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(南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

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基于NRPS基因篩選鑒定產(chǎn)生環(huán)脂肽葡萄附生細菌的研究

王傲,楊柯,呂曼,史雅凝,辛志宏*

(南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

本研究采用平板稀釋法和斜面分離純化技術(shù),從夏黑葡萄中篩選分離到5株附生細菌,提取菌株的基因組DNA,PCR擴增16S rDNA序列,產(chǎn)物純化后進行克隆測序,利用MEGA 6.0軟件對序列進行同源性比對分析,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹后,將5株附生細菌分別鑒定為克雷伯肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、克考氏菌(Kocuriamarina)、嗜氣芽孢桿菌(Bacillusaerophilus)、類芽孢桿菌(Paenibacillusagaridevorans)。在此基礎(chǔ)上,以非核糖體多肽合成酶基因(non-ribosomal peptide compounds synthetase,NRPS)為靶點,篩選到含有目的條帶的菌株P(guān)TWA2,經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹預(yù)測該菌株能夠產(chǎn)生環(huán)脂肽類化合物。該菌株發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)有機溶劑萃取、常壓硅膠柱層析、Sephedex LH-20等分離手段純化得到一個單體化合物,采用核磁共振和質(zhì)譜方法鑒定該化合物為環(huán)脂肽Surfactin A。該研究結(jié)果為以功能基因定向篩選產(chǎn)生環(huán)脂肽化合物的菌株提供了新的研究方法與理論依據(jù)。

附生菌,16S rDNA,序列分析,非核糖體多肽合成酶,系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)構(gòu)鑒定

植物附生菌(epiphyte)是一類附著在植物表面、以植物分泌物為營養(yǎng)的微生物類群[1]。大量研究表明,多數(shù)植物附生菌能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特的次級代謝產(chǎn)物,從中分離到的多種物質(zhì)也被證實具有各種各樣的生物活性[2-3]。如Shigemori[4]從海綿附生菌中分離到的大環(huán)內(nèi)酰胺類化合物Alteramide A被證明具有顯著的抗腫瘤細胞活性。2002年,Hornschuh[5]等從德國卡塞爾郡的森林Funaria樹葉表面分離出一株附生菌(Methylobacteriummesophilicum),能產(chǎn)生特定的激素從而促進植物生長發(fā)育。張學君[6]研究發(fā)現(xiàn),蘋果附生菌中存在著多種對蘋果常見病癥——輪紋病和炭疽病起拮抗作用的微生物。植物附生菌已成為尋找和發(fā)現(xiàn)各種生物活性物質(zhì)的重要資源,特別是植物附生細菌,因其易于培養(yǎng)、生長速率快、能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣的次級代謝產(chǎn)物,已經(jīng)成為附生微生物的研究熱點。

夏黑葡萄[7]原產(chǎn)日本,屬歐美雜種三倍體品種,由日本山梨縣果樹實驗場用巨峰與無核白雜交選育所得,1997年獲得品種登記。夏黑葡萄果粒著生緊密,果穗大小整齊,果皮紫黑色,果實酸甜適口,被譽為“東方黑珍珠”。研究表明,在表皮完整且溫度適宜的情況下,夏黑葡萄的貯藏期可達到60 d[8]。除了葡萄皮自身的保護屏障,也取決于表面的附生微生物。這些附生微生物利用葡萄表面的營養(yǎng)物質(zhì)進行繁殖,可產(chǎn)生小分子量的抗菌物質(zhì)、抗菌蛋白或多肽等活性物質(zhì)抑制了病原微生物的生長。因此,開展葡萄附生菌的篩選及其代謝產(chǎn)物的研究,對于闡明葡萄的生物防控機制具有重要意義。

