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(魯東大學(xué)食品工程學(xué)院,山東煙臺(tái) 264025)

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響應(yīng)面法優(yōu)化龍須菜蛋白酶解工藝及酶解液的抗氧化活性

于慧,劉海梅,李蒙娜,林詩(shī)琪,魏飛龍,郭鴻陽(yáng)

(魯東大學(xué)食品工程學(xué)院,山東煙臺(tái) 264025)

為獲得高抗氧化活性的龍須菜蛋白酶酶解液,運(yùn)用響應(yīng)面(RSM)分析方法對(duì)龍須菜蛋白酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)單酶篩選,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以亞鐵離子螯合率和DPPH自由基清除率為主要指標(biāo),水解度為輔助指標(biāo),研究酶解時(shí)間、pH、酶解溫度、底物質(zhì)量濃度、加酶量對(duì)龍須菜蛋白酶解液抗氧化活性和水解度的影響。結(jié)果表明:在所選的5種蛋白酶中,復(fù)合蛋白酶是龍須菜蛋白酶解的最適用酶;酶解液抗氧化活性的最優(yōu)酶解條件為酶解時(shí)間8.1 h、酶解溫度50.1 ℃、pH7.0、底物濃度10 g/L、加酶量0.1%(0.15 AU/g)。在此條件下,酶解液的亞鐵離子螯合率為74.61%,DPPH自由基清除率為47.66%,水解度為17.58%。對(duì)比常用抗氧化劑,酶解液在亞鐵離子螯合能力方面顯著高于0.01%維生素C和0.01% BHA(p<0.05),而在DPPH自由基清除能力和還原能力方面,酶解液低于0.01%維生素C和0.01% BHA(p<0.05)。優(yōu)化后的龍須菜蛋白酶酶解液具有一定的抗氧化活性。

龍須菜,酶解,響應(yīng)面,抗氧化活性,水解度

龍須菜(Gracilarialemaneiformis)又名江蘺、鳳菜、海菜等,屬于紅藻門(mén)、真紅藻綱、杉藻目、江蘺科、江蘺屬,是一種紅藻類(lèi)海洋植物[1-2],含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),除多糖和粗纖維外,其蛋白質(zhì)含量約占藻體的19%,僅次于紫菜[3]。在我國(guó)龍須菜養(yǎng)殖規(guī)模大、產(chǎn)量高且生產(chǎn)成本低,是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)藻類(lèi),主要集中在山東、福建、浙江、廣東、海南省等沿海地區(qū)[3]。它既是食品工業(yè)中提煉瓊脂的主要原料,又可以作為優(yōu)質(zhì)飼料來(lái)養(yǎng)殖鮑魚(yú),還可以成為人類(lèi)的綠色保健食品[3],在食用、藥用、科學(xué)研究、生物、水產(chǎn)養(yǎng)殖方面都有其獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。目前,關(guān)于龍須菜活性物質(zhì)的研究主要集中于其多糖[4]。

表1 不同蛋白酶水解實(shí)驗(yàn)條件Table 1 Experimental conditions for different proteases

抗氧化多肽通常由3～20個(gè)氨基酸殘基組成,具有螯合金屬離子、抑制和延緩脂質(zhì)氧化,以及保護(hù)人體組織器官免受自由基侵害等作用。食源性蛋白質(zhì)通過(guò)水解作用得到的抗氧化多肽具有抗氧化性強(qiáng)、安全性高和易被吸收等特點(diǎn),因此在食品行業(yè)中引起了廣泛的關(guān)注[5-6]。尤其近幾年,由于海藻的氨基酸組成均衡,有關(guān)其生物活性多肽的研究也極為活躍,研究人員已從海藻中分離得到多種可清除體內(nèi)自由基,具有抗氧化作用的海藻活性肽[7-9],但其主要集中在螺旋藻、紫菜等蛋白質(zhì)含量較高的藻類(lèi)中,而其他藻類(lèi)的蛋白酶解研究極其少見(jiàn)。據(jù)報(bào)道[10],藻類(lèi)在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中,有大量的以蛋白質(zhì)為主體的廢棄物產(chǎn)生,為了提高資源的有效利用率,本團(tuán)隊(duì)在裙帶菜的蛋白酶解研究中發(fā)現(xiàn)了其蛋白酶酶解液具有較好的亞鐵離子螯合能力和DPPH自由基清除能力[11]。而龍須菜的蛋白質(zhì)含量雖然低于紫菜,但比裙帶菜高,有關(guān)龍須菜蛋白酶解多肽的研究也極少見(jiàn),因此,本實(shí)驗(yàn)利用復(fù)合蛋白酶水解龍須菜蛋白,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,運(yùn)用響應(yīng)面分析法對(duì)水解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化并研究酶解液的抗氧化活性,旨在為酶解制備生物活性肽和龍須菜的深加工提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

