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(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室, 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 2.北京林業(yè)大學生物科學與技術學院,北京 100083; 3.大連東霖食品股份有限公司,遼寧大連 116101)

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96孔板法篩選抗黑曲霉性乳酸菌及抑菌機理研究

馬歡歡1,林洋1,呂欣然2,孫夢桐1,白鳳翎1,*,勵建榮1,宋強3

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室, 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 2.北京林業(yè)大學生物科學與技術學院,北京 100083; 3.大連東霖食品股份有限公司,遼寧大連 116101)

目的:篩選對黑曲霉具有良好拮抗作用的乳酸菌菌株。方法:采用96孔板法進行乳酸菌優(yōu)良菌株的篩選。研究pH和溫度等因素對抗菌特性的影響,利用氣相測定菌株DL3無細胞上清液(CFS)中有機酸含量,研究抑菌活性物質;利用掃描電鏡分析孢子細胞的完整性,研究抑菌機理。結果:從傳統(tǒng)東北酸菜分離的乳酸菌中篩選對黑曲霉具有較強抑制作用的植物乳桿菌DL3,其抑菌率為92.28%。在pH2.5～6.5對黑曲霉具有抑菌活性,并具有良好的熱穩(wěn)定性,121 ℃處理30 min后抑菌率僅降低5.71%。經(jīng)氣相色譜分析表明菌株DL3 CFS中乳酸、乙酸、丙酸和苯乳酸含量分別為5.743、1.635、0.033、0.085 μg/mL,乳酸和乙酸對黑曲霉的抑菌率分別為91.69%和92.04%,丙酸和苯乳酸均無抑菌作用,初步判斷菌株DL3的抑菌活性物質為有機酸類。掃描電鏡觀察表明菌株DL3 CFS破壞了黑曲霉孢子的完整性,導致細胞膜溶解,胞內物質外泄。結論:菌株DL3 CFS中對黑曲霉的抑菌活性主要來自于乙酸和乳酸,可作為米面制品的乳酸菌生物防霉劑的出發(fā)菌株。

乳酸菌,抑制,黑曲霉,96孔板法,篩選,有機酸

黑曲霉(Aspergillusniger)廣泛分布于土壤、空氣等自然環(huán)境中,可引起米粉、面包、蛋糕等米面制品的霉腐變質[1-2]。乳酸菌作為益生菌可通過生態(tài)位和營養(yǎng)物競爭、產(chǎn)生抗真菌肽和酸性物質等方式有效控制真菌的生長繁殖[3-4]。目前,應用乳酸菌控制食品中由霉菌引起的霉腐變質的研究已有相關報道。Varsha等[5]研究發(fā)現(xiàn),LactobacilluscaseiDY2和PediococcuspentosaceusTG2等對FusariumoxysporumKACC 42109、A.nigerKACC42589和FusariummoniliformeKACC08141等霉菌的抑菌直徑均大于10 mm,經(jīng)ESI-MS和HPLC分析表明,抑菌成分主要為硬脂酸和水楊酸。Valerio等[6]從發(fā)酵面包中分離出Lactobacillusfermentum18B和Lactobacillusbrevis18F對A.nigerITM5132抑菌率分別高達82.7%和100%,經(jīng)LC-MS/MS分析發(fā)現(xiàn)其抑菌物質為苯乳酸。

表1 乳酸菌菌株來源Table 1 The sources of lactic acid bacteria strains

針對抗真菌性乳酸菌篩選方法主要有短瓊脂劃線法、牛津杯瓊脂擴散法、紙片法和96孔板法等[7-8]。而96孔板法對抗真菌性天然產(chǎn)物的篩選具有方便、快速、費用低等特點[9],饒瑜等[10]應用96孔板法對抗食品腐敗酵母的乳酸菌進行篩選,從57株乳酸菌中篩選出一株來自發(fā)酵泡菜的WeissellacibariaAT6,其發(fā)酵上清液對腐敗酵母的抑菌率可高達73.04%。Gerez等[11]通過96孔板法從不同源的91株乳酸菌中獲得一株產(chǎn)抗菌肽的乳酸菌Lb.fermentumCRL251,其無細胞上清液對A.nigerCH 101和FusariumgraminearumCH 103的抑菌率均大于80%,其抗菌肽分子量小于10 kDa。目前,應用96孔板法對抗黑曲霉乳酸菌的篩選及抑制作用研究的相關報道較少。

