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(湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點實驗室,工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北武漢 430068)

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產(chǎn)角蛋白酶菌株的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

蔣彪,王常高,杜馨,林建國,蔡俊*

(湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點實驗室,工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北武漢 430068)

采用以羽毛為唯一碳氮源的無機鹽培養(yǎng)基,通過考察HC值(水解圈直徑與菌落直徑的比值)、羽毛的降解程度,篩選得到10株產(chǎn)角蛋白酶的菌株,經(jīng)測定10株菌株搖瓶發(fā)酵液的蛋白酶活力,確定了一株產(chǎn)酶能力較強的菌株CJPE209,并對菌株進行鑒定,菌株CJPE209被鑒定為芽孢桿菌(Bacillussp.),其發(fā)酵液酶活為267 U/mL。通過單因素實驗,確定了菌株CJPE209產(chǎn)角蛋白酶的最適發(fā)酵條件:發(fā)酵周期48 h,培養(yǎng)基裝液量25 mL/250 mL,發(fā)酵溫度37 ℃,初始pH7,搖床轉(zhuǎn)速220 r/min,發(fā)酵液酶活為337.6 U/mL,是優(yōu)化前的1.26倍。

角蛋白酶,產(chǎn)角蛋白酶菌株,篩選,鑒定,產(chǎn)酶條件

近年來,現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)的發(fā)展使養(yǎng)殖業(yè)擴大。據(jù)美國農(nóng)業(yè)部的調(diào)查,2011年中國生產(chǎn)的雞肉達到1.3千萬噸,2012年全球雞肉出口量達到9.1千萬噸[1]。而羽毛占雞肉的5%～7%,所以每年我國將產(chǎn)出近百萬噸的羽毛。角蛋白是廢棄羽毛的主要組成成分,粗蛋白含量可達到75%,且含有大量動物必需氨基酸和微量元素[2]。但是由于角蛋白是一種天然硬質(zhì)蛋白,其結(jié)構(gòu)中存在大量的二硫鍵,導(dǎo)致其比較穩(wěn)定,無法被普通蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶等)降解,大量羽毛被廢棄,造成大量資源浪費和環(huán)境污染[3-5]。

在傳統(tǒng)利用羽毛的過程中主要采取酸堿水解、熱降解等方法,但是前者存在污染環(huán)境問題,后者能耗比較大,并且在處理過程中會造成部分氨基酸被破壞,大大降低產(chǎn)品價值[6]。而生物產(chǎn)酶降解羽毛卻可以降低能耗同時不會造成環(huán)境污染。同時該酶還應(yīng)用于制革行業(yè)、醫(yī)療行業(yè)和食品行業(yè)等諸多方面[7-10]。

由微生物產(chǎn)角蛋白酶具有制備方便,降低污染等優(yōu)勢。Tanmay Paul[11]等利用PaenibacilluswoosongensisTKB2固體發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶,產(chǎn)酶水平為162.2 U/g。冀勇良[12]等用短小芽孢桿菌(BacilluspumilusZW-36)液體發(fā)酵產(chǎn)酶,酶活為57.14 U/mL。Ana Maria Mazotto[13]等用黑曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)酶,發(fā)酵周期7 d,酶活最高為172.7 U/mL。劉文濤[14]等采用一株工程菌(BaccillussubtilisWB600)進行補料分批發(fā)酵,27 h酶活達到864 U/mL。黃龐慧[15]等利用微生物產(chǎn)角質(zhì)酶和角蛋白酶共浴處理羊毛,取得了較好的改性效果,適用于紡織行業(yè)。本研究旨在篩選出一株高產(chǎn)角蛋白酶的菌株,并通過單因素實驗優(yōu)化菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件。同時本研究對工業(yè)上處理廢棄羽毛提供一定支持,降低大部分依靠化學(xué)處理廢棄羽毛對環(huán)境造成的壓力。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