龍須菜(Gracilarialemaneiformis) 采于山東日照，使用前清洗、凍干、粉碎并過(guò)80目篩后置于-18 ℃保存用(蛋白質(zhì)含量為17.39%);復(fù)合蛋白酶(Protamex)(1.5 AU/g) 丹麥諾維信有限公司;Alcalase(2.4 AU/g) 南京誠(chéng)納化工有限公司;胃蛋白酶(3000 U/g) 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;胰蛋白酶(50000 U/g) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;木瓜蛋白酶(25 U/g) 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；菲洛嗪 美國(guó)Sigma公司;維生素C、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀、無(wú)水乙醇等 均為分析純。

pB-10型pH計(jì) 新銳儀表儀器有限公司;ZHWY-1102雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;LGJ-18S真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;XMTD-2MA電熱恒溫水浴鍋 山東省龍口市先科儀器公司;TDL-5-A離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;721型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 龍須菜粗蛋白酶解工藝流程 龍須菜粉末→加磷酸緩沖溶液→保溫酶解→滅酶(85 ℃,15 min)→離心(5000 r/min，20 min)→取上清液得到酶解液

1.2.2 最佳酶種類(lèi)的選擇 參照文獻(xiàn)[12]所述方法,稱(chēng)取1 g龍須菜粉末于250 mL錐形瓶中,加入100 mL磷酸緩沖溶液攪拌均勻,分別向其加入100 mg胰蛋白酶、胃蛋白酶、Alcalase 2.4L、復(fù)合蛋白酶及木瓜蛋白酶,按表1所示,在其各自最適條件下酶解8 h。85 ℃滅酶15 min,離心(5000 r/min,10 min),取上清液測(cè)定其亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 最佳酶解時(shí)間的確定 以優(yōu)選的復(fù)合蛋白酶為水解酶,在底物質(zhì)量濃度10 g/L,加酶量0.1%,酶解溫度50 ℃,pH7.0的條件下,選取酶解時(shí)間分別為2、4、6、8、10 h,研究酶解時(shí)間對(duì)亞鐵離子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度的影響。

1.2.3.2 最適pH的確定 以優(yōu)選的復(fù)合蛋白酶為水解酶,在酶解時(shí)間為8 h,底物質(zhì)量濃度10 g/L,加酶量為0.1%,酶解溫度50 ℃的條件下,選取pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,研究pH對(duì)亞鐵離子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度的影響。

1.2.3.3 最適酶解溫度的確定 以優(yōu)選的復(fù)合蛋白酶為水解酶,在酶解時(shí)間為8 h,pH7.0,底物質(zhì)量濃度10 g/L,加酶量0.1%的條件下,選取酶解溫度分別為35、40、45、50、55 ℃,研究酶解溫度對(duì)亞鐵離子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度的影響。

1.2.3.4 最適底物濃度的確定 以優(yōu)選的復(fù)合蛋白酶為水解酶,在酶解時(shí)間為8 h,酶解溫度50 ℃,pH7.0,加酶量為0.1%的條件下,不同底物質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、15 g/L,研究底物質(zhì)量濃度對(duì)亞鐵離子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度的影響。

1.2.3.5 最適加酶量的確定 以優(yōu)選的復(fù)合蛋白酶為水解酶,在酶解時(shí)間為8 h,底物質(zhì)量濃度為10 g/L,酶解溫度50 ℃,pH7.0的條件下,選取酶的添加量分別為0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%,研究加酶量對(duì)亞鐵離子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度的影響。