本文應用從傳統(tǒng)發(fā)酵食品和海產(chǎn)動物腸道中分離的8株乳桿菌屬的乳酸菌為出發(fā)菌株,以黑曲霉為目標菌,采用96孔板法篩選抗黑曲霉效果最好的乳酸菌菌株,并對其抑菌活性物質和對霉菌孢子的影響進行分析,為研發(fā)乳酸菌生物防腐劑控制米面制品中黑曲霉污染導致的腐敗提供理論和應用依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料與儀器

黑曲霉(AspergillusnigerCMCC 98003) 上海北諾生物科技有限公司;乳酸菌菌株 本實驗室前期分離獲得的已知菌株,見表1;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、MRS液體培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術有限責任公司;戊二醛 上海生工生物工程有限公司;乳酸、乙酸、丙酸、苯乳酸標品 Sigma公司。

SPX-250智能生化培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠;GI54DS高壓滅菌鍋 致微儀器有限公司;MJ-250霉菌培養(yǎng)箱 上海蘇達實驗儀器有限公司;DL-CJ-2N超級潔凈工作臺 北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;KA Vortex GENIUS3振蕩器 德國IKA公司;ZD-85氣浴恒溫振蕩器 金壇市科析儀器有限公司;I5804R冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司;安捷倫6890N氣相色譜儀 安捷倫公司;GC2010氣相色譜儀 日本島津公司;E-1045鍍金儀、S-4800掃描電鏡 日本日立公司。

1.2實驗方法

1.2.1 乳酸菌無細胞上清液(cell-free supernatant,CFS)的制備 參照Varsha等[5]方法稍加修改,將8株保藏于-20 ℃的乳酸菌以0.5%的接種量于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h,連續(xù)培養(yǎng)2代至正常代謝水平。然后按2%的接種量接種于100 mL MRS培養(yǎng)基，置于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,其發(fā)酵液經(jīng)10000×g、4 ℃離心5 min,取離心后的上清液經(jīng)0.45 μm過濾膜獲得乳酸菌CFS,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗黑曲霉乳酸菌的篩選 參照Gerez方法[11]并稍作修改,96孔板法測定乳酸菌CFS對黑曲霉的抑制作用。取10 μL 104孢子/mL黑曲霉孢子懸液添加到含190 μL乳酸菌CFS的無菌96孔細菌培養(yǎng)板中,28 ℃培養(yǎng)48 h后應用酶標儀測定OD580 nm值,以接種孢子懸液于MRS培養(yǎng)基為對照組。乳酸菌CFS發(fā)酵液的抑菌率按公式(1)計算。

抑菌率(%)=100-(ODLAB×100/ODcontrol)

式(1)

式中:ODLAB表示黑曲霉在乳酸菌CFS中培養(yǎng)48 h的OD580 nm;ODcontrol表示黑曲霉在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后的OD580 nm。

1.2.4 影響乳酸菌CFS抑制黑曲霉的因素分析 pH對菌株DL3抗黑曲霉的影響:以乳酸菌CFS為對照組,取乳酸菌CFS用1.0 mol/L HCl和1.0 mol/L NaOH分別調至pH2.5、3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5,按1.2.3方法進行抑菌活性測定。

溫度對菌株DL3抗黑曲霉的影響:以乳酸菌CFS為對照組,取乳酸菌CFS分別經(jīng)50、80、100和121 ℃處理30 min,同時按1.2.3方法進行抑菌活性測定。

表2 乳酸菌CFS對黑曲霉的抑菌率Table 2 Inhibitory rates of CFS of lactic acid bacteria against A. niger

注:不同字母表示差異顯著(p<0.05)。1.2.5 有機酸的測定 乳酸、乙酸和丙酸:參照Yuan等[15]方法稍作修改,采用安捷倫6890N氣相色譜儀,色譜柱:CNW CD-ACIDWAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×25 μm);FID檢測器溫度為300 ℃;進樣口溫度為280 ℃;升溫程序:初溫110 ℃,以10 ℃/min升至150 ℃,保持5 min,再以10 ℃/min升至230 ℃,保持15 min;空氣流速300 mL/min;N2流速30 mL/min;H2流速30 mL/min;進樣量為1 μL;分流比為15∶1。在線性范圍內,用外標法峰面積進行定量。

