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(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

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嗜熱鏈球菌KLDSSM胞外多糖生物合成途徑的分析

丁秀云,蒙月月,李柏良,霍貴成*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

為了從遺傳水平上探究嗜熱鏈球菌KLDS SM合成胞外多糖(EPS)的能力,本研究從糖被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞內(nèi)、糖核苷酸合成及EPS基因簇三方面所涉及的基因進(jìn)行了相關(guān)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),該菌能夠轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖及甘露糖5種糖,具有代謝葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、海藻糖與甘露糖形成糖酵解中間代謝產(chǎn)物的酶類,擁有合成EPS前體物質(zhì)UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-N-乙?；咸前?、UDP-呋喃半乳糖與dTDP-鼠李糖的潛力。同時(shí)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該菌具有一個(gè)與高產(chǎn)EPS的菌株ASCC 1275一致性極高的EPS基因簇,且EPS初步產(chǎn)量測(cè)定約為331 mg/mL,表明該菌是一株高產(chǎn)EPS潛力菌株,具有較大的應(yīng)用潛能。

嗜熱鏈球菌KLDS SM,糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),糖核苷酸,EPS基因簇,生物信息分析

作為一種重要的乳品發(fā)酵劑,嗜熱鏈球菌常與保加利亞乳桿菌應(yīng)用于工業(yè)乳制品生產(chǎn)中,如酸奶與奶酪[1-2]。一些嗜熱鏈球菌可以產(chǎn)生胞外多糖(EPS),EPS是菌體在生長(zhǎng)代謝中分泌到培養(yǎng)基中的一類多糖類化合物,分子量多在104～6.0×106之間[3-4],為微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物。EPS可作為增粘劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、膠凝劑應(yīng)用于食品工業(yè)中,改善發(fā)酵乳制品的持水性、質(zhì)構(gòu)、口感及流變性[5-7],某些EPS還有抗腫瘤[8],降低膽固醇[9],調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[10-11],抗氧化[12-13],為腸道菌群提供底物[5],抗致病性微生物[14]等多種生理功能。多糖的生物合成是一個(gè)需能的過(guò)程,乳酸菌產(chǎn)能有限,很大程度上限制了EPS的產(chǎn)量。相對(duì)于保加利亞乳桿菌,嗜熱鏈球菌所產(chǎn)生的EPS對(duì)酸奶品質(zhì)的影響占主導(dǎo)地位。EPS的生物合成過(guò)程分為前體糖核苷酸的合成及EPS基因簇指導(dǎo)重復(fù)單元合成、鏈長(zhǎng)、聚合與輸出。嗜熱鏈球菌產(chǎn)生的雜多糖主要由D-半乳糖、D-葡萄糖和L-鼠李糖聚合而成。

嗜熱鏈球菌KLDS SM分離于中國(guó)內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌可以快速產(chǎn)酸,縮短凝乳時(shí)間,并且高產(chǎn)黏。為了從基因水平上分析該菌產(chǎn)生EPS的潛力,對(duì)該菌進(jìn)行了全基因組測(cè)序,分析其胞外多糖合成的相關(guān)基因。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

嗜熱鏈球菌KLDS SM 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心(KLDS-DICC);M17肉湯培養(yǎng)基、細(xì)菌基因組提取試劑盒 北京天根生物技術(shù)有限公司;脫脂乳粉 Nordmilchag公司;溶菌酶、瓊脂粉、透析袋 Solarbio公司;葡萄糖 美國(guó)Sigma公司;無(wú)水乙醇 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;三氯乙酸 天津市大茂化學(xué)試劑廠;重蒸苯酚 北京博奧拓達(dá)科技有限公司;濃硫酸 哈爾濱理工化學(xué)試劑有限公司。

LDZF-50KB-Ⅱ立式蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;CJ-2D超凈工作臺(tái) 天津泰斯特儀器有限公司;DHP-927型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;GL-20G-II離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;GL-21M離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所;DYY-10C電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 將凍干保藏的嗜熱鏈球菌KLDS SM以1%(v/v)接種至M17液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h以活化菌體,兩次轉(zhuǎn)接至M17液體培養(yǎng)基后提取基因組,提取的步驟按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取5 μL DNA樣品進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)基因組提取質(zhì)量及完整性。