1.2.4 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,運(yùn)用Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以酶解時(shí)間(A)、pH(B)、酶解溫度(C)為自變量,DPPH自由基清除率和亞鐵離子螯合率為響應(yīng)值,進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表3 不同蛋白酶對(duì)龍須菜蛋白酶解效果的影響Table 3 Effect of protease type on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

注:同列字母不同表示差異顯著(p<0.05);表6同。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Box-Behnken experimental design

1.2.5 水解度的測(cè)定 采用甲醛滴定法[13]。

1.2.6 酶解液DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[14]所述方法,將2 mL龍須菜蛋白酶酶解液加入到含2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液的試管中,迅速混勻,并在室溫下暗處反應(yīng)30 min,測(cè)定517 nm波長(zhǎng)處的吸光度。同時(shí)以2 mL磷酸緩沖溶液取代龍須菜蛋白酶酶解液的試管為對(duì)照實(shí)驗(yàn);2 mL乙醇取代DPPH乙醇溶液的試管作空白實(shí)驗(yàn)。按下式進(jìn)行DPPH自由基清除率的計(jì)算。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式中:A1為樣品實(shí)驗(yàn)的吸光度;A2為空白實(shí)驗(yàn)的吸光度;A3為對(duì)照實(shí)驗(yàn)的吸光度。

1.2.7 酶解液對(duì)亞鐵離子螯合能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[15]所述方法,向含有2.7 mL蒸餾水和0.1 mL 2 mmol/L FeCl2溶液的試管中,加入2 mL龍須菜蛋白酶解液,然后加入0.2 mL 5 mmol/L的菲洛嗪溶液并振蕩混勻,室溫反應(yīng)10 min,測(cè)定其波長(zhǎng)562 nm處吸光度。用蒸餾水替代菲洛嗪溶液作為空白實(shí)驗(yàn)。按下式進(jìn)行亞鐵離子螯合率的計(jì)算。

亞鐵離子螯合率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式中:A1為實(shí)驗(yàn)組的吸光度:A2為空白組的吸光度;A3為對(duì)照組的吸光度。

1.2.8 還原力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[16]所述方法,向試管中依次加入1 mL一定濃度的蛋白酶酶解液,2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液(pH6.6),2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混勻,50 ℃水浴30 min后,加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液。取上清液2.5 mL于比色管中,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1% FeCl3溶液,室溫放置10 min后,于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定其吸光度,記為酶解液的還原力。還原能力的強(qiáng)弱與吸光值成正比。

1.3數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析采用Design-Expert 8.0.6軟件。采用Tukey-Kramer post-hoc test對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析,用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差的統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2結(jié)果與分析

2.1最佳酶種類(lèi)的選擇

不同蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)水解具有不同的特異酶切位點(diǎn),可水解肽鏈上不同的部位[17]。由表3可知,復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、Alcalase 2.4L、胰蛋白酶、胃蛋白酶5種蛋白酶酶解龍須菜的產(chǎn)物均有一定的亞鐵離子螯合能力和DPPH自由基清除能力,然而,這些蛋白酶酶解液間的抗氧化活性存在顯著差異,這些結(jié)果表明了龍須菜蛋白酶解后形成的不同多肽擁有差異顯著的亞鐵離子螯合能力和DPPH自由基清除能力。其中,復(fù)合蛋白酶的酶解產(chǎn)物具有最高的亞鐵離子螯合能力和DPPH自由基清除能力,且水解效果最好。同時(shí),復(fù)合蛋白酶是針對(duì)水解食物蛋白質(zhì)開(kāi)發(fā)的桿菌蛋白酶復(fù)合物,與其他內(nèi)切蛋白酶相比,具有明顯優(yōu)勢(shì)是其所得的蛋白酶水解液沒(méi)有苦味,提高了酶解產(chǎn)物質(zhì)量[18]。所以選擇復(fù)合蛋白酶作為酶解龍須菜蛋白的實(shí)驗(yàn)用酶。