苯乳酸:參照Zhang等[16]方法稍作修改,移取待測樣品及標樣至帶塞玻璃管中,加入適量吡啶振蕩溶解,再加入50 μL BSTFA硅烷化試劑,置于100 ℃保持30 min,待測GC;采用島津GC2010氣相色譜儀。色譜柱:Rtx-5石英毛細柱(30 m×0.25 mm×25 μm);FID檢測器溫度為300 ℃;進樣口溫度為280 ℃;升溫程序:初溫180 ℃,保持20 min,以20 ℃/min升至280 ℃,保持10 min;空氣流速300 mL/min;N2流速30 mL/min;H2流速30 mL/min;進樣量1 μL;分流比為20∶1。在線性范圍內,用外標法峰面積進行定量。

1.2.6 有機酸抑菌活性分析 根據(jù)上述有機酸測定結果,應用MRS液體培養(yǎng)基配制與乳酸菌CFS中相同濃度的乳酸、乙酸、丙酸、苯乳酸和四種混合酸分別按1.2.3方法進行抑菌活性測定,同時,以乳酸菌CFS作為對照。

1.2.7 掃描電鏡觀察乳酸菌CFS對霉菌孢子的作用 參照Akocak方法[17]并稍作修改,分別取1.0 mL 1.0×105孢子/mL黑曲霉的孢子懸液于1.5 mL滅菌的EP管中,4 ℃條件下12000×g離心10 min,去上清液。以添加1.0 mL MRS液體培養(yǎng)基為對照組,添加1.0 mL的菌株DL3 CFS為實驗組,4 ℃靜置培養(yǎng)7 d。4 ℃條件下12000×g離心10 min,用0.1 mol/L PBS(pH7.2)洗滌孢子3次,后加入1.0 mL 2.5%戊二醛4 ℃固定13 h。再用pH5.6 PBS沖洗2次以除去孢子中戊二醛,每次5 min,4 ℃條件下12000×g離心10 min,去上清液并用0.5 mL無菌水將洗滌后孢子懸浮,膠頭滴管吸取1滴于潔凈蓋玻片上,置于空氣中干燥,真空噴金并鏡檢。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 所有實驗均重復測定3次,數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示。采用SPSS 18.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和顯著性分析,采用Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結果與討論

2.1抗黑曲霉乳酸菌的篩選

圖1是應用96孔板法測定8株不同源乳酸菌對黑曲霉抑菌效果,從中可看出,未添加乳酸菌CFS的對照組3個孔井均被黑曲霉覆蓋,添加菌株JY-22、DL3和LY-19的CFS孔井均無渾濁現(xiàn)象,其余菌株的孔井均出現(xiàn)不同程度的渾濁現(xiàn)象。表2是8株乳酸菌CFS對黑曲霉的抑菌結果,可看出Lb.plantarumDL3抑菌效果最好,抑菌率為92.28%;Lb.sakeLY-19和Lb.plantarumJY-22次之,抑菌率分別為86.85%和88.14%;其余乳酸菌菌株相對較弱,抑菌率均低于85%。因此,選取Lb.plantarumDL3進行下一步的實驗。

圖1 乳酸菌CFS對黑曲霉的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effects of CFS of lactic acid bacteria against A. niger

2.2影響乳酸菌CFS抑制黑曲霉因素分析

2.2.1 pH對菌株DL3抗黑曲霉的影響 乳酸菌生長代謝過程中形成的酸性環(huán)境或產(chǎn)生的酸性物質對真菌均具有抑制作用[18]。因此,pH因素對菌株DL3 CFS抗黑曲霉具有重要的影響。圖2是不同pH條件下菌株DL3 CFS對黑曲霉抑制結果,從中可看出,pH2.5～4.5范圍內,抑菌率均為90%左右,抑菌活性穩(wěn)定;隨著pH的升高抑菌率逐漸降低,pH5.5～6.5范圍內抑菌率下降顯著,當pH6.5時,對黑曲霉仍具有抑制作用,抑菌率為23.17%(pH7.0～7.5抑菌率為0,未給出)。結果表明,菌株DL3的抑菌活性物質在pH2.5～6.5范圍內對黑曲霉具有抑制作用,抑菌作用可能來源于酸性物質。Muhialdin等[19]研究發(fā)現(xiàn),Lb.fermentumTe007和Lb.pentosusG004代謝產(chǎn)生的抗A.niger的抑菌活性物質在pH3.0～7.0范圍內具有抗菌活性;當pH7.0時,2株乳酸菌對A.niger的抑菌率分別為29.90%和33.50%,經(jīng)HPLC分析表明抑菌活性物質為有機酸類。本文與文獻[19]的研究結果相似。

