, ,文,2,*, ,2,,2,,2,

(1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723000; 2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心,陜西漢中 723000)

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基于胞外多糖和菌絲生物量的香菇發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

王穎1,陳琰1,陳文強1,2,*,彭浩1,2,鄧百萬1,2,解修超1,2,何強1

(1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723000; 2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心,陜西漢中 723000)

為研究液體發(fā)酵培養(yǎng)基對香菇胞外多糖和菌絲生物量的影響,以秦巴山區(qū)香菇808菌株為試材,采用Plackett-Burman設(shè)計實驗、最陡爬坡實驗和響應(yīng)曲面法對其液體發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源和其它營養(yǎng)物質(zhì)進行優(yōu)化。結(jié)果表明,香菇胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組合是(g/500 mL)：蔗糖7.18,玉米粉15.00,麥麩14.05,酵母膏0.35,KH2PO40.50,MgSO4·7H2O 0.50,pH自然,胞外多糖實測值為0.967 g/500 mL;香菇菌絲生物量發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組合是(g/500 mL):蔗糖7.18,玉米粉15.00,麥麩14.05,酵母膏0.35,KH2PO40.75,MgSO4·7H2O 0.50,pH自然,菌絲生物量實測值為28.146 g/500 mL。優(yōu)化后的香菇胞外多糖產(chǎn)量和菌絲生物量較優(yōu)化前分別提高12.44%和11.00%。此研究結(jié)果可為香菇液體發(fā)酵的中試生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

胞外多糖,生物量,香菇,發(fā)酵培養(yǎng)基,響應(yīng)曲面法

香菇(Lentinusedodes),又名冬菇、香蕈、北菇、花菇等,是擔(dān)子菌綱傘形科真菌,世界名貴食藥用菌之一,因其含有高蛋白、低脂肪、多種氨基酸和多種維生素而受到消費者的廣泛認可[1-2]。香菇多糖作為香菇的重要活性成分之一,具有調(diào)節(jié)免疫、降血脂、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗感染等作用[3-5],在臨床醫(yī)學(xué)方面,也被廣泛應(yīng)用于免疫增強劑、惡性腫瘤的輔助治療及增強化療療效并降低毒副反應(yīng)等[6-7]。

眾多研究表明,食用菌液體發(fā)酵技術(shù)比傳統(tǒng)生產(chǎn)方法具有顯著的優(yōu)勢。在其發(fā)酵過程中,反應(yīng)器內(nèi)的營養(yǎng)菌絲能在最適的溫度、酸堿度、氧氣濃度和碳氮比等條件下生長,呼吸作用所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物能及時排放,因此新陳代謝旺盛、菌絲分裂迅速,從而縮短生長周期、提高菌絲產(chǎn)量,同時還能保持菌絲營養(yǎng)成分和藥用效果[8-9];另外,液體菌種接入固體培養(yǎng)料,又具有流動快、萌發(fā)快、易分散、發(fā)菌點多、出菇整齊等特點[10-12]。香菇808是秦巴山區(qū)主栽的高產(chǎn)特優(yōu)食用菌菌種之一,菇型圓整、肉厚、柄短,子實體茶褐色,出菇溫度10～28 ℃,菌齡90～120 d,屬袋栽中熟菌株。目前,有關(guān)香菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基的研究報道較多[13-14],但得到的胞外多糖產(chǎn)量和菌絲生物量普遍較低,且以秦巴山區(qū)香菇808菌株胞外多糖產(chǎn)量和菌絲生物量為主要指標,采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法聯(lián)合優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)基尚無研究報道。本研究以秦巴山區(qū)香菇808菌株胞外多糖產(chǎn)量和菌絲生物量為主要指標,采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法聯(lián)合優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)基,旨在為香菇液體發(fā)酵的中試生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

LRH-250-GS型數(shù)顯式恒溫培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1F型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;ZHWY-210 2C型數(shù)顯式恒溫搖床 上海志成有限公司;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;TB-214型電子分析天平 北京賽得利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液體種子的制備 將香菇808菌株原種轉(zhuǎn)至CPDA斜面,28 ℃培養(yǎng)至菌絲滿管,備用。配制基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,500 mL三角瓶裝量為250 mL,將0.5 cm2斜面菌種2塊接于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,每次實驗做3個重復(fù),靜置24 h,26 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)10 d。