另外,對(duì)比木瓜蛋白酶和Alcalase 2.4L蛋白酶的酶解產(chǎn)物,雖然龍須菜在Alcalase 2.4L蛋白酶處理下,其水解度顯著高于木瓜蛋白酶處理的龍須菜,然而在亞鐵離子螯合能力和DPPH自由基清除能力方面,其酶解液低于木瓜蛋白酶處理后的龍須菜酶解液。這些結(jié)果表明,酶解液的抗氧化能力與其水解程度沒(méi)有顯著相關(guān)性。在后續(xù)龍須菜蛋白酶解條件優(yōu)化研究中,亞鐵離子螯合率和DPPH自由基清除率為主要指標(biāo),水解度為輔助指標(biāo)。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶解時(shí)間的選擇 由圖1可知,隨著蛋白酶酶解時(shí)間的延長(zhǎng),在2～8 h范圍內(nèi),亞鐵離子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度不斷增加,并在8 h時(shí),亞鐵離子螯合率為83.88%,DPPH自由基清除率為33.63%,水解度為10.49%,均達(dá)到最高值。說(shuō)明抗氧化能力的提高,與龍須菜酶解后抗氧化多肽的產(chǎn)生有關(guān)。此后,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),酶解液的亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率開(kāi)始下降,這可能因?yàn)榫哂锌寡趸钚缘碾亩伪贿M(jìn)一步水解為更小的肽段和氨基酸等而減弱或失去活性。因此,酶解時(shí)間以8 h為宜。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)龍須菜蛋白酶解效果的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

2.2.2 pH的選擇 酶解環(huán)境的pH常會(huì)影響到酶的穩(wěn)定性,同時(shí),pH也會(huì)影響到底物的解離程度,進(jìn)而影響酶與底物間的結(jié)合而作用于酶解反應(yīng)[19]。pH對(duì)龍須菜蛋白水解度及抗氧化活性的影響如圖2所示。隨著pH的增加,亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率和水解度開(kāi)始逐漸增大,當(dāng)pH為7.0時(shí),亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度均達(dá)到最大值,分別為72.41%、57.39%和17.01%。此后,隨著pH進(jìn)一步增加,酶解液的亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度均開(kāi)始下降。因此,酶解pH以7.0為宜。

圖2 pH對(duì)龍須菜蛋白酶解效果的影響Fig.2 Effect of pH on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

2.2.3 酶解溫度的選擇 圖3顯示了溫度對(duì)龍須菜酶解反應(yīng)的影響。在35～50 ℃范圍內(nèi),隨著酶解溫度的升高,亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率和水解度呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì),當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí),亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度均達(dá)到最大值,分別為71.12%、45.42%和17.01%。這是由于在酶解過(guò)程中,提高溫度可以顯著提高酶解速度,促進(jìn)龍須菜蛋白水解,從而產(chǎn)生更多的抗氧化多肽。當(dāng)酶解溫度進(jìn)一步提高時(shí),亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度呈顯著下降趨勢(shì)。這是由于溫度過(guò)高,蛋白酶變性,從而降低了酶解效率。因此,酶解溫度以50 ℃為宜。

圖3 酶解溫度對(duì)龍須菜蛋白酶解效果的影響Fig.3 Effect of temperature on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

2.2.4 底物質(zhì)量濃度的選擇 由圖4可知,隨著龍須菜質(zhì)量濃度的增加,亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度呈現(xiàn)先逐漸增大后減小的趨勢(shì),在龍須菜質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí),達(dá)到最大值,分別為74.09%、38.41%和15.92%。這是因?yàn)殡S著龍須菜濃度的增加,接觸幾率增加而提高水解度,同時(shí),水解后產(chǎn)生的多肽含量增加,使亞鐵離子螯合能力和DPPH自由基清除能力得以提高;而龍須菜質(zhì)量濃度進(jìn)一步增加時(shí),酶濃度逐漸不足,其催化功能沒(méi)有完全發(fā)揮,故水解不徹底,進(jìn)而對(duì)酶解液的抗氧化活性產(chǎn)生影響[20]。因此,底物質(zhì)量濃度以10 g/L為宜。

圖4 底物質(zhì)量濃度對(duì)龍須菜蛋白酶解效果的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

2.2.5 加酶量的選擇 加酶量會(huì)引起酶反應(yīng)體系中酶濃度的變化,進(jìn)而影響龍須菜蛋白的酶解效果,從而影響酶解液的抗氧化活性[21]。由圖5可知,隨著加酶量的增加,亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率以及水解度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),在加酶量0.1%時(shí)取得最大值,分別為71.43%、39.20%和11.95%。所以加酶量以0.1%為宜。