圖2 不同pH對植物乳桿菌DL3 CFS抑制黑曲霉活性的影響Fig.2 Effects of pH on the antifungal activity of Lb. plantarum DL3 CFS against A. niger注:不同字母表示差異顯著(p<0.05)，圖3同。

2.2.2 溫度對菌株DL3抗黑曲霉的影響 溫度也是影響菌株DL3 CFS對黑曲霉抑菌活性的因素。圖3是菌株DL3 CFS經(jīng)不同溫度處理30 min后對黑曲霉抑菌作用的變化,從中可看出,隨溫度的升高抑菌率呈下降趨勢,與對照組相比50、80和100 ℃處理后的菌株DL3抑菌率均無明顯變化,121 ℃處理后抑菌率僅下降了5.71%,其原因可能是乳酸菌CFS中一些熱敏感性的抑菌物質失活。如此說明菌株DL3 CFS中抑菌活性物質具有良好的熱穩(wěn)定性。Muhialdin等[19]研究發(fā)現(xiàn)Lb.fermentumTe007和Lb.pentosusG004 CFS經(jīng)90 ℃和121 ℃處理30 min對A.nigei和A.oryzae仍具有較強的抑制作用,與本文結果相似。

圖3 熱處理植物乳桿菌DL3 CFS對抑菌活性的影響Fig.3 Effects of heat treatment on the antifungal activity of Lb. plantarum DL3 CFS against A. niger

2.3有機酸對抑菌活性的影響

乳酸菌代謝產(chǎn)物中抗真菌物質主要包括有機酸、過氧化氫、羥基脂肪酸和抗菌肽等活性成分[20]。表3是菌株DL3 CFS中乙酸、乳酸、丙酸和苯乳酸含量及其對黑曲霉的抑菌結果。從中可看出,乳酸和乙酸含量相對較高分別為5.743 μg/mL和1.635 μg/mL,苯乳酸次之為0.085 μg/mL,丙酸含量較低為0.033 μg/mL。乳酸和乙酸對黑曲霉均具有較強抑制作用,抑菌率分別為91.69%和92.04%,其余兩種酸可能是由于含量較低對黑曲霉不呈現(xiàn)抑制效果。按照DL3 CFS中有機酸含量進行復配后的酸對黑曲霉抑菌率略高于對照組，為92.31%(p>0.05)?？梢缘贸鲆宜岷腿樗釣榫闐L3 CFS中抗黑曲霉的主要抑菌活性物質。

表3 植物乳桿菌DL3 CFS有機酸及抑菌率分析結果Table 3 The results of Lb. plantarum DL3 CFS organic acid contents and the inhibitory rate

注:“-”表示無抑菌效果,不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.4掃描電鏡分析乳酸菌CFS對黑曲霉孢子的影響

圖4 植物乳桿菌DL3 CFS對黑曲霉孢子的影響Fig.4 Effects of Lb. plantarum DL3 CFS on the spores of A. niger注:A:對照組,B:DL3;A、B放大倍數(shù)均為5000×。

圖4是黑曲霉孢子經(jīng)MRS培養(yǎng)基(對照)和菌株DL3CFS處理7 d后的掃描電鏡觀察的結果,從中可看出,經(jīng)MRS處理后黑曲霉孢子(見圖4A)結構完整,表面光滑;經(jīng)菌株DL3 CFS處理的黑曲霉孢子(見圖4B)出現(xiàn)溶解現(xiàn)象,孢子內容物外泄,表面出現(xiàn)較深的褶皺式裂痕,孢子完整性被破壞。可能是有機酸中H+與黑曲霉孢子細胞膜上的一些分子間存在相互作用導致磷脂雙分子層被損壞孢子細胞出現(xiàn)崩塌現(xiàn)象,同時,孢子細胞內部混合物出現(xiàn)泄露[21-23]。結果表明,菌株DL3 CFS對黑曲霉孢子具有破壞作用。Da等[21]研究發(fā)現(xiàn),青霉的孢子經(jīng)2.5 mmol/L水楊酸處理5 min后,部分青霉孢子的細胞膜被損壞,孢內蛋白質泄露;未經(jīng)處理的孢子細胞膜完整無損無泄露。本文與文獻[21]的研究結果相似。