1.2.2 基因組的測(cè)序、組裝與注釋 基因組的測(cè)序與組裝由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成。嗜熱鏈球菌KLDS SM全基因組采用二代Illumina Hiseq 2500(500 bp,PE125)與三代Pacbio RSII(20 K)平臺(tái)聯(lián)合測(cè)序。過(guò)濾除去低質(zhì)量reads。使用SMRT Analysis v2.3.0流程中的RS_HGAP_Assembly3[15]軟件將PacBio數(shù)據(jù)中的reads從頭組裝成完整的連續(xù)的contig?；贗llumina Hiseq 2500數(shù)據(jù),采用GATK分析流程對(duì)contig進(jìn)行第一輪單堿基糾錯(cuò),SOAPsnp v1.05[16]與SOAPindel v1.08對(duì)第一輪結(jié)果進(jìn)行第二輪糾錯(cuò)。Contig成環(huán)判斷得到完成圖水平的完整序列。采用NCBI原核基因組注釋流程(PGAP,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK174280)進(jìn)行全基因組注釋。

1.2.3 生物信息分析 PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、ABC型糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、糖代謝形成糖酵解中間產(chǎn)物及糖核苷酸合成的路徑參照KEGG pathway數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html),本地Blastp確認(rèn)路徑中涉及基因在該菌的存在情況。下載epsA基因序列,建庫(kù),本地Blastp尋找EPS基因簇5′端高度保守的epsA,確認(rèn)基因簇的位置。Blastx(nr)對(duì)基因簇上的各基因進(jìn)行人工校正,以最優(yōu)比對(duì)作為相應(yīng)基因的注釋?；蚪M圈圖由CGView Server[17]構(gòu)建。ISfinder[18]用來(lái)分析EPS基因簇中存在的轉(zhuǎn)座酶。分析中所涉及的基因的氨基酸序列從Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。目前13株已完成全基因組測(cè)序的嗜熱鏈球菌:LMG 18311(CP000023.1),S9(CP013939.1),CNRZ1066(CP000024.1),LMD-9(CP000419.1),ND03(CP002340.1),JIM 8232(FR875178.1),MN-ZLW-002(CP003499.1),ASCC 1275(CP006819.1),SMQ-301(CP011217.1),MN-BM-A02(CP010999.1),MN-BM-A01(CP012588.1),CS8(CP016439.1),KLDS 3.1003(CP016877.1)。基因組序列在NCBI(ftp)下載。同樣確定EPS基因簇序列,與菌株KLDS SM的序列比較分析(megablast)。

1.2.4 EPS的提取及測(cè)定 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：取葡萄糖適量,(105±5)℃烘干至恒重。精確稱取0.06 g,定容至100 mL。分別取0、5、10、15、20、25、30、35、40 μL于EP管中,加蒸餾水定容至60 μL。采用苯酚硫酸法[19]測(cè)定糖含量,步驟參照姜瓊等[20]的方法,在標(biāo)準(zhǔn)液中加入180 μL由5%苯酚與98%濃硫酸以1∶5體積比配成的顯色液,沸水浴25 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度,每個(gè)樣品重復(fù)3次,繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

EPS的提取及測(cè)定：將嗜熱鏈球菌KLDS SM在M17肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,傳代培養(yǎng)18 h后以4%(v/v)接種量接種至脫脂乳中,42 ℃發(fā)酵,凝乳后放于4 ℃。接種24 h后提取粗多糖,步驟參照Shao[21]的方法,稍有改動(dòng):發(fā)酵乳經(jīng)沸水浴10 min,冷卻后于4 ℃ 9000 r/min離心20 min,去除沉淀取上清,加入80%(w/v)三氯乙酸至7%(w/v)沉淀蛋白,4 ℃放置10 h,4 ℃ 9000 r/min離心20 min后取上清,減壓濃縮至原體積的1/3,加入三倍體積的無(wú)水乙醇,4 ℃放置24 h后于4 ℃ 9000 r/min離心30 min,去離子水溶解沉淀,裝于透析袋(7 kDa)內(nèi)于4 ℃透析3 d,每天換3次水。苯酚硫酸法測(cè)定EPS的含量(校正系數(shù)0.9)。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)樣品生物學(xué)重復(fù)三次,采用Excel軟件繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1嗜熱鏈球菌KLDS SM基因組的一般特征