圖5 加酶量對(duì)龍須菜蛋白酶解效果的影響Fig.5 Effect of enzyme dose on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

2.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

表5 二次回歸方程方差分析Table 5 Analysis of variance of regression equation

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取酶解溫度、酶解時(shí)間、pH為變量,進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。復(fù)合蛋白酶酶解龍須菜蛋白的工藝條件優(yōu)化根據(jù)Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了17組實(shí)驗(yàn),5組為中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)(表4)。本實(shí)驗(yàn)把抗氧化活性作為酶解工藝優(yōu)化的第一指標(biāo),水解度作為輔助指標(biāo),對(duì)DPPH自由基清除能力Y1、亞鐵離子螯合能力Y2與各水解因素進(jìn)行多元回歸擬合,得二次多項(xiàng)式擬合方程為:Y1=46.73+2.16X1-4.08X2+5.13X3-7.42X1X2-0.30X1X3-4.09X2X3-5.13X12-16.07X22-6.22X32;

Y2=71.56-0.84X1+9.97X2-4.74X3+2.71X1X2-2.97X1X3+1.65X2X3-7.68X12-13.03X22-5.39X32。

表4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Box-Behnken experimental design and results

Y1方程回歸模型的決定系數(shù)R2=0.9021,p<0.01,說(shuō)明模型達(dá)到極顯著水平,失擬項(xiàng)p=0.0517,影響不顯著,說(shuō)明該方程擬合良好;Y2方程回歸模型的決定系數(shù)R2=0.9141,p<0.01,說(shuō)明模型達(dá)到極顯著水平,失擬項(xiàng)p=0.0530,影響不顯著,說(shuō)明該方程擬合良好[22]。因此,可以應(yīng)用Y1和Y2兩個(gè)方程描述各響應(yīng)變量與兩個(gè)相應(yīng)值之間的關(guān)系,以評(píng)價(jià)各因素對(duì)相應(yīng)值影響的顯著性。

由表5可以看出,響應(yīng)值為DPPH自由基清除率的模型,pH二次項(xiàng)(X22)對(duì)響應(yīng)值影響極顯著,酶解溫度(X3)、酶解時(shí)間與pH交互項(xiàng)(X1X2)對(duì)響應(yīng)值影響顯著,各響應(yīng)因素影響程度依次為:X3>X2>X1,酶解溫度對(duì)于酶解液DPPH自由基清除率的影響最大;響應(yīng)值為亞鐵離子螯合率的模型,pH(X2)、pH二次項(xiàng)(X22)對(duì)響應(yīng)值影響極顯著,酶解溫度(X3)、酶解時(shí)間二次項(xiàng)(X12)對(duì)響應(yīng)值影響顯著,各響應(yīng)因素影響程度依次為:X2>X3>X1,pH對(duì)于酶解液亞鐵離子螯合率的影響最大。

通過(guò)圖6和圖7即可對(duì)任何兩因素交互影響抗氧化活性效應(yīng)進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)。響應(yīng)面為平滑的曲面,且開(kāi)口向下,說(shuō)明在響應(yīng)曲面上存在最大響應(yīng)值,可從中確定最佳因素水平范圍。結(jié)果表明,酶解時(shí)間和pH交互作用對(duì)DPPH自由基清除效果影響顯著,其他各因素的交互作用不顯著。

2.4最佳制備工藝條件的確定及驗(yàn)證

圖6 各因素交互作用對(duì)DPPH自由基清除能力的影響Fig.6 Response surface plots for the interactive effects of different variables on DPPH radical scavenging activity

圖7 各因素交互作用對(duì)亞鐵離子螯合能力的影響Fig.7 Response surface plots for the interactive effects of different variables on ferrous ion-chelating ability

根據(jù)Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)式回歸方程,對(duì)所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行工藝參數(shù)最優(yōu)化搜索,獲得了各因素的最佳酶解條件組合為:酶解溫度50.07 ℃、酶解時(shí)間8.07 h、pH7.04,此時(shí)DPPH自由基清除率為46.36%,亞鐵離子螯合率為72.24%,水解度為17.68%。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性,選取酶解溫度50.1 ℃、酶解時(shí)間8.1 h、pH7.0、底物質(zhì)量濃度10 g/L、加酶量為0.1%做3組平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,得到的DPPH自由基清除率達(dá)47.66%,亞鐵離子螯合率達(dá)74.61%,水解度達(dá)17.58%,此結(jié)果與最佳理論條件下所得的結(jié)果接近。

