秋葵采后保鮮工藝、研究秋葵果實對病原菌侵染的響應(yīng)機制提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)數(shù)據(jù)[7-11]。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

菌株 分離于采后貯藏過程中自然發(fā)病的川秋葵1號果實(2016年5～6月采自四川省植物工程研究院川秋葵1號種植基地);PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g,瓊脂粉15 g,葡萄糖20 g,蒸餾水1000 mL,不加瓊脂粉的為液體培養(yǎng)基。

真菌基因組DNA提取試劑盒Fungal DNA Kit(50) 購自O(shè)mega Bio-tek;CJ100凈化工作臺 北京賽博樂實驗儀器有限公司;恒溫水浴鍋、電子天平、培養(yǎng)箱等。

1.2實驗方法

1.2.1 菌種的分離與回接驗證 以秋葵病害樣本為對象,進行常規(guī)組織分離,經(jīng)過單孢分離、純化,純化菌株經(jīng)回接實驗確定其致病力后,于斜面PDA、4 ℃下保存待用[12]。

1.2.2 基因組DNA提取、PCR擴增以及序列測定 采用試劑盒提取菌株的 DNA,并對其ITS r DNA序列進行PCR擴增,PCR產(chǎn)物測序。測序由科標(biāo)技術(shù)(青島)研發(fā)中心完成,IT54、IT55序列如下:

IT54

IT55

1.2.3 菌株形態(tài)的顯微觀察 化供試菌株4 d后,取菌落邊緣新鮮菌餅(直徑5 mm),移植于PDA平板上,28 ℃恒溫箱中培養(yǎng),逐日觀察、記錄病原菌的培養(yǎng)性狀;同時鏡檢、觀察菌絲的形態(tài)。

1.2.4 不同生長條件對菌株生理特性的影響

1.2.4.1 溫度對菌株生長的影響 采用打孔器無菌制備直徑為5 mm的菌餅,將菌餅分別置于18、23、28、33、38 ℃恒溫培養(yǎng) 72 h后用十字交叉法測定菌落直徑[13]。每組設(shè)置 5 個平行實驗。

1.2.4.2 pH對菌株生長的影響 采用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基pH,分別為5、6、7、8、9,菌種于28 ℃下培養(yǎng)72 h后測定菌落直徑,測定方法同1.2.4.1。

1.2.4.3 鹽度對菌株生長的影響 采用含NaCl質(zhì)量分數(shù)為0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的PDA培養(yǎng)基,28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后測定菌落直徑,測定方法同1.2.4.1。

1.2.4.4 不同碳源條件下菌株的生長 以PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白組,分別用鼠李糖、蔗糖、果糖、海藻糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、鼠李糖+葡萄糖、鼠李糖+蔗糖替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖,28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后測定菌落直徑,測定方法同1.2.4.1。

1.2.4.5 不同氮源條件下菌株的生長 以PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白組,測試硝酸鈣、硝酸鉀、硝酸銨、硝酸鈉、硫酸銨、草酸銨、氯化銨、天冬酰胺、尿素和碳酸銨10種氮源對菌株生長的影響,28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后測定菌落直徑,測定方法同1.2.4.1。

1.2.4.6 不同微量元素條件下菌株的生長 以PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白組,測試微量元素硫酸鋅、硫酸亞鐵、四硼酸鈉、硫酸錳、鉬酸鈉、硫酸銅和檸檬酸鐵對菌株生長的影響,每1000 mL培養(yǎng)基中分別加入15 μg上述微量元素,28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后測定菌落直徑,測定方法同1.2.4.1。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1菌株分離與回接驗證

在自然發(fā)病的川秋葵上取病健交界處的組織在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d后(圖1a),得到1株簇生絨毛狀、無褶皺的絲狀真菌。將菌株在PDA培養(yǎng)基上純化后回接至川秋葵,在接種部位出現(xiàn)同樣的病癥(圖1b):病部表面生出白色霉層,并能從該病害部位再次分離得到該菌。因此,可以確定絲狀真菌為秋葵的致病菌。

圖1 自然發(fā)病川秋葵(a)與致病菌回接川秋葵(b)Fig.1 Isolation(a)and re-inoculation(b)of pathogenic bacteria from Abelmoschus esculentus(L.)Moench

2.2病原菌形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)分析

2.2.1 病原菌菌落形態(tài)分析 由圖2可知,28 ℃條件下PDA培養(yǎng)基上菌落生長較快,菌落呈圓形,邊緣整齊,正面為乳白色,背面初期為乳白色,逐漸變?yōu)榈S色,最終變?yōu)辄S色,培養(yǎng)到第15 d仍無孢子產(chǎn)生。培養(yǎng)到第4 d時(圖2a),菌落直徑達到4.35～4.45 cm,菌落質(zhì)地松散,菌絲呈乳白色、絨絮狀,菌絲滲透到培養(yǎng)基表面淺層,菌餅中心周圍1 cm內(nèi)菌絲中附著少量微小的白色透明顆粒;培養(yǎng)5 d時(圖2b),菌落直徑達到5.50～5.60 cm,培養(yǎng)基開始出現(xiàn)明顯的圓形溝紋,表面呈淡黃色;培養(yǎng)8 d(圖2c、2d),菌落長滿整個平板,直徑達到8.70～8.90 cm,白色透明微小顆粒增多,菌落圓形溝紋增多,背面黃色加深。