1.2.2 香菇菌絲生物量的測定 將待測菌株發(fā)酵液置于布氏漏斗中,抽濾至不滴水,電子分析天平稱重(鮮重),取平均值[15]。

1.2.3 香菇胞外多糖的測定 將抽濾后的發(fā)酵液濃縮至原體積的1/5,取濃縮液10 mL,加無水乙醇40 mL,調(diào)節(jié)pH至7.0,4 ℃冰箱放置16 h,4000 r/min離心15 min,沉淀依次用丙酮、乙醚洗滌3次,60 ℃烘干至恒重,電子分析天平稱重,取平均值。

1.2.4 Plackett-Burman實驗設(shè)計 選用n=12的Plackett-Burman實驗設(shè)計,以蔗糖(X1)、玉米粉(X2)、麥麩(X3)、酵母膏(X4)、KH2PO4(X5)、MgSO4·7H2O(X6)(6個實際量和5個空項)為自變量,菌株胞外多糖產(chǎn)量(Y1)和菌絲生物量(Y2)為響應(yīng)值,可用最少實驗次數(shù)盡可能精確地篩選出對Y1和Y2影響顯著的因素[16]。每個因素分別取高(+1)低(-1)兩個水平,高水平為低水平的1.5倍,水平編碼見表1。

表1 Plackett-Burman實驗設(shè)計因素及水平表Table 1 The factors and levels table of Plackett-Burman experiment design

1.2.5 最陡爬坡實驗 根據(jù)Plackett-Burman實驗結(jié)果,以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向,以各因素效應(yīng)值的大小確定步長,使正效應(yīng)的值逐步增加,負效應(yīng)的值逐步減小。其它不顯著因素中,正效應(yīng)的取高水平,負效應(yīng)的取低水平,尋找最佳響應(yīng)區(qū)域。

1.2.6 Box-Behnken實驗設(shè)計 依據(jù)Plackett-Burman實驗和最陡爬坡實驗確定的因素與水平,采用Box-Benhnken實驗設(shè)計對香菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行3因素3水平的響應(yīng)曲面優(yōu)化。3個水平以(-1,0,+1)編碼(見表2),對數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合,得到包括一次項、平方項和交互項的二次方程,分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)[17],最后在一定水平范圍內(nèi)求取最佳值。

表2 Box-Benhnken實驗設(shè)計Table 2 Box-Benhnken experimental design

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 采用Minitab 17軟件和Excel 2003對Plackett-Burman實驗結(jié)果進行分析,采用Design-Expert 8.0.6軟件對Box-Behnken實驗結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman實驗

通過Minitab 17軟件和Excel 2003考察蔗糖(X1)、玉米粉(X2)等11個因素對菌株胞外多糖產(chǎn)量(Y1)和菌絲生物量(Y2)的影響,結(jié)果見表3、表4。

表3 Plackett-Burman實驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Plackett-Burman design and results

表4 Plackett-Burman試驗分析結(jié)果Table 4 Result of regression analysis of Plackett-Burman design

由表3、表4可見,在香菇808菌株液體發(fā)酵過程中,蔗糖(X1)、麥麩(X3)和酵母膏(X4)三個因素對菌株胞外多糖產(chǎn)量(Y1)和菌絲生物量(Y2)影響顯著。其中,當X1、X3的量增加時,Y1和Y2均明顯增加,所以X1、X3為正效應(yīng)因素;當X4的量增加時,Y1和Y2反而降低,所以X4為負效應(yīng)因素。因此,可將X1、X3、X4作為主要因素進行響應(yīng)曲面實驗。

2.2最陡爬坡實驗

根據(jù)Plackett-Burman實驗結(jié)果,將蔗糖(X1)和麥麩(X3)的量逐步增加,酵母膏(X4)的量逐步減小,其它不顯著因素中,正效應(yīng)的取高水平,負效應(yīng)的取低水平,尋找最佳響應(yīng)區(qū)域。結(jié)果見表5。

表5 最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Experimental design and results of steepest ascent path

由表5可見,當蔗糖10.50 g/500 mL、麥麩18.00 g/500 mL、酵母膏0.75 g/500 mL時,測得發(fā)酵液中菌絲胞外多糖產(chǎn)量最大值為0.860 g/500 mL,菌絲生物量最大值為25.357 g/500 mL,所以,后續(xù)響應(yīng)曲面實驗以第4實驗組各因素水平為中心值進一步設(shè)計優(yōu)化。