嗜熱練球菌KLDS SM全基因組序列上傳到Genbank數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)為:CP016026。嗜熱鏈球菌KLDS SM基因組由一個(gè)1856787bp的環(huán)狀染色體組成,G+C含量為39.08%,構(gòu)建的基因組圈圖如圖1所示。同絕大多數(shù)已測(cè)序的嗜熱鏈球菌一樣,KLDS SM基因組中并不存在質(zhì)粒(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/420?)。共預(yù)測(cè)出1950個(gè)基因,由1732個(gè)蛋白編碼基因,18個(gè)rRNA基因,67個(gè)tRNA基因,4個(gè)ncRNA以及129個(gè)假基因組成。

圖1 嗜熱鏈球菌KLDS SM基因組圈圖Fig.1 Circular genome map of Streptococcus thermophilus KLDS SM注:從外至里,第1和第2圈分別表示正負(fù)鏈上的基因,包括CDS、rRNA、tRNA及其他基因;第3圈表示GC含量;第4圈表示GC skew,淺灰色代表G-C>0的區(qū)域,深灰色代表G-C<0的區(qū)域,淺灰色與深灰色交界處分別是復(fù)制起始點(diǎn)與終止點(diǎn)。

2.2糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及糖核苷酸的合成

圖2 嗜熱鏈球菌KLDS SM糖核苷酸的合成Fig.2 Synthesis of sugar nucleotides of Streptococcus thermophilus KLDS SM

2.2.1 糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) 糖類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)方式一般有三種:磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)、ABC型糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以及糖滲透酶[22]。其中PTS為主要的轉(zhuǎn)運(yùn)方式,其組成為:磷酸載體蛋白HPr和EI,負(fù)責(zé)糖類物質(zhì)的磷酸化;具有底物特異性的EII,通常由IIA、IIB與IIC(甘露糖存在IID)構(gòu)成。Blastp分析表明,嗜熱鏈球菌KLDS SM基因組中有一個(gè)編碼HPr(A9497_02385)和EI(A9497_02380)組成的操縱元。10個(gè)PTS系統(tǒng)相關(guān)的EII,分別為轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖的IIABC(A9497_04525),葡萄糖的IIA(A9497_07135)、IIBC(A9497_07130;A9497_07130),果糖的IIA(A9497_02785)、IIABC(A9497_08150),甘露糖的EIIAB(A9497_07770)、IIC(A9497_07765)、IID(A9497_07760),海藻糖的IIA(A9497_07135)、IIBC(A9497_05305)。其中基因(A9497_08150)因缺失而失去轉(zhuǎn)運(yùn)果糖的功能。ABC型糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)由兩個(gè)底物結(jié)合蛋白、兩個(gè)滲透酶與一個(gè)ATP結(jié)合蛋白組成,轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程消耗ATP。菌株KLDS SM基因組上只有2個(gè)基因(A9497_00495;A9497_00205)分別編碼ABC型糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的滲透酶及ATP結(jié)合蛋白,無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)糖類物質(zhì)。除此之外,菌株KLDS SM有一編碼乳糖滲透酶的基因(A9497_02960),用于乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn),基因組上未發(fā)現(xiàn)其他糖滲透酶。

2.2.2 糖核苷酸的合成 嗜熱鏈球菌KLDS SM的糖核苷酸合成途徑如圖2所示,涉及的酶列于表1。分析表明菌株KLDS SM有利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、海藻糖與甘露糖相關(guān)的基因,同時(shí)有合成EPS前體糖核苷酸UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-N-乙?；咸前贰DP-呋喃半乳糖與dTDP-鼠李糖的潛力。該菌有Leloir途徑相關(guān)的酶,可以利用半乳糖形成葡萄糖-1-磷酸。在合成過(guò)程中,不同的酶在染色體上拷貝數(shù)不同。有趣的是,轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞的糖轉(zhuǎn)化成糖酵解的中間產(chǎn)物相應(yīng)的酶拷貝數(shù)較多。海藻糖-6-磷酸水解酶水解海藻糖-6-磷酸生成葡萄糖與葡萄糖-6-磷酸,在染色體上有2個(gè)拷貝。甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶可以轉(zhuǎn)化甘露糖-6-磷酸為果糖-6-磷酸,高達(dá)3個(gè)拷貝。推斷這種多拷貝現(xiàn)象可能利于細(xì)胞快速、高效利用糖類物質(zhì)。同時(shí),作用于UDP-葡萄糖與UDP-半乳糖相互轉(zhuǎn)變的尿苷二磷酸葡萄糖4-表異構(gòu)酶高達(dá)3個(gè)拷貝,利于二者的快速轉(zhuǎn)變,以供重復(fù)單元合成過(guò)程中對(duì)其需求。