圖2 致病菌株的菌落形態(tài)Fig.2 Pathogenic strains of colony morphology

2.2.2 病原菌顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 圖3顯微形態(tài)觀察顯示,分離菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)至15 d仍無孢子產(chǎn)生,菌絲分枝較多且內(nèi)部隔膜觀察清晰,具有多個隔膜。

圖3 致病菌株的顯微形態(tài)(400×)Fig.3 Microscopic morphology of pathogenic strain(400×)

2.3 rDNA ITS區(qū)的PCR、同源性比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

圖4顯示了以致病菌基因組DNA為模板,以ITS4和ITS5為引物PCR擴增,得到PCR產(chǎn)物大小約1500～2000 bp。

圖4 病原菌的rDNA ITS區(qū)電泳檢測圖譜Fig.4 PCR product of pathogenic bacteria rDNA ITS

將 ITS rDNA 序列通過NCBI網(wǎng)站與GenBank中的已知序列進行同源性比較,發(fā)現(xiàn)其與Fusariumsp.自然聚類。通過鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果(圖5)進一步表明,菌株與Fusariumsp.的親緣關(guān)系最近。此外,形態(tài)學(xué)觀察表明致病菌株形態(tài)特征與腐皮鐮孢霉菌(Fusariumsolani)基本一致,因此可將本研究分離到的致病菌株確定為腐皮鐮孢霉菌(Fusariumsolani)。

圖5 以rDNA ITS序列為分子標(biāo)記的病原菌系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of pathogenic bacteria based on the sequences of ITS-r DNA

2.4腐皮鐮孢霉菌菌株的生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對菌株生長的影響 由圖6可見,腐皮鐮孢霉菌菌株在18～38 ℃培養(yǎng) 72 h菌株均能生長,溫度越高菌株生長的越旺盛,在28 ℃時菌落直徑達到最大值,且菌落直徑與其他溫度處理差異顯著(p<0.05),由此表明28 ℃是腐皮鐮孢霉菌的最適生長溫度。

圖6 溫度對菌落生長的影響Fig.6 Effects of temperature on colony growth

2.4.2 pH對菌株生長的影響 腐皮鐮孢霉菌菌株在pH 5～9內(nèi)恒溫培養(yǎng)72 h菌株均能生長。如圖7所示,pH在5～9時,隨著pH的增大菌株生長越快,當(dāng)pH為7時,腐皮鐮孢菌的生長速度最快,隨著pH進一步增大,腐皮鐮孢菌的生長速度下降。由此表明腐皮鐮孢菌的最適生長pH為7。

圖7 pH對菌落生長的影響Fig.7 Effects of pH on colony growth

2.4.3 NaCl對菌株生長的影響 如圖8所示,在NaCl濃度為0%～2.0%時均可生長,在NaCl濃度為0%～1.0%范圍內(nèi)，隨著NaCl濃度的升高，菌株生長顯著降低；而在NaCl濃度為1.0%～2.0%范圍內(nèi)，隨著NaCl濃度的升高，抑菌效果變化并不明顯，可見，NaCl對腐皮鐮孢霉菌的生長在特定濃度范圍內(nèi)具有明顯的抑制作用。

圖8 NaCl 濃度對菌落生長的影響Fig.8 Effects of NaCl concentration on colony growth

圖9 不同碳源對菌落生長的影響Fig.9 Effects of different carbon sources on colony growth

2.4.4 碳源對菌株生長的影響 在腐皮鐮孢霉菌對碳源利用的實驗中,菌株利用碳源的能力依次為乳糖>半乳糖>鼠李糖>海藻糖>果糖>蔗糖>蔗糖+鼠李糖>葡萄糖>葡萄糖+鼠李糖>甘露醇,且各處理組間差異不顯著(p>0.05),可見菌株對碳源的利用范圍較廣。

2.4.5 氮源對菌株生長的影響 如圖10所示,菌株培養(yǎng)72 h的測定結(jié)果顯示,在供試的10種氮源中,腐皮鐮孢菌利用氮源的能力依次為天冬酰胺>硝酸銨>硝酸鈉>硫酸銨>硝酸鈣>硝酸鉀>尿素>氯化銨>碳酸銨>草酸銨,且各處理組間差異極顯著(p<0.01),可見氮源對腐皮鐮孢菌生長的影響較顯著。