2.3 Box-Benhnken實驗

根據(jù)表2因素水平,采用Box-Benhnken實驗設(shè)計對香菇808菌絲液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行3因素3水平響應(yīng)曲面優(yōu)化,結(jié)果見表6。

表6 Box-Behnken中心組合因素水平編碼表Table 6 Independent variables and coded levels in Box-Behnken experimental design

表7 Y1方差分析表Table 7 ANOVA table of Y1

注:*、**分別為0.05及0.01水平上的顯著性差異;表8同。

2.4回歸模型和方差分析

采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對表6數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合,尋求最優(yōu)響應(yīng)因子水平,整理得到關(guān)于胞外多糖產(chǎn)量回歸方程如式(1),回歸方程方差分析見表7;得到關(guān)于菌絲生物量回歸方程如式(2),回歸方程方差分析見表8。

表8 Y2方差分析表Table 8 ANOVA table of Y2

Y1=-0.147+0.105X1+0.090X3+1.278X4+(1.323-003)X1X3+0.059X1X4-0.040X3X4-(9.826E-003)X12-(3.772E-003)X32-1.607X42

式(1)

Y2=-13.518+1.876X1+4.230X3+50.631X4-0.063X1X3+2.702X1X4-1.989X3X4-0.133X12-0.130X32-60.997X42

選用抗性品種；輪作倒茬，合理施肥澆水；施用充分腐熟優(yōu)質(zhì)有機肥，避免使用未腐熟糞肥，以免把蟲源帶入田間；優(yōu)化農(nóng)田生態(tài)條件，鏟除地頭、渠溝邊雜草，降低蚜蟲越冬基數(shù)。

式(2)

由表7結(jié)果可見,模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9767,說明該方程模型與實驗數(shù)據(jù)有97.67%的符合度;模型p值小于0.0001,差異極顯著,說明該模型有意義;失擬項p值為0.9136>0.05,說明失擬項差異不顯著,沒有出現(xiàn)失擬現(xiàn)象,實驗操作可信。各因素中X1、X4、X12、X32、X42項差異極顯著,X1X4、X3X4項差異顯著,X3、X1X3項差異不顯著。從p值可看出這三個因素對香菇菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響順序:X1>X4>X3,即蔗糖>酵母膏>麥麩。

由表8結(jié)果可見,模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9706,說明該方程模型與實驗數(shù)據(jù)有97.06%的符合度;模型p值為0.0001<0.01,差異極顯著,說明該模型有意義;失擬項p值為0.4631>0.05,說明失擬項差異不顯著,沒有出現(xiàn)失擬現(xiàn)象,實驗操作可信。各因素中X1、X4、X32、X42項差異極顯著,X1X4、X3X4、X12項差異顯著,X3、X1X3項差異不顯著。從p值可看出這三個因素對菌絲生物量的影響順序:X1>X4>X3,即蔗糖>酵母膏>麥麩。

2.5響應(yīng)曲面分析

分析回歸方程,繪制菌株胞外多糖產(chǎn)量(Y1)和菌絲生物量(Y2)隨各因素變化的響應(yīng)曲面圖,每個響應(yīng)曲面分別代表兩個獨立因素間的相互作用,第三個因素保持在編碼0水平。曲面越陡峭,影響越顯著[18],擬合的響應(yīng)曲面能直觀反映各因素之間的交互作用。

2.5.1 菌株胞外多糖產(chǎn)量(Y1)的響應(yīng)曲面分析 繪制響應(yīng)曲面圖見圖1、圖2,考察響應(yīng)曲面圖的形狀,確定蔗糖(X1)、麥麩(X3)、酵母膏(X4)三個因素及其交互作用對香菇808號菌株胞外多糖產(chǎn)量(Y1)的影響。

圖1 Y1=f(X1,X4)響應(yīng)曲面圖Fig.1 Response surface of Y1=f(X1,X4)