3 結論

傳統(tǒng)發(fā)酵食品和海產(chǎn)動物腸道是拮抗性乳酸菌的主要來源,本文從8株不同源的乳酸菌中篩選到對黑曲霉具有較強抑菌作用的Lb.plantarumDL3,其抑菌率高達92.28%。通過pH和溫度處理,表明菌株DL3 CFS中抑菌活性物質在pH2.5～6.5具有抗黑曲霉活性,其抑菌物質對熱穩(wěn)定。經(jīng)氣相色譜儀分析菌株DL3 CFS中的抑菌活性物質主要為乳酸和乙酸,其含量分別為5.743 μg/mL和1.635 μg/mL。掃描電鏡結果表明菌株DL3 CFS對黑曲霉抑菌作用機制主要通過破壞黑曲霉孢子的完整性,從而抑制其生長和繁殖。因此,菌株DL3可作為控制黑曲霉的生物防霉劑的出發(fā)菌株,應用于米面加工制品的防霉保鮮。

[1]Muhialdin B J,Hassan Z,Bakar F A,et al. Novel antifungal peptides produced byLeuconostocmesenteroidesDU15 effectively inhibit growth ofAspergillusniger[J]. Journal of Food Science,2015,80(5):M1026-M1030.

[2]張寬朝,魏練平,沈浩,等. 肉桂醛、檸檬醛抑制黑曲霉生長的比較研究[J]. 中國微生態(tài)學雜志,2011,23(2):141-143.

[3]Cortés Z O,López M A,Hernández M A,et al. Antifungal activity ofLactobacilliand its relationship with 3-phenyllactic acid production[J]. International Journal of Food Microbiology,2014,173(3):30-35.

[4]Li D,Ni K,Pang H,et al. Identification and antimicrobial activity detection of lactic acid bacteria isolated from corn Stover silage[J]. Asian Australasian Journal of Animal Sciences,2015,28(5):620-631.

[5]Varsha K K,Peiya S,Devendra L,et al. Control of spoilage fungi by protective lactic acid bacteria displaying probiotic properties[J]. Applied Biochemistry & Biotechnology,2014,172(7):3402-3413.

[6]Valerio F,Biase M D,Lattanzio V M T,et al. Improvement of the antifungal activity of lactic acid bacteria by addition to the growth medium of phenylpyruvic acid,a precursor of phenyllactic acid[J]. International Journal of Food Microbiology,2016,222:1-7.

[7]Adedokun E O,Rather I A,Baipai V K,et al. Biocontrol efficacy ofLactobacillusfermentumYML014 against food spoilage moulds using the tomato puree model[J]. Frontiers in Life Science,2015,9(1):64-68.

[8]Bian X,Evivie S E,Muhammad Z,et al.Invitroassessment of the antimicrobial potentials ofLactobacillushelveticusstrains isolated from traditional cheese in Sinkiang China against food-borne pathogens[J]. Food and Function,2015,7(2):789-797.

[9]宋志剛,許強芝,魯心安,等. 利用真菌分生孢子篩選抗真菌活性的海洋微生物[J]. 第二軍醫(yī)大學學報,2005,26(11):1300-1301.

[10]饒瑜,常偉,向文良,等. 抗食品腐敗酵母的乳酸菌的篩選與鑒定[J]. 現(xiàn)代食品科技,2013(8):1943-1947.

[11]Gerez C L,Torres M J,Valdez G F D,et al. Control of spoilage fungi by lactic acid bacteria[J]. Biological Control,2013,64(3):231-237.

[12]馬歡歡,呂欣然,繆璐歡,等. 鼠李糖乳桿菌對互隔交鏈孢的抑制作用研究[J]. 食品工業(yè)科技,2016,37(17):180-184.

[13]呂欣然,李瑩,馬歡歡,等. 遼西傳統(tǒng)發(fā)酵食品中抗單增李斯特菌乳酸菌的篩選與鑒定[J]. 食品工業(yè)科技,2016,37(3):143-148.

[15]Yuan,Kong,Guan,et al. A GC-based metabonomics investigation of type 2 diabetes by organic acids metabolic profile[J]. Journal of Chromatography B,2007,850(1-2):236-240.