土壤樣品 來自隨州盈豐養(yǎng)雞場,滅菌袋4 ℃保存?zhèn)溆?5%(W/V)水溶性角蛋白 東京化成工業(yè)株式會社;羽毛 隨州盈豐養(yǎng)雞場;羽毛粉 市售;福林酚試劑 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;富集培養(yǎng)基(g/L) 葡糖糖10.0、NaCl 5.0、牛肉膏5.0、蛋白胨10.0,pH自然;篩選培養(yǎng)基(g/L) 羽毛10.0、NaCl 5.0、K2HPO41.0、KH2PO40.5、MgSO41.0,pH自然;選擇性分離培養(yǎng)基(g/L) 干酪素4.0、CaCl23.0、NaCl 5.0、牛肉膏5.0、瓊脂粉16.0,pH自然;搖瓶種子培養(yǎng)基(g/L) NaCl 5.0、牛肉膏5.0、蛋白胨10.0,pH自然;斜面培養(yǎng)基(g/L) NaCl 5.0、牛肉膏5.0、蛋白胨10.0,pH自然;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 羽毛粉10.0、NaCl 5.0、K2HPO41.0、KH2PO40.5、MgSO41.0,pH自然;以上培養(yǎng)基均在1×105Pa條件下高壓滅菌20 min。

酶標(biāo)儀 Gene Company Limited;3K15冷凍離心機 德國Sigma公司;TGL-16C臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器制品廠;PHS-2F pH計 上海雷磁。

1.2實驗方法

1.2.1 富集培養(yǎng) 稱取10 g土樣加入到100 mL無菌生理鹽水中,將土樣搖勻打散,制備菌懸液。取4 mL菌懸液加入到富集培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.2 初篩 取2 mL富集培養(yǎng)基中菌液加入到篩選培養(yǎng)基中,于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h,觀察羽毛有無降解現(xiàn)象,取有降解現(xiàn)象的培養(yǎng)液2 mL于篩選培養(yǎng)基中,同樣條件培養(yǎng),重復(fù)3次,以篩選出能夠降解羽毛的菌株。

將最終得到的篩選培養(yǎng)基菌液進行梯度稀釋,取稀釋到10-5～10-7倍的菌懸液200 μL涂布于選擇性分離培養(yǎng)平板上(每個梯度3個平行),37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h,觀察水解圈的大小,挑取水解圈較大的菌落,再進行平板點樣,37 ℃培養(yǎng)48 h,比較水解圈直徑(Dp)和菌落直徑(Dc)比值(HC)的大小(HC=Dp/Dc)。挑選HC比值較大的菌株作為復(fù)篩出發(fā)菌株。

1.2.3 搖瓶復(fù)篩 將初篩得到的HC比值較大的菌株接種到種子培養(yǎng)基中37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,之后按2%接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中,于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液離心取上清液(粗酶液)測酶活。

1.2.4 酶活測定 由于凡是具有結(jié)締和保護功能的硬質(zhì)纖維蛋白都可被稱為角蛋白,且相同種類角蛋白氨基酸種類和含量也不相同,角蛋白酶酶活測定沒有統(tǒng)一的定義。本研究參照Yamamura S[16]等的測定方法,采用1%(W/V)水溶性角蛋白(用0.01 mol/L的pH9的Tris-HCl緩沖液稀釋)為底物,加入1 mL的粗酶液,55 ℃反應(yīng)15 min后,加入2 mL、0.4 mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng),離心取上清液1 mL加入4 mL、0.4 mol/L的碳酸鈉溶液,和1 mL的福林酚試劑混合,于40 ℃反應(yīng)20 min,在波長680 nm下檢測吸光值;對照組使用經(jīng)先加入三氯乙酸滅活的酶液。

酶活定義[16]:在上述反應(yīng)體系中,吸光值增加0.01為一個酶活單位(U/mL)。

通過酶標(biāo)儀導(dǎo)出測試樣品吸光值,通過公式(1)計算得到樣品酶活。

D=(A-B)×C×100

式(1)

其中,A表示實驗組吸光值,B表示對照組吸光值,C表示粗酶液稀釋倍數(shù),D表示酶活(U/mL)。

1.2.5 菌株鑒定和保藏 菌株鑒定和保藏由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)執(zhí)行。

1.2.6 菌株CJPE209發(fā)酵條件的優(yōu)化 初始培養(yǎng)條件為:接種量1%,裝液量50 mL/250 mL,37 ℃,發(fā)酵周期48 h,搖床轉(zhuǎn)速180 r/min,初始pH自然。

1.2.6.1 發(fā)酵時間的優(yōu)選實驗 發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件,調(diào)整發(fā)酵時間為12、24、36、48、60 h。研究發(fā)酵時間對CJPE209產(chǎn)酶的影響。