2.3 EPS基因簇生物信息分析

比對(duì)發(fā)現(xiàn),菌株KLDS SM染色體上存在一個(gè)合成EPS的基因簇,如表2與圖3所示,該基因簇由22個(gè)基因組成(A9497_01480-A9497_01580)。基因簇中epsA-D(A9497_01565 - A9497_01580)編碼與EPS生物合成調(diào)控、鏈長(zhǎng)決定及輸出相關(guān)的高度保守基因。epsE(A9497_01560)編碼重復(fù)單元形成的起始引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶,負(fù)責(zé)將UDP-半乳糖轉(zhuǎn)移到異戊二烯醇磷酸酯(脂載體)上,同時(shí)基因(A9497_01520、A9497_01535、A9497_01545、A9497_01555*、A9497_01555)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶,轉(zhuǎn)移相應(yīng)的糖核苷酸指導(dǎo)EPS重復(fù)單元的形成。其中A9497_01555*與A9497_01555因截短成為假基因無(wú)法發(fā)揮轉(zhuǎn)移酶功能,比對(duì)發(fā)現(xiàn)A9497_01555*與乳酸乳球菌的基因一致性很高,且其下游編碼ISLll1轉(zhuǎn)座酶(IS982家族)的A9497_01550與乳酸乳球菌的轉(zhuǎn)座酶同源,推斷該糖基轉(zhuǎn)移酶由轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)移獲得,插入A9497_01555使其成為假基因。A9497_01550在進(jìn)化過(guò)程中因缺失成為假基因,表明基因在較早時(shí)期轉(zhuǎn)移至該基因簇上。A9497_01525與A9497_01530與鏈長(zhǎng)決定相關(guān)基因A9497_01565和A9497_01570有相似的功能結(jié)構(gòu)域,同樣因?yàn)榻囟淌スδ?且兩者同源于植物乳桿菌的基因?；駻9497_01510與A9497_01515編碼翻轉(zhuǎn)酶參與重復(fù)單元的輸出,A9497_01510因移碼突變而失去功能。

表1 嗜熱鏈球菌KLDS SM糖核苷酸合成相關(guān)的酶Table 1 Enzymes related to sugar nucleotide synthesis of Streptococcus thermophilus KLDS SM

圖3 嗜熱鏈球菌KLDS SM EPS基因簇Fig.3 EPS gene cluster of Streptococcus thermophilus KLDS SM注:從5′(左)到3′(右),編碼不同產(chǎn)物的基因用不同的圖案表示?；蛭稽c(diǎn)與長(zhǎng)度(bp)標(biāo)記于基因上下。

表2 嗜熱鏈球菌KLDS SM EPS基因簇Table 2 EPS gene cluster of Streptococcus thermophilus KLDS SM

注:已用Blastx校正基因簇中的各基因?！?”為校正后出現(xiàn)的基因?；駻9497_01505編碼UDP-吡喃半乳糖變位酶負(fù)責(zé)UDP-吡喃半乳糖的形成。基因簇中的另一個(gè)轉(zhuǎn)座酶A9497_01500為ISL3家族的ISSmu2轉(zhuǎn)座酶,同樣因基因突變失去功能?；駻9497_01495編碼與嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)相關(guān)的ORF14.9[23]?；駻9497_01490 - A9497_01480分別編碼磷酸酶(假基因)、磷酸甘油酸變位酶和滲透酶。在EPS基因簇5′上游同樣發(fā)現(xiàn)編碼嘌呤核苷磷酸化酶的高度保守基因deoD(A9497_01590)[23-24]。同時(shí)在deoD與epsA之間存在一個(gè)反向的IS256家族的IS1191轉(zhuǎn)座酶。

嗜熱鏈球菌KLDS SM EPS基因簇與13株已測(cè)序的嗜熱鏈球菌的EPS序列比對(duì)(megablast),發(fā)現(xiàn)其與菌株ASCC 1275、MN-BM-A02核苷酸序列的一致性最高,而菌株ASCC 1275高產(chǎn)EPS[25]。推測(cè)菌株KLDS SM是一株高產(chǎn)EPS的菌株。

2.4 EPS含量測(cè)定

以葡萄糖(0.6 mg/mL)作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。線性回歸方程為y=0.0046x-0.0083,R2=0.9981,線性關(guān)系良好。經(jīng)苯酚硫酸法測(cè)定菌株KLDS SM中粗多糖總量約為331 mg/mL。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Glucose standard curve