圖10 不同氮源對菌落生長的影響Fig.10 Effects of different nitrogen sources on colony growth

2.4.6 不同微量元素對菌株生長的影響 如圖11所示,在供試的8種微量元素中,與對照比較,菌株可以利用除四硼酸鈉、鉬酸鈉和硫酸錳以外的其他微量元素,腐皮鐮孢菌利用能力依次為檸檬酸鐵>硫酸亞鐵>硫酸銅>硫酸鋅>對照組,且各處理組間差異顯著(p<0.05),可見鐵元素對促進腐皮鐮孢菌的生長是有益的。

圖11 不同微量元素對菌落生長的影響Fig.11 Effects of different micronutrient on colony growth

3 討論與結(jié)論

腐皮鐮孢霉菌是常見的土壤習(xí)居菌,發(fā)病后產(chǎn)生菌絲,受害病葉與鄰近健株接觸即可傳病。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,通過對ITS區(qū)進行測序,診斷和檢測植物病原菌的方法得到了廣泛的應(yīng)用。一方面是由于rDNA的ITS區(qū)段具有保守性,此外,ITS區(qū)段在科、屬、種水平上均有特異性序列。核盤菌是兼性寄生菌,在5～30 ℃的溫度范圍內(nèi)均可形成菌核,適宜溫度為15～25 ℃。菌核為休眠結(jié)構(gòu),在土壤、病殘體和種子中均可存活。孫敬賢研究發(fā)現(xiàn),在陜西楊凌地區(qū),菌核越冬打破休眠后,4、5月份日均溫達到20 ℃左右,適合菌核萌發(fā),釋放大量的子囊孢子,導(dǎo)致菌核病大范圍的發(fā)生[14]。黃娟研究發(fā)現(xiàn)溫度和濕度是菌核病流行的關(guān)鍵因子,并認為核盤菌菌絲的最適生長溫度為25 ℃,在相對濕度超過85%的時候才能夠生長發(fā)育[15]。Smith認為低溫能夠誘導(dǎo)菌核萌發(fā)[16]。劉勇和布朗、特伯德在油菜菌核病菌室內(nèi)子囊孢子誘導(dǎo)和收集研究中發(fā)現(xiàn)菌核在10 ℃黑暗、濕潤條件下經(jīng)過2個月以上的低溫誘導(dǎo)處理后,在15～20 ℃下即可在室內(nèi)產(chǎn)生子囊盤[17]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn),PDA培養(yǎng)基有利于菌落生長和孢子的產(chǎn)生,28 ℃、pH7條件有利于菌絲的生長;菌株對NaCl比較敏感,特別是在NaCl濃度為0%～1.0%范圍內(nèi)，隨著NaCl濃度的升高，菌株生長顯著降低；而在NaCl濃度為1.0%～2.0%范圍內(nèi)，隨著NaCl濃度的升高，抑菌效果變化并不明顯，但對腐皮鐮孢霉菌的生長仍具有較明顯的抑制作用。菌株對碳源的適應(yīng)性比較強,所有測試碳源均可利用;不同氮源對菌株生長的影響可以達到極顯著(p<0.01),腐皮鐮孢菌利用氮源的能力依次為天冬酰胺>硝酸銨>硝酸鈉>硫酸銨>硝酸鈣>硝酸鉀>尿素>氯化銨>碳酸銨>草酸銨;在供試的8種微量元素中,菌株可以利用除四硼酸鈉、鉬酸鈉和硫酸錳以外的其他微量元素。

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ResearchonpathogenidentificationandbiologicalcharacteristicsofsclerotiniafromSichuanokra

XINSong-lin1,2,JIAOLu2,XUXiao-xue2,WANGHui3,QINWen1,*

(1.College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China; 2.College of Food Science,Sichuan Tourism College,Chengdu 610100,China; 3.Sichuan Academy of Botanical Engineering,Chengdu 611700,China)

In order to confirm the species and the major biological characteristics of the pathogen of sclerotinia on Sichuan okra. One pathogenic filamentous fungi was isolated from Sichuan okra,based on morphological observation and ITS rDNA sequence analysis,the pathogen was identified asFusariumsolani,the biological characteristics also was researched. The results showed that the optimum temperature of pathogen growth was 28 ℃,the optimum pH was 7,the optimum NaCl concentration was 0.5%. Among the carbon sources,nitrogen sources and trace elements,lactose,asparagine and ferric citrate could significantly increase the colony diameter ofFusariumsolani(p<0.05). It was beneficial to the growth ofFusariumsolani.

Sichuan okra;sclerotinia;pathogen identification;biological characteristics

2016-06-29

辛松林(1981-),男,在讀博士研究生,副研究員,主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏方面的研究,E-mail:23016024@qq.com。

*通訊作者:秦文(1967-),女,博士,教授,主要從事果蔬采后生理方面的研究,E-mail:qinwen1967@aliyun.com。

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)計劃項目(2016JY0119);四川省教育廳自然科學(xué)重點項目(16ZA0351)資助。

TS201.2

:A

:1002-0306(2017)12-0186-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.034