在附生微生物的研究過程中,通常采用的方法以活性篩選、化學篩選或者二者結(jié)合為主。但是,這些方法的主要缺點是無法預(yù)測微生物次級代謝產(chǎn)物的類型,難以實現(xiàn)定向篩選[9]。近年來,隨著分子生物信息學的發(fā)展,許多微生物次級代謝產(chǎn)物的全基因組序列與生物合成機制得到解析,通過功能基因保守功能域設(shè)計引物,目標直接指向合成多肽類化合物的目標基因,為研究和開發(fā)現(xiàn)代天然產(chǎn)物提供了新的戰(zhàn)略依據(jù)。非核糖體多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases,NRPSs),是催化合成多肽類物質(zhì)(nonribosomal peptide,NRP)的關(guān)鍵酶,由多模塊組成,不同的模塊按照起始、延伸和終止的空間順序排列而成,每個模塊均有腺苷酰化結(jié)構(gòu)域(A結(jié)構(gòu)域),肽酰載體蛋白結(jié)構(gòu)域(T結(jié)構(gòu)域)和縮合結(jié)構(gòu)域(C結(jié)構(gòu)域)3個核心結(jié)構(gòu)域[10]。A結(jié)構(gòu)域負責氨基酸腺苷化,它在每一個反應(yīng)循環(huán)的第一步從底物池中選擇特異性的氨基酸,在ATP的作用下,使氨基酸活化成氨酰-AMP,被譽為特異性的“守門者”,是NRPS的核心保守模件[11]。因此可以通過A結(jié)構(gòu)域設(shè)計引物進行PCR篩選,產(chǎn)物測序后利用系統(tǒng)發(fā)育分析預(yù)測化合物的結(jié)構(gòu)類型。

本研究以夏黑葡萄為研究材料,采用稀釋梯度法和平板劃線分離技術(shù)篩選葡萄附生細菌,通過分子生物學方法對其進行分類鑒定。在此基礎(chǔ)上,以NRPS功能基因為靶點,篩選含有NRPS基因的菌株,利用常壓硅膠柱層析、Sephedex LH-20等技術(shù)分離純化得到單體化合物,通過核磁共振和質(zhì)譜方法鑒定化合物結(jié)構(gòu),以期為定向篩選有價值的環(huán)脂肽化合物并闡明葡萄的生物防控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

夏黑葡萄 采自江蘇省南京市玄武區(qū)童衛(wèi)路,裝入塑料保鮮袋,置于4 ℃冰箱保存;Taq酶、DNA Marker及PCR相關(guān)試劑 南京諾唯贊生物科技有限公司;Omega細菌基因組試劑盒(Bacteria DNA Kit 50)及引物(16SF/16SR) 上海捷瑞生物工程有限公司;Ver.3.0 D823A瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒、D102A pMD19-T載體 日本TaKaRa公司;其他生理生化試劑 南京壽德試劑器材有限公司;LB液體培養(yǎng)基(g/L) 胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10,瓊脂20,自來水配制,pH7.2。

SW-CJ-1FD無菌工作臺 蘇州凈化集團設(shè)備有限公司;Microfuge 22R臺式微量冷凍離心機 美國Beckman公司;TP600型梯度PCR儀 日本TaKaRa公司;DYCP-31DN電泳儀 北京市六一儀器廠;JS-380C全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司;JNM-ECP600型核磁共振儀 日本JEOL公司;Mariner API-TOF型質(zhì)譜儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;EYELAN-N型立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本Tokyo Rikakikai有限公司;ULVAC DTC-22B型隔膜真空泵 上海萬庫真空設(shè)備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 細菌的分離培養(yǎng) 取數(shù)顆葡萄置于無菌研缽中研磨出汁液,得到葡萄原液。取1 mL原液置于9 mL無菌水中,制成10-1的葡萄稀釋液,同理,依次制備10-2、10-3、10-4、10-5、10-6葡萄稀釋液。用無菌吸管吸取0.2 mL,分別涂布于LB培養(yǎng)基上,用無菌玻璃棒涂布均勻,將培養(yǎng)皿在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1～2 d,挑取形態(tài)有差異的單菌落,轉(zhuǎn)移到斜面試管中,4 ℃保存。

1.2.2 基因組DNA的提取 從保藏菌種的斜面培養(yǎng)基中挑取單菌落轉(zhuǎn)接到LB平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h?；蚪MDNA的提取采用細菌基因組試劑盒(Bacteria DNA Kit 50),按照說明書操作。提取的基因組DNA在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(120 V,30 min),溴化乙錠(EB)染色。4 ℃保存?zhèn)溆?或于-20 ℃中長期保存。