1.2.6.2 發(fā)酵溫度的優(yōu)選實驗 發(fā)酵周期取上述實驗確定的最優(yōu)結(jié)果,其它發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件,分別在33、35、37、39、41 ℃搖床中進行發(fā)酵培養(yǎng)后測定角蛋白酶酶活,考察溫度對菌種產(chǎn)角蛋白酶的影響。

1.2.6.3 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)選實驗 發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度取上述實驗確定的最優(yōu)結(jié)果,其它發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件,搖床轉(zhuǎn)速分別為120、140、160、180、200、220、240 r/min,考察搖床轉(zhuǎn)速對菌種產(chǎn)角蛋白酶的影響。

1.2.6.4 裝液量的優(yōu)選實驗 發(fā)酵時間、溫度、搖床轉(zhuǎn)速取上述實驗確定的最優(yōu)結(jié)果,其它發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件,采用250 mL搖瓶裝液,搖瓶裝液量分別為25、50、75、100、125 mL,考察裝液量對菌種產(chǎn)角蛋白酶的影響。

1.2.6.5 初始pH的優(yōu)選實驗 發(fā)酵時間、溫度、搖床轉(zhuǎn)速和裝液量實驗確定的最優(yōu)結(jié)果,其它發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件,調(diào)整初始pH分別為5、6、7、8、9和10,考察pH對菌株產(chǎn)角蛋白酶的影響。

1.3數(shù)據(jù)處理

實驗中每組三個平行,利用酶標(biāo)儀得到吸光值,通過計算得到酶活,采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)的顯著性分析。并通過Origin 8軟件作圖。

表1 32株菌株HC值Table 1 The HC of 32 strains

表2 10株菌株所產(chǎn)的角蛋白酶活力Table 2 Keratinase activity of 10 strains produced

2 結(jié)果與分析

2.1菌株的篩選及鑒定

2.1.1 菌株的篩選 從土壤樣品中分離得到32株初篩菌株,并通過平板點樣,測得菌株的HC值,比較HC值,其結(jié)果見表1。挑選出HC值較大的10株菌進行搖瓶復(fù)篩,測酶活,其結(jié)果見表2。最終確定23號菌株酶活力最高,達到267 U/mL,將這株菌重新命名為CJPE209。

2.1.2 菌株鑒定 經(jīng)16S rRNA基因序列分析比對,該菌株與芽孢桿菌屬的蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)等幾株芽孢桿菌屬的16S rRNA同源性都在99%以上,判定該菌屬芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。并且該菌株已于2015年12月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號為:CCTCC M 2015734。

2.2菌株CJPE209發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵時間的優(yōu)選實驗 由圖1可知在48 h內(nèi),發(fā)酵時間越長,酶活越高,且在48 h時酶活最高達到297.4 U/mL,此后,隨著發(fā)酵時間的延長,酶活開始降低,可能是由于發(fā)酵液中菌體需要的營養(yǎng)成分開始降低,代謝產(chǎn)物的積累,不利于該菌的生長,菌體自溶。并且隨發(fā)酵時間的延長,代謝產(chǎn)物也開始累計,可能對酶的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定影響,從而使酶活降低。所以,選取48 h作為CJPE209的適宜發(fā)酵時間。

圖1 發(fā)酵時間對菌株CJPE209產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of fermentation time on keratinase production by strain CJPE209

2.2.2 發(fā)酵溫度的優(yōu)選實驗 由圖2可知,溫度在37 ℃以下時,隨溫度上升酶活逐漸提高,37 ℃時酶活達到最高312.8 U/mL,但當(dāng)溫度繼續(xù)升高時,菌株自身代謝相關(guān)的酶受到影響,活性降低,進而影響到菌株的正常代謝,酶的合成能力變?nèi)?產(chǎn)酶減少。因此,最適發(fā)酵溫度定為37 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對菌株CJPE209產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on keratinase production by strain CJPE209

圖3 搖床轉(zhuǎn)速對菌株CJPE209產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of rotating speedkeratinase production by strain CJPE209