[16]Zhang K,Zuo Y. GC-MS determination of flavonoids and phenolic and benzoic acids in human plasma after consumption of cranberry juice[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52(2):222-227.

[17]Akocak P B,Churey J J,Woeobo R W. Antagonistic effect of chitinolyticPseudomonasandBacilluson growth of fungal hyphae and spores of aflatoxigenicAspergillusflavus[J]. Food Bioscience,2015,10：48-58.

[18]李院,蔻莉萍,王靜,等. 抑制青霉菌乳酸菌的分離,鑒定及抑菌物質初步分析[J]. 食品科學,2015,36(21):150-155.

[19]Muhialdin B J,Hassan Z,Sadon S K,et al. Effect of pH and heat treatment on antifungal activity ofLactobacillusfermentumTe007,LactobacilluspentosusG004 andPediococcuspentosaceusTe010[J]. Innovative Romanian Food Biotechnology,2011(8):41-53.

[20]成妮妮. 乳酸菌抗真菌生物防腐劑作用機理和前景展望[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(4):430-433.

[21]Da R N A,Maraschin M,Di P R. Antifungal activity of salicylic acid againstPenicilliumexpansumand its possible mechanisms of action[J]. International Journal of Food Microbiology,2015,215:64-70.

[22]馬歡歡,呂欣然,繆璐歡,等. 鼠李糖乳桿菌對互隔交鏈孢的抑制作用研究[J]. 食品工業(yè)科技,2016,37(17):180-184.

[23]Chen A,Zing G,Chen G,et al. Plasma membrane behavior,oxidative damage,and defense mechanism inPhanerochaetechrysosporiumunder cadmium stress[J]. Process Biochemistry,2014,49(4):589-598.

ScreeningandinhibitionmechanismoflacticacidbacteriaagainstAspergillusnigerusing96-wellmicrotiterplates

MAHuan-huan1,LINYang1,LVXin-ran2,SUNMeng-tong1,BAIFeng-ling1,*,LIJian-rong1,SONGQiang3

(1.College of Food Science and Technology,Bohai University,Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province, National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China; 2.College of Biology Science and Technology,Beijing Forest University,Beijing 100083,China; 3.Dalian Donglin Food Co.,Ltd.,Dalian 116101,China)

Objective:To isolate lactic acid bacteria(LAB)with outstanding inhibitory activity againstAspergillusniger. Methods:LAB with inhibitory activity againstA.nigerwas screened using 96-well microtiter plates.Research on effect factors of antibacterial was analyzed by pH test,heat-treated test. Research on the antimicrobial substances of the contents of organic acids were analyzed by the gas chromatography. Research on the antibacterial mechanism of the integrity of cellular of spores was observed by scanning electron microscope. Results:LactobacillusplantarumDL3 isolated from traditional northeast Suancai had strong anti-fungal activity againstA.niger,and its inhibitory rate reached 92.28%. Antimicrobial substances were effective within pH2.5～6.5 and heat stable,which was declined by 5.71% after incubation at 121 ℃ for 30 min. The contents of lactic acid,acetic acid,propionic acid and phenyl lactic acid in CFS of strain DL3 were 5.743,1.635,0.033 and 0.085 μg/mL using gas chromatography analysis,respectively. In addition,the inhibition rate of lactic acid and acetic acid toA.nigerwere 91.69% and 92.04%,respectively. Therefore,antimicrobial substances produced by strain DL3 were preliminary determined as organic acids. The propionic acid and phenyl lactic had no inhibition againstA.niger. The scanning electron microscope images revealed that the membrane of the spores ofA.nigertreated with CFS of strain DL3 was damaged and dissolved,resulting in the leakage of intracellular material from spores. Conclusion:Lactic acid and acetic acid were the main inhibitory substances produced by strain DL3,which could be used as starting strain of biological fungicide in rice and flour products.

lactic acid bacteria;inhibition;Aspergillusniger;96-well microtiter plates;screening;organic acid

2016-11-30

馬歡歡(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全與質量控制，E-mail：mahuanhuan14@163.com。

*通訊作者:白鳳翎(1964-)男，博士，教授，研究方向：食品安全與質量控制和食品微生物學，E-mail：baifling@163.com。

遼寧省科技廳攻關項目(2015103020)；泰山學者藍色產(chǎn)業(yè)領軍人才團隊支撐計劃項目(魯政辦字(2015)19號)。

TS201.1

:A

:1002-0306(2017)12-0171-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.031