1.2.3 16S rDNA以及NRPS基因的PCR擴增 16S區(qū)域的擴增選擇原核生物16S rDNA的通用擴增引物16S-F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)/16S-R(5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′),PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,50 ℃退火45 min,72 ℃延伸100 s,共35個循環(huán),最后72 ℃延伸7 min。NRPS功能基因篩選引物A3F(5′-GCSTACSYSATSTACACSTCSGG-3′)/A7R(5-SASGTCVCCSGTSCGGTAS-3′),PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性1 min,59 ℃退火2 min,72 ℃延伸4 min,共35個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min[12-13]。PCR擴增反應(yīng)均采用25 μL的反應(yīng)體系,包括ddH2O 9.5 μL、10 μmol/L 16S-F 1 μL、10 μmol/L 16S-R 1 μL、DNA 1 μL、5 U/μL Taq聚合酶Mix 12.5 μL。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR產(chǎn)物的回收和克隆 采用瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒回收PCR產(chǎn)物,純化的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接,然后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中。在-70 ℃保存的100 μL感受態(tài)細胞E.coliDH5α中加入10 μL連接產(chǎn)物,冰中放置30 min,取出后42 ℃熱激90 s,加入890 μL LB液體培養(yǎng)基37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h。菌液涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素AMP的LB培養(yǎng)基平板,倒置過夜培養(yǎng),挑取白色單菌落培養(yǎng)。取1 μL菌液直接做PCR,引物為M13RV和M13-47,電泳檢測是否含有目的片段。PCR采用25 μL的反應(yīng)體系,包括ddH2O 9.5 μL、10 μmol/L Primer-F 1μL、10 μmol/L Primer-R 1 μL、DNA 1 μL、5 U/μL Taq聚合酶Mix 12.5 μL。

1.2.5 DNA序列測序和系統(tǒng)發(fā)育學分析 將含有目的DNA序列的菌液交由上海美吉生物有限公司進行測序。獲得序列后,利用DNAMAN進行序列拼接,在 EzBioCloud(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)中進行EzTaxon比對,下載與供試菌株序列同源性相近的模式菌株序列,利用MEGA 6.0軟件Neighbor-Joining(N-J)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,自展數(shù)為1000。

表1 5株葡萄附生細菌鑒定結(jié)果Table 1 The results of five bacteria from grapes

1.2.6 菌種發(fā)酵 在無菌條件下,用接種環(huán)從保存的固體斜面培養(yǎng)基中刮取菌體,接種于內(nèi)裝15 mL無菌水的小三角瓶內(nèi),振搖均勻形成孢子液,按1%接種量(1 mL)取孢子液接種于100 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中,在37 ℃、120 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h,作為種子培養(yǎng)液。將種子培養(yǎng)液接種至15瓶含300 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的1000 mL三角瓶中,接種量2.5%,發(fā)酵14 d。

1.2.7 化合物的分離與純化 發(fā)酵液用紗布過濾后得到發(fā)酵液和菌絲體,發(fā)酵液減壓濃縮至1 L,加入等體積丙酮,萃取3次,用乙酸乙酯萃取丙酮中的脂溶性物質(zhì),減壓濃縮至干,得到粗提物。將粗提物(9 g)上正向減壓柱硅膠柱純化,經(jīng)石油醚/丙酮/甲醇(100∶0/0∶100/100∶0,v/v/v)梯度洗脫,得到組分(Fraction,簡寫Fr):Fr-1～Fr-5,經(jīng)抑菌實驗發(fā)現(xiàn)僅有組分Fr-2對金色葡萄球菌具有抑制作用,該組分進一步經(jīng)凝膠層析Sephadex LH-20純化,用氯仿∶甲醇(1∶1,v/v)洗脫,得到一單體化合物A(10 mg)。

1.2.8 化合物A的波普學分析 分離純化的樣品過濾后進樣分析,質(zhì)譜參數(shù):電噴霧離子源(ESI),500 ℃,氣簾氣25.0 psi,噴霧電壓5500.0 V,離子源氣1:55.0 psi,離子源氣2:50.0 psi;結(jié)合核磁(1H、13C、1H-1H COSY、HMBC等)分析手段,最終確定化合物A的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA擴增及序列測定

采用平板分離與斜面純化相結(jié)合的方法共從夏黑葡萄中分離得到5株附生細菌,菌株經(jīng)DNA提取,通過PCR擴增16S rDNA基因片段,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行鑒定。16S rDNA擴增電泳結(jié)果如圖1所示,5株菌的條帶清晰單一,大小約1500 bp,與理論值一致[12]。

圖1 5株菌16S rDNA序列PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR results of 16S rDNA sequences from the five strains注:M:DNA Marker DL2000;1～5:代表5株葡萄附生細菌PTWA1～PTWA5。

以菌株P(guān)TWA2 16S rDNA為例,說明附生菌的鑒定過程。PTWA2 16S rDNA經(jīng)Blast比對,發(fā)現(xiàn)與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilissubsp. inaquosorum KCTC 13429)16S rDNA序列的同源性最高,相似性達98.63%。進一步利用MEGA6.0軟件通過鄰位連接法構(gòu)建16S序列系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖2所示),結(jié)果顯示,與所選取的外組菌株短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)相比,所有菌株聚為一個大組,不同菌種分別聚在不同的分枝上,菌株P(guān)TWA2與枯草芽孢桿菌桿菌(B.subtilis)處于同一分枝,自展值為98,親緣關(guān)系最近,鑒定PTWA2為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。據(jù)此方法,將5株葡萄附生細菌PTWA1～PTWA5分別被鑒定為K.pneumoniae、B.subtilis、K.marina、B.aerophilus、P.agaridevorans。結(jié)果如表1所示。