2.5酶解物與其他抗氧化劑的比較

表6顯示,與酶解前的龍須菜相比,最優(yōu)條件下龍須菜蛋白酶酶解液擁有更強(qiáng)的DPPH自由基清除能力、亞鐵離子螯合能力和還原力(p<0.05),這說(shuō)明龍須菜蛋白酶酶解后產(chǎn)生的多肽,提高了整體酶解液的抗氧化活性。這可能是由于龍須菜蛋白結(jié)構(gòu)緊密和水溶性等問(wèn)題而表現(xiàn)出較弱的抗氧化能力,而蛋白酶水解打破了龍須菜蛋白的天然結(jié)構(gòu),形成了更多開(kāi)放、暴露的氨基酸殘基,從而提高了其抗氧化活性。

表6 龍須菜蛋白酶解液與常用抗氧化劑之間的比較Table 6 Comparison of antioxidant activities between protamex-hydrolyte and common antioxidants

抗氧化劑可以通過(guò)螯合過(guò)渡金屬離子來(lái)抑制氧化反應(yīng)的發(fā)生。其中,鐵離子對(duì)細(xì)胞中ROS的形成起關(guān)鍵作用[23],因此本研究選取了亞鐵離子螯合率來(lái)評(píng)價(jià)酶解液的抗氧化活性。結(jié)果表明,對(duì)比常用天然抗氧化劑0.01%維生素C和合成抗氧化劑0.01%BHA[14],酶解前的龍須菜擁有更好的亞鐵離子螯合能力(p<0.05),此結(jié)果與其他藻類(lèi)類(lèi)似,這主要與其包含的海藻酸鹽等多糖及酚類(lèi)物質(zhì)的存在有關(guān)[15]。而最優(yōu)條件下龍須菜蛋白酶酶解液亞鐵離子螯合能力更強(qiáng)(p<0.05),達(dá)到了74.61%,這可能由于蛋白酶解使肽鍵斷裂,自由氨基和羧基濃度的增加隔離了體系內(nèi)促氧化的金屬離子,從而提高了其抗氧化效果。其次可能是由于某些氨基酸殘基的暴露增加引起的,如組氨酸,它是常見(jiàn)具有金屬螯合能力的氨基酸[14]。通過(guò)對(duì)龍須菜蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的酶解,使具有金屬螯合能力的氨基酸殘基更多地暴露于水溶液中,增強(qiáng)了與溶液中亞鐵離子的螯合能力。然而,龍須菜蛋白酶酶解液的亞鐵離子螯合能力隨著蛋白水解度上升,達(dá)到峰值后,反而隨蛋白水解度的進(jìn)一步上升而降低(圖5),這暗示了龍須菜蛋白酶酶解多肽中有適合螯合亞鐵離子的空間結(jié)構(gòu)存在,隨著進(jìn)一步水解遭到破壞,從而減弱了亞鐵離子螯合能力。近年來(lái)鐵元素強(qiáng)化食品的社會(huì)需求越來(lái)越多,具有亞鐵離子螯合能力的安全有效的抗氧化劑非常受關(guān)注,尤其是具有亞鐵離子螯合能力的多肽,因其亞鐵離子螯合物不僅具有營(yíng)養(yǎng)性強(qiáng)、生物效價(jià)高和吸收快等優(yōu)點(diǎn),而且具備抗氧化、抗菌等生物活性,同時(shí),相對(duì)于氨基酸亞鐵離子螯合物有更好的穩(wěn)定性和配合率。因此,這種可食用性天然多肽值得進(jìn)一步的深入研究和開(kāi)發(fā)利用[24]。