2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)選實驗 由圖3知,隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高,酶活逐漸增大,轉(zhuǎn)速達到220 r/min時酶活最高達到337.6 U/mL,繼續(xù)加快轉(zhuǎn)速,酶活反而呈下降趨勢。轉(zhuǎn)速影響發(fā)酵過程中溶氧和物質(zhì)交換,在轉(zhuǎn)速達到220 r/min前,隨轉(zhuǎn)速增大溶氧和物質(zhì)交換增加,菌株產(chǎn)酶增加,但是當(dāng)轉(zhuǎn)速超過220 r/min時,溶氧和物質(zhì)交換不是菌株產(chǎn)酶的制約因素;可能隨轉(zhuǎn)速增加,剪切力也隨之增加,制約了菌株生長和產(chǎn)酶[17]。因此,220 r/min為最佳搖床轉(zhuǎn)速。

2.2.4 發(fā)酵搖瓶裝液量的優(yōu)選實驗 由圖4可知,在裝液量為25 mL/250 mL時酶活達到最大值332 U/mL,裝液量影響的是發(fā)酵過程中通氣及溶氧條件,裝液量越少,通氣和溶氧加大。但是由于培養(yǎng)基中存在固形物成分-羽毛粉,在250 mL三角瓶中進行發(fā)酵時,當(dāng)裝液量過小時,羽毛粉極易粘附于三角瓶壁上,無法參與發(fā)酵。因此,當(dāng)裝液量為25 mL/250 mL時最適合菌體的生長和產(chǎn)酶。

圖4 裝液量對菌株CJPE209產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of loading volume on keratinase production by strain CJPE209

2.2.5 初始pH的優(yōu)選實驗 由圖5知,pH從5～7的過程中,酶活隨著pH的升高而增大,在pH為7時酶活最大達到335 U/mL。而初始pH升高,培養(yǎng)基呈堿性,菌體生長受到影響,同時影響菌體細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝物的分泌,使菌株產(chǎn)酶能力下降。因此,pH 7為最適初始發(fā)酵pH。

圖5 初始pH對菌株CJPE209產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of initial pH on keratinase production by strain CJPE209

3 結(jié)論

以羽毛為唯一碳氮源,從自然界中篩選到32株能夠產(chǎn)角蛋白酶的菌株,經(jīng)復(fù)篩后得到CJPE209這株產(chǎn)酶能力較強的菌株,其初始酶活為267 U/mL。經(jīng)鑒定CJPE209為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。該菌株發(fā)酵周期較短,產(chǎn)酶能力較強。通過單因素實驗對該菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化,得到該菌的最佳培養(yǎng)條件:發(fā)酵周期48 h,發(fā)酵溫度37 ℃,搖床轉(zhuǎn)速220 r/min,培養(yǎng)基裝液量25 mL/250 mL,初始pH7。通過優(yōu)化發(fā)酵條件后,發(fā)酵液酶活為337.6 U/mL,是優(yōu)化前的1.26倍。本研究得到CJPE209菌株產(chǎn)酶效果較好,為廢棄羽毛的有效利用提供了一定支撐,在后續(xù)研究中,還需要對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化、酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用等方面的研究。

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Screeningofproductionkeratinasestrainsandoptimizationoffermentationconditions

JIANGBiao,WANGChang-gao,DUXin,LINJian-guo,CAIJun*

(Key Laboratory of Fermentation Engineering(Ministry of Education),Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

In this research,a medium in which feather was the sole nitrogen source was used for screening microorganisms which product keratinase. By examining HC value(the ratio of hydrolysis spot diameter to colony diameter)and degradation rate of feather,10 strains were got. By comparing the enzyme activity of the fermentation culture of the 10 strains,a strain named CJPE209 which highly product keratinase was selected for next research. CJPE209 was identified asBacillussp..Through the method of sigle-factor experiments,the optimal fermentation condition of CJPE209 was determined as follows-fermentation time 48 h,loading volume 25 mL/250 mL,fermentation temperature 37 ℃,initial pH7,rotation rate 220 r/min. After optimization,the enzyme activity of fermentation culture reached 337.6 U/mL which was 1.26 folds as high as that before optimization.

keratinase;production keratinase strains;screening;identification;keratinase production condition

2016-10-14

蔣彪(1989-)，男，碩士，研究方向:發(fā)酵過程優(yōu)化與放大，E-mail:445746520@qq.com。

*通訊作者:蔡俊(1968-)，男，博士，教授，研究方向：微生物發(fā)酵工程，E-mail:hgcaijun@126.com。

國家自然科學(xué)基金項目(31401807)。

TS201.2+5

:A

:1002-0306(2017)12-0182-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.033