2.2 NRPS基因篩選結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

對分離到的5株葡萄附生細菌進行NRPS基因擴增只有菌株P(guān)TWA2擴增結(jié)果為陽性,得到大小約750 bp的目的條帶(圖3),與理論值一致[14]。對NRPS基因克隆測序后,經(jīng)orf finder在線轉(zhuǎn)化為氨基酸序列后進行BLASTp搜索,下載同源蛋白序列,采用MEGA6.0軟件,用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建NRPS進化樹,結(jié)果如圖4所示。從圖4中可見,能夠產(chǎn)生相同化學類型化合物的細菌分別聚為一枝,說明同種細菌的不同菌株或不同細菌能夠產(chǎn)生相同類型的化合物,如不同的大腸桿菌能夠產(chǎn)生Enterobactin,而貝萊斯芽孢和枯草芽孢桿菌都能產(chǎn)生Plipastatin。PTWA2蛋白序列與能合成Surfactin的菌株聚為一類,提示該菌株可能產(chǎn)生環(huán)脂肽Surfactin。

圖2 基于菌株P(guān)TWA2的16S rDNA區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain PTWA2 based on 16S rDNA gene sequence

圖3 5株葡萄附生細菌NRPS序列擴增結(jié)果Fig.3 Amplification result of five strains based on NRPS genes注:M.DNA Marker DL2000;1～5:代表5株葡萄附生細菌PTWA1～PTWA5。

圖5 化合物A的質(zhì)譜圖Fig.5 ESI-MS spectrum of compound A

2.3化合物A的結(jié)構(gòu)解析

圖4 菌株P(guān)TWA2基于NRPS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain PTWA2 based on NRPS functional gene

化合物A:白色針狀晶體,陰離子質(zhì)譜HR-ESI-MS在m/z 1034.1[M-H]-處出現(xiàn)準離子峰(圖5A),陽離子質(zhì)譜HR-ESI-MS在m/z 1058.7[M+Na]+處出現(xiàn)準離子峰(圖5B),表明該化合物的分子質(zhì)量為1035,結(jié)合1H-NMR、13C-NMR波普數(shù)據(jù)(表2),分析該化合物分子式為C53H93N7O13。1H-NMR(600 MHz C3D6O)譜顯示7個-NH信號分別為δ 7.96(s,1H,H-1)、7.67(s,1H,H-7)、7.44(s,1H,H-14)、7.68(s,1H,H-21)、7.73(s,1H,H-27)、7.96(s,1H,H-32)、7.70(s,1H,H-39),進一步分析發(fā)現(xiàn)在δ 4.02(d,J=5.82 Hz,1H,H-2)、4.38(t,J=7.32 Hz,1H,H-8)、4.47(t,J=8.94 Hz,1H,H-15)、4.24(d,J=5.70 Hz,1H,H-22)、4.77(t,J=4.86 Hz,1H,H-28)、4.53(t,J=8.1 Hz,1H,H-33)、4.40(t,J=6.18 Hz,1H,H-40)出現(xiàn)7個特征的氨基酸α-H信號,提示該化合物可能為環(huán)七肽。高場區(qū)δ 1.84～1.36出現(xiàn)一組密集信號,推測該化合物中可能含有脂肪酸鏈。13C-NMR(150 MHz,C3D6O)譜顯示7個羰基碳信號分別為δ 175.0(C-31)、174.3(C-20)、174.3(C-26)、174.0(C-45)、172.9(C-38)、171.7(C-13)、171.6(C-6)、172.8(C-5)、172.2(C-30)、171.1(C-1′),同時,δ C 61.6(C-2)、58.0(C-22)、53.0(C-40)、52.9(C-8)、52.6(C-33)、52.5(C-15)、50.8(C-28)出現(xiàn)7個特征的氨基酸α-C信號;進一步證實該化合物為環(huán)脂肽。經(jīng)文獻數(shù)據(jù)比對[15-17],表明該化合物是由谷氨酸(Glu)-亮氨酸(Leu)-亮氨酸(Leu)-纈氨酸(Val)-天冬氨酸(Asp)-亮氨酸(Leu)-亮氨酸(Leu)組成的環(huán)脂肽,確定該化合物的結(jié)構(gòu)為Surfactin。結(jié)構(gòu)式如圖6所示。