而在DPPH自由基清除能力和還原能力方面,最優(yōu)條件下龍須菜蛋白酶解液顯著強(qiáng)于酶解前的龍須菜(p<0.05),但比0.01%維生素C和0.01%BHA的抗氧化能力弱(p<0.05)。龍須菜蛋白酶酶解液的還原能力提高,主要與蛋白酶酶解暴露出還原性氨基酸殘基有關(guān)。而龍須菜蛋白酶酶解液DPPH自由基清除能力的進(jìn)一步提高,可能與龍須菜蛋白酶酶解產(chǎn)生的小分子多肽有關(guān)?，F(xiàn)有研究顯示,小分子多肽可在溶液與溶質(zhì)界面或者固相與氣相界面形成薄膜,從而隔離并保護(hù)目標(biāo)物。如Chang等研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)蛋白酶解處理,豬血紅蛋白顯著提高了DPPH自由基清除能力[24]。另外,乳清蛋白隨著其水解時(shí)間的增加,其DPPH自由基清除能力和抗脂質(zhì)氧化能力均顯著增加[14],這表明了小分子多肽比大分子蛋白質(zhì)有更佳的DPPH自由基清除能力。本研究中蛋白酶酶解處理,使龍須菜自由基清除能力的提高與血紅蛋白和乳清蛋白的研究結(jié)果非常相似,因此,小分子多肽與蛋白酶酶解提高龍須菜自由基清除能力相關(guān)。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)確定了酶解龍須菜蛋白的最佳用酶為復(fù)合蛋白酶。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析,得優(yōu)化龍須菜蛋白的最佳工藝條件:酶解時(shí)間8.1 h、酶解溫度50.1 ℃、pH7.0、底物濃度10 g/L、加酶量0.1%(0.15 AU/g龍須菜粉末),在此條件下酶解龍須菜蛋白,亞鐵離子螯合率達(dá)74.61%,DPPH自由基清除率為47.66%,水解度達(dá)17.58%。對(duì)比常用抗氧化劑,在亞鐵離子螯合能力方面,酶解液顯著高于0.01%維生素C和0.01%BHA(p<0.05),而在DPPH自由基清除能力和還原能力方面,酶解液低于0.01%維生素C和0.01%BHA(p<0.05)。此結(jié)果可為今后龍須菜蛋白抗氧化活性肽的分離純化提供有利基礎(chǔ)。

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OptimizationforenzymatichydrolysisofGracilarialemaneiformisproteinandantioxidantactivityofitshydrolysate

YUHui,LIUHai-mei,LIMeng-na,LINShi-qi,WEIFei-long,GUOHong-yang

(College of Food Engineering,Ludong University,Yantai 264025,China)

Response surface methodology(RSM)was employed to optimize the process conditions for the enzymatic hydrolysis ofGracilarialemaneiformisprotein. After the single enzyme screening experiments,the ferrous ion-chelating and DPPH free radical scavenging abilities as the main index,the degree of hydrolysis as the auxiliary index,the effects of hydrolysis time,pH,hydrolysis temperature,concentration of substrate and enzyme dose on the degree of hydrolysis and the antioxidant activity of hydrolysates were investigated based on the single factor experiments. The results showed that protamex was the best enzyme for the enzymatic hydrolysis ofGracilarialemaneiformisprotein. The optimal conditions for the ferrous ion-chelating ability and the scavenging activity on DPPH free radical were as follows:hydrolysis time of 8.1 h,pH7.0,temperature of 50.1 ℃,substrate concentrate of 10 g/L,and enzyme dose of 0.1%. Under these conditions,the ferrous ion-chelating ability of hydrolysate was up to 74.61%,significantly higher than that of 0.01% ascorbic acid and 0.01% BHA(p<0.05). The scavenging ability of DPPH free radical was 47.66%,and the degree of hydrolysis was 17.58%,lower than that of 0.01% ascorbic acid and 0.01% BHA(p<0.05). These results suggested that the protein hydrolysates possess excellent antioxidant activity.

Gracilarialemaneiformis;enzymatic hydrolysis;response surface methodology;antioxidant activity;hydrolysis degree

2016-12-12

于慧(1982-)，女，博士，講師，研究方向：水產(chǎn)品加工與貯藏，E-mail：zoehuihui@hotmail.com。

教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(第49批)；魯東大學(xué)引進(jìn)人才項(xiàng)目(LY2013022)。

TS254.9

:A

:1002-0306(2017)12-0157-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.029