3 結(jié)論

通過(guò)生物信息分析嗜熱鏈球菌KLDS SM的糖轉(zhuǎn)運(yùn)情況,該菌主要通過(guò)PTS系統(tǒng)特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖、蔗糖、海藻糖與甘露糖。僅存在一種糖滲透酶,即乳糖滲透酶轉(zhuǎn)運(yùn)乳糖。不存在完整的ABC型糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),可能因?yàn)樵撓到y(tǒng)消耗ATP不適合該菌的生理代謝。糖核苷酸合成分析中,發(fā)現(xiàn)該菌有利用葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、海藻糖與甘露糖進(jìn)入中心代謝的酶類,并且海藻糖與甘露糖代謝相關(guān)的酶類有多個(gè)拷貝,推測(cè)其與糖類物質(zhì)快速、高效進(jìn)入碳代謝及能量代謝有關(guān)?；蚪M分析表明該菌有合成EPS的前體物質(zhì)UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-N-乙?；咸前?、UDP-呋喃半乳糖與dTDP-鼠李糖的潛力。同時(shí)在菌株KLDS SM染色體上存在一個(gè)指導(dǎo)EPS生物合成的基因簇,其上特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶指導(dǎo)重復(fù)單元的形成。EPS序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)菌株KLDS SM與菌株ASCC 1275、MN-BM-A02基因簇高度相似,而菌株ASCC 1275高產(chǎn)EPS,同時(shí)初步測(cè)定菌株KLDS SM的粗多糖產(chǎn)量約為331 mg/mL,可以推測(cè)該菌是一株高產(chǎn)EPS的潛力菌株。嗜熱鏈球菌產(chǎn)生的EPS可以作為天然的食品增稠劑,可提高發(fā)酵乳制品的品質(zhì),某些類型的EPS有益生作用。因此在后續(xù)研究中優(yōu)化培養(yǎng)條件提高EPS的產(chǎn)量,研究EPS的組成、結(jié)構(gòu)及調(diào)控是非常有意義的。

[1]Liu M,Siezen R J,Nauta A. In silico prediction of horizontal gene transfer events inLactobacillusbulgaricusandStreptococcusthermophilusreveals protocooperation in yogurt manufacturing[J]. Applied and Environmental Microbiology,2009,75(12):4120-4129.

[2]Settachaimongkon S,Nout M J R,Antunes Fernandes E C,et al. Influence of different proteolytic strains ofStreptococcusthermophilusin co-culture withLactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus on the metabolite profile of set-yoghurt[J]. International Journal of Food Microbiology,2014,177:29-36.

[3]De Vuyst L,De Vin F,Vaningelgem F,et al. Recent developments in the biosynthesis and applications of heteropolysaccharides from lactic acid bacteria[J]. International Dairy Journal,2001,11(9):687-707.

[4]Hassan A N. ADSA foundation scholar award-possibilities and challenges of exopolysaccharide-producing lactic cultures in dairy foods[J]. Journal of Dairy Science,2008,91(4):1282-1298.

[5]Caggianiello G,Kleerebezem M,Spano G. Exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria-from health-promoting benefits to stress tolerance mechanisms[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2016,100(9):3877-3886.

[6]Patel S,Majumder A,Goyal A. Potentials of exopolysaccharides from lactic acid bacteria[J]. Indian Journal of Microbiology,2012,52(1):3-12.

[7]Zannini E,Waters D M,Coffey A,et al. Production,properties,and industrial food application of lactic acid bacteria-derived exopolysaccharides[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2016,100(3):1121-1135.

[8]Li W,Ji J,Tang W,et al. Characterization of an antiproliferative exopolysaccharide(LHEPS-2)fromLactobacillushelveticusMB2-1[J]. Carbohydrate Polymers,2014,105:334-340.

[9]Welman A D,Maddox I S. Exopolysaccharides from lactic acid bacteria-perspectives and challenges[J]. Trends in Biotechnology,2003,21(6):269-274.

[10]Makino S,Ikegami S,Kano H,et al. Immunomodulatory effects of polysaccharides produced byLactobacillusdelbrueckiissp.bulgaricusOLL1073R-1[J]. Journal of Dairy Science,2006,89(8):2873-2881.

[11]Schepetkin I A,Faulkner C L,Nelson-Overton L K,et al. Macrophage immunomodulatory activity of polysaccharides isolated from Juniperus scopolorum[J]. International Immunopharmacology,2005,5(13-14):1783-1799.