表2 化合物A的NMR數(shù)據(jù)Table 2 NMR data of compound A

續(xù)表

圖6 化合物A的結(jié)構(gòu)Fig.6 The structure of compound A

Surfactin是一類由非核糖體途徑(NPRS)產(chǎn)生的小分子量脂肽類化合物,具有低臨界膠束濃度(CMC)、高生物降解性、抗病毒和抗細菌性等作用[18]。因為選擇性廣、對環(huán)境影響小,Surfactin在食品工業(yè)、醫(yī)藥以及農(nóng)業(yè)生物防治方面有著廣闊的應(yīng)用潛力,是一種新型的對環(huán)境友好的綠色表面活性劑。近年來,人們一直采用血平板法和擴油圈法篩選代謝Surfactin的菌株[19],但這樣不僅工作效率低下,且不能有效將代謝脂肽的微生物從中區(qū)分開。本研究以NRPS基因為靶點,從葡萄表皮篩選到一株產(chǎn)環(huán)脂肽化合物的菌株,說明該方法能夠?qū)崿F(xiàn)脂肽類化合物從基因型到化學型的定向篩選,為實現(xiàn)產(chǎn)環(huán)脂肽化合物菌株的快速篩選提供了新的理論依據(jù)和研究方法。

3 結(jié)論

本實驗運用16S rDNA序列分析技術(shù)對夏黑葡萄附生菌進行分類鑒定,5株附生細菌分別鑒定為Klebsiellapneumoniae、Bacillussubtilis、Kocuriamarina、Bacillusaerophilus、Paenibacillusagaridevorans。在此基礎(chǔ)上,以NRPS基因為靶點,從5株細菌中篩選到一株含有NPRS基因的菌株,編號為PTWA2。通過NRPS序列系統(tǒng)發(fā)育分析,提示該菌株可產(chǎn)生環(huán)脂肽化合物Surfactin。進一步發(fā)酵該菌株,從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化得到一個單體化合物,經(jīng)ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR等綜合分析,確定其化學結(jié)構(gòu)為環(huán)脂肽C15-Surfactin A。該研究結(jié)果說明以NRPS基因為靶點,能夠?qū)崿F(xiàn)脂肽類化合物從基因型到化學型的定向篩選,為以功能基因為靶點,定向篩選產(chǎn)生環(huán)脂肽化合物的菌株提供了新的研究方法與理論依據(jù)。

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[19]王大威,劉永建,林忠平,等. 一株產(chǎn)生脂肽的枯草芽孢桿菌的分離鑒定及脂肽對原油的作用[J]. 微生物學報,2008,48(3):304-311.

ScreeningandidentificationofanepiphyticbacteriumproducinglipopeptidesbasedonNRPSgene

WANGAo,YANGKe,LVMan,SHIYa-ning,XINZhi-hong*

(College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

In this study,five epiphytic bacteria were isolated from "summer black" grapes using plate streaking and slant culture methods. After extraction of DNA,16S rDNA from the five strains were amplified for sequence homology analysis,and the phylogenetic trees were constructed with MEGA 6.0.The results showed that the five strains were characterized asKlebsiellapneumoniae,Bacillussubtilis,Kocuriamarina,Bacillusaerophilus,Paenibacillusagaridevorans,respectively. On this basis,the strain PTWA2 was screened with the non-ribosomal peptide compounds synthetase(NRPS)gene. After construting the NRPS phylogenetic tree,the results showed that the PTWA2 was capable of producing lipopeptide. As a result,a pure compound was obtained from the fermentation product of the PTWA2 by solvent extraction,silica gel column chromatography and Sephedex LH-20 chromatography and its chemical sturture was identified as surfactin A by physiochemical analysis and spectroscopic techniques. The study highlights new research methods and theoretical basis for target-screening strains which produced cyclic lipopeptide.

epiphytic bacteria;16S rDNA;gene sequence analysis;NRPS;phylegenetic tree;structure identificaiton

2016-12-12

王傲(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)與化學，E-mail：2014108056@njau.edu.cn。

*通訊作者:辛志宏(1974-)，男，博士，教授，研究方向：食品營養(yǎng)與安全，E-mail：xzhfood@njau.edu.cn。

2016年農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估項目(GJFP201601205)。

TS201.2

:A

:1002-0306(2017)12-0164-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.030