由圖1結(jié)果可見,在低蔗糖含量條件下,隨著酵母膏含量增加,胞外多糖產(chǎn)量先緩慢上升,當酵母膏含量達0.33 g/500 mL后迅速下降;在高蔗糖含量條件下,隨著酵母膏含量增加,菌絲胞外多糖產(chǎn)量先緩慢上升,當酵母膏含量達0.45～0.57 g/500 mL時,胞外多糖產(chǎn)量緩慢下降,酵母膏含量超過0.57 g/500 mL后迅速下降;在低酵母膏含量和高酵母膏含量條件下,隨著蔗糖含量的增加,胞外多糖產(chǎn)量均呈先迅速上升至平緩,當蔗糖含量達7.88 g/500 mL后呈緩慢下降的趨勢。

圖2 Y1=f(X3,X4)響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface of Y1=f(X3,X4)

由圖2結(jié)果可見,在低麥麩含量條件下,隨著酵母膏含量增加,胞外多糖產(chǎn)量先迅速上升至平緩,當酵母膏含量超過0.45 g/500 mL后迅速下降;在麥麩高含量條件下,隨著酵母膏含量增加,胞外多糖產(chǎn)量略有上升后迅速下降;在酵母膏低含量條件下,隨著麥麩含量增加,胞外多糖產(chǎn)量先迅速上升至平緩,當麥麩含量超過10.80 g/500 mL后緩慢下降;在高酵母膏含量條件下,隨著麥麩含量的增加,胞外多糖產(chǎn)量先迅速上升,當麥麩含量達到8.10 g/500 mL后迅速下降。

2.5.2 菌絲生物量(Y2)的響應(yīng)曲面分析 繪制響應(yīng)曲面圖見圖3、圖4,考察響應(yīng)曲面圖的形狀,確定蔗糖(X1)、麥麩(X3)、酵母膏(X4)三個因素及其交互作用對香菇808號菌絲生物量(Y2)的影響。

圖3 Y2=f(X1,X4)響應(yīng)曲面圖Fig.3 Response surface of Y1=f(X1,X4)

由圖3結(jié)果可見,在低蔗糖含量條件下,隨著酵母膏含量的增加,菌絲生物量先略有上升,當酵母膏含量超過0.33 g/500 mL后迅速下降;在高蔗糖含量條件下,隨著酵母膏含量的增加,菌絲生物量先緩慢上升,當酵母膏含量達到0.45 g/500 mL后緩慢下降;在低酵母膏含量條件下,隨著蔗糖含量的增加,菌絲生物量略有上升后略有下降;在高酵母膏含量條件下,隨著蔗糖含量的增加,菌絲生物量先迅速上升,當蔗糖含量達到7.88 g/500 mL后繼續(xù)緩慢上升。

圖4 Y2=f(X3,X4)響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface of Y1=f(X3,X4)

由圖4結(jié)果可見,在低麥麩含量條件下,隨著酵母膏含量增加,菌絲生物量先迅速上升至平緩,當酵母膏含量達到0.45 g/500 mL后迅速下降;在高麥麩含量條件下,隨著酵母膏含量增加,菌絲生物量略有上升,當酵母膏含量達到0.33 g/500 mL后迅速下降;在低酵母膏含量條件下,隨著麥麩含量增加,菌絲生物量迅速上升,當麥麩含量達到13.50 g/500 mL后緩慢下降;在高酵母膏含量條件下,隨著麥麩含量的增加,菌絲生物量迅速上升至平緩,當麥麩含量達到10.80 g/500 mL后迅速下降。

2.6驗證實驗

在實際生產(chǎn)過程中,為降低成本,盡可能使用廉價原料,所以在Design-Expert 8.0.6軟件的“Criteria”選項中,選取X1和X4的“Goal”值均為“in range”,X3的“Goal”值為“maximize”,Y1、Y2的“Goal”值為“maximize”,確定影響菌株胞外多糖產(chǎn)量和菌絲生物量主要因素的最優(yōu)值為(g/500 mL):蔗糖7.18,麥麩14.05,酵母膏0.35,此時菌株胞外多糖產(chǎn)量預(yù)測值為0.953 g/500 mL,菌絲生物量預(yù)測值為27.829 g/500 mL。為檢驗該提取工藝的可靠性,分別采用上述最優(yōu)發(fā)酵條件進行驗證性實驗,三次重復(fù)取平均值后得到菌絲胞外多糖產(chǎn)量實測值為0.967 g/500 mL,與預(yù)測值相對誤差為+1.47%,相比初始培養(yǎng)條件下胞外多糖產(chǎn)量0.860 g/500 mL提高了12.44%;菌絲生物量實測值為28.146 g/500 mL,與預(yù)測值相對誤差為+1.14%,相比初始培養(yǎng)條件下菌絲生物量25.357 g/500 mL提高了11.00%。