[12]Ye S,Liu F,Wang J,et al. Antioxidant activities of an exopolysaccharide isolated and purified from marinePseudomonasPF-6[J]. Carbohydrate Polymers,2012,87(1):764-770.

[13]Li S,Huang R,Shah N P,et al. Antioxidant and antibacterial activities of exopolysaccharides fromBifidobacteriumbifidumWBIN03 andLactobacillusplantarumR315[J]. Journal of Dairy Science,2014,97(12):7334-7343.

[14]Santos A,San Mauro M,Sanchez A,et al. The antimicrobial properties of different strains ofLactobacillusspp. isolated from Kefir[J]. Systematic and Applied Microbiology,2003,26(3):434-437.

[15]Chin C,Alexander D H,Marks P,et al. Nonhybrid,finished microbial genome assemblies from long-read SMRT sequencing data[J]. Nature Methods,2013,10(6):563-569.

[16]Li R,Li Y,Fang X,et al. SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing[J]. Genome Research,2009,19(6):1124-1132.

[17]Grant J R,Stothard P. The CGView Server-a comparative genomics tool for circular genomes[J]. Nucleic Acids Research,2008,36(suppl 2):W181-W184.

[18]Siguier P. ISfinder-the reference centre for bacterial insertion sequences[J]. Nucleic Acids Research,2006,34(suppl 1):D32-D36.

[19]DuBois M,Gilles K A,Hamilton J K,et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry,1956,28(3):350-356.

[20]姜瓊,謝妤. 苯酚-硫酸法測(cè)定多糖方法的改進(jìn)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(12):316-318.

[21]Shao L,Wu Z,Zhang H,et al. Partial characterization and immunostimulatory activity of exopolysaccharides fromLactobacillusrhamnosusKF5[J]. Carbohydrate Polymers,2014,107:51-56.

[22]Aleksandrzak-Piekarczyk T,Polak J,Jezierska B,et al. Genetic characterization of the CcpA-dependent,cellobiose-specific PTS system comprising CelB,PtcB and PtcA that transports lactose inLactococcuslactisIL1403[J]. International Journal of Food Microbiology,2011,145(1):186-194.

[23]Wu Q,Tun H M,Leung F C,et al. Genomic insights into high exopolysaccharide-producing dairy starter bacteriumStreptococcusthermophilusASCC 1275[J]. Scientific Reports,2014,4.

[24]Broadbent J R,McMahon D J,Welker D L,et al. Biochemistry,Genetics,and Applications of Exopolysaccharide Production inStreptococcusthermophilus:A Review1[J]. Journal of Dairy Science,2003,86(2):407-423.

[25]Zisu B,Shah N P. Effects of pH,temperature,supplementation with whey protein concentrate,and adjunct cultures on the production of exopolysaccharides byStreptococcusthermophilus1275[J]. Journal of Dairy Science,2003,86(11):3405-3415.

GeneticanalysisandpreliminarydeterminationofproductionofexopolysaccharideofStreptococcusthermophilusKLDSSM

DINGXiu-yun,MENGYue-yue,LIBai-liang,HUOGui-cheng*

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In order to explore the ability of exopolysaccharide synthesis ofStreptococcusthermophilusKLDS SM based on gene level,three aspects of sugar transport systems,sugar nucleotide synthesis and exopolysaccharide gene cluster structure were analyzed in detail. The results showed that the bacteria could transport glucose,lactose,sucrose,trehalose and mannose,had the enzymes for glucose,lactose,fructose,sucrose,trehalose and mannose metabolism. The bacteria had the potential for exopolysaccharide precursor synthesis,including UDP-glucose,UDP-galactose,UDP-N-acetyl glucosamine,UDP-galactofuranose and dTDP-rhamnose. Furthermore,sequence alignment analysis showed that the exopolysaccharide sequence of this bacteria had a high identity to that of strain ASCC 1275,and preliminary determination of exopolysaccharide yield was about 331 mg/mL. The results showed that the strain was a potential EPS producing strain and had great potential in industry.

StreptococcusthermophilusKLDS SM;sugar transport system;sugar nucleotide;exopolysaccharide gene cluster;bioinformatics analysis

2017-01-03

丁秀云(1990-),女,碩士研究生,研究方向:乳酸菌生物技術(shù),E-mail-aidingxiuyun@outlook.com。

*通訊作者:霍貴成(1958-),男,博士,教授,研究方向:乳品加工與食品微生物,E-mail-gchuo58@126.com。

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203009)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)12-0151-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.028