3 討論與結(jié)論

以秦巴山區(qū)香菇808菌株胞外多糖產(chǎn)量和菌絲生物量為主要指標,通過響應(yīng)曲面法聯(lián)合優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)基,其胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組合為(g/500 mL):蔗糖7.18,玉米粉15.00,麥麩14.05,酵母膏0.35,KH2PO40.50,MgSO4·7H2O 0.50,pH自然,菌絲胞外多糖產(chǎn)量實測值為0.967 g/500 mL;菌絲生物量發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組合為(g/500 mL)：蔗糖7.18,玉米粉15.00,麥麩14.05,酵母膏0.35,KH2PO40.75,MgSO4·7H2O 0.50,pH自然,菌絲生物量實測值為28.146 g/500 mL。優(yōu)化后香菇菌絲胞外多糖產(chǎn)量和菌絲生物量較初始培養(yǎng)條件下的產(chǎn)量分別提高了12.44%和11.00%。

近年來,采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化香菇發(fā)酵培養(yǎng)基測定菌絲生物量、并從發(fā)酵液中提取胞外多糖的研究報道較少。趙俊杰[19]采用單因素實驗和正交實驗確定香菇B08菌株發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組合,多糖產(chǎn)量為1.58 g/L,本研究得到香菇胞外多糖產(chǎn)量比趙俊杰的研究報道提高了22.41%。另外,陳文強[15]等在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化香菇南山1#液體種生產(chǎn)工藝,菌絲生物量達51.004 g/L;梁寶東[20]等采用正交實驗確定香菇武856菌株發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配比,菌絲生物量達55.00 g/L,本研究得到的香菇菌絲生物量比前二者的研究報道分別提高10.37%和2.35%。

本研究以香菇808菌株胞外多糖產(chǎn)量和菌絲生物量為主要指標,采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組合,可為香菇液體深層發(fā)酵的中試生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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OptimizationoffermentationmediumforextracellularpolysaccharidesandbiomassbyLentinusedodes

WANGYing1,CHENYan1,CHENWen-qiang1,2,*,PENGHao1,2,DENGBai-wan1,2,XIEXiu-chao1,2,HEQiang1

(1.School of Biological Science and Engineering,Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723000,China; 2.Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicated Fungi,Hanzhong 723000,China)

Optimization of fermentation medium for extracellular polysaccharides(EPS)and biomass byLentinusedodeswas studied by the method with Plackett-Burman design,the steepest ascent experiment and Box-Behnken design. TheLetinousedodes808 was used as the test material,for study the effect of liquid fermentation medium on the extracellular polysaccharide and mycelial biomass ofLentinulaedodes. The results showed that the best medium combination for EPS were(g/500 mL)sucrose 7.18,corn meal 15.00,wheat bran 14.05,yeast extract 0.35,KH2PO40.50,MgSO4·7H2O 0.50,natural pH. In this condition,EPS yield was 0.967 g/500 mL. The best medium combination for biomass yield were(g/500 mL)sucrose 7.18,corn meal 15.00,wheat bran 14.05,yeast extract 0.35,KH2PO40.75,MgSO4·7H2O 0.50,natural pH. In this condition,biomass yield was 28.146 g/500 mL. All of the EPS yield and the biomass yield in the fermentation medium increased 12.44% and 11.00% as compared with that in the initial medium. This results could provide a theoretical basis for fermentation pilot production ofLentinusedodes.

extracellular polysaccharides(EPS);biomass;Lentinusedodes;fermentation medium;response surface methodology

2016-10-18

王穎(1994-)，女，碩士研究生，主要從事微生物資源利用開發(fā)方面的研究，E-mail：306104241@qq.com。

*通訊作者:陳文強(1956-)，男，大學(xué)本科，教授，主要從事微生物資源保育及開發(fā)利用方面的研究，E-mail：wenqiangc@126.com。

陜西省“13115”科技創(chuàng)新工程計劃項目(2008ZDGC-04)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)12-0176-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.032