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(貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550001)

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柑橘屬果實(shí)中過敏原幾丁質(zhì)酶的表達(dá)和B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測

閆慧清,羅慶華,黃小龍*

(貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550001)

I類植物的幾丁質(zhì)酶(chitinase)是許多植物性食品中一種非常重要的過敏原,與乳膠-水果綜合癥有著密切的關(guān)系。大部分致敏性植物中的幾丁質(zhì)酶對(duì)人體的健康有著潛在的危害。本文以柑橘屬中的過敏原幾丁質(zhì)酶為研究對(duì)象,通過比較柑橘屬中不同來源的果實(shí),如琯溪蜜柚、甜橙和溫州蜜柑中的幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)含量,得到溫州蜜柑果實(shí)的表達(dá)量最高。通過Genebank搜索得到幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列,采用同源比對(duì)說明在不同的物種中可能會(huì)導(dǎo)致交叉過敏的現(xiàn)象。最后利用DNAStar軟件預(yù)測得到幾丁質(zhì)酶的二級(jí)結(jié)構(gòu),當(dāng)氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)是β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲,同時(shí)抗原指數(shù)>0、柔韌性>0、表面可及性>1和親水性>0的氨基酸區(qū)域時(shí),形成B細(xì)胞抗原表位的可能性較大。綜合這些參數(shù)結(jié)果表明幾丁質(zhì)酶的B細(xì)胞抗原表位結(jié)合氨基酸序列的可能區(qū)域是在62～69、96～100、126～133、145～149、155～159、169～172、179～182、189～190、256～262,通過預(yù)測氨基酸的區(qū)域,為制備相應(yīng)的抗體、培育低過敏品種等后續(xù)研究提供一定的理論依據(jù)。

柑橘過敏,幾丁質(zhì)酶,細(xì)胞表位

幾丁質(zhì)酶是植物體內(nèi)防御真菌和蟲害病原菌的重要蛋白質(zhì)[1],其中I類植物幾丁質(zhì)酶是大部分植物,如獼猴桃(Actinidiamelliana)[2]、鱷梨(PerseaamericanaMill)[3]、柿子(DiospyrosKaki L.)[4]等果實(shí)中重要的一種過敏原,能夠與乳膠過敏原發(fā)生交叉反應(yīng),有研究表明幾丁質(zhì)酶(chitinase)與兒童的哮喘病等過敏性疾病有著密切的關(guān)系。幾丁質(zhì)酶的含量能夠作為真菌感染血清學(xué)的指標(biāo),在觀察布朗克斯兒童(Bronx children)哮喘人群中起著重要作用[5]。它提供了真菌感染、重癥哮喘和過敏之間的關(guān)聯(lián)。利用酵母重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶蛋白,能夠與IgE發(fā)生特異性結(jié)合[1]。B細(xì)胞抗原表位是抗原分子與體內(nèi)產(chǎn)生抗體能夠結(jié)合的氨基酸序列。大部分導(dǎo)致食物過敏現(xiàn)象產(chǎn)生的原因就是過敏原表位。決定幾丁質(zhì)酶抗原表位形成的因素有很多。通過根據(jù)其氨基酸序列及親水性、抗原性等不同參數(shù)綜合預(yù)測的方法[6],能夠了解幾丁質(zhì)酶的表位特征。

除了能夠誘發(fā)過敏發(fā)生之外,溫州蜜柑中的幾丁質(zhì)酶可以增加小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系的炎癥因子前列腺素PGE2的含量,導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[7]。本文首先以柑橘屬果實(shí)為材料,比較得到不同品種中幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)。通過不同物種之間氨基酸序列的比對(duì),得到不同果實(shí)間存在交叉過敏。最后對(duì)幾丁質(zhì)酶進(jìn)行B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測,得到過敏原幾丁質(zhì)酶的相關(guān)特性,為柑橘幾丁質(zhì)酶過敏的進(jìn)一步研究提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

溫州蜜柑、甜橙和琯溪蜜柚的果實(shí) 購自本地市場;Trizol試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 均購自大連寶生物有限公司;引物合成 由上海生工生物股份有限公司完成。

lightCycler 480Ⅱ熒光定量儀器分析 購自羅氏。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取和定量PCR 取成熟溫州蜜柑、甜橙和琯溪蜜柚的果實(shí),利用Trizol試劑盒提取總RNA,并進(jìn)行qRT-PCR。反轉(zhuǎn)錄利用first-strand cDNA synthesis kit試劑盒合成,幾丁質(zhì)酶基因引物及反應(yīng)體系具體如表1所示。

表1 定量RT-PCR所用幾丁質(zhì)酶基因引物序列Table 1 Sequences of chitinaseprimers used for RT-PCR tests

基因的表達(dá)分析采用了real-time RT-PCR的方法。PCR反應(yīng)程序如下:50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min(45個(gè)循環(huán))。每個(gè)樣品的cDNA擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立重復(fù)。通過計(jì)算2-ΔΔCt值比較各個(gè)產(chǎn)物得出基因的表達(dá)量。

1.2.2 柑橘中炎癥蛋白氨基酸序列 通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索柑橘幾丁質(zhì)酶的蛋白質(zhì)序列登錄號(hào),得到幾丁質(zhì)酶多肽鏈中氨基酸的排列順序?yàn)橐患?jí)結(jié)構(gòu),并利用ClustalX 8軟件對(duì)不同種間的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源比對(duì)。

1.2.3 幾丁質(zhì)酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 將推導(dǎo)出的幾丁質(zhì)酶氨基酸序列,利用DNAStar生物軟件中Gamier-Robson方法對(duì)蛋白質(zhì)螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的氨基酸區(qū)域進(jìn)行預(yù)測。

1.2.4 幾丁質(zhì)酶蛋白抗原指數(shù)、柔韌性、親水性及蛋白表面可及性預(yù)測 利用DNAStar生物軟件中Jameson-Wolf方法分析蛋白的蛋白抗原指數(shù)[8]、Karplus-Schulz分析柔韌性[9]、Kyte-Doolittle法分析蛋白親水性[10]和Emini[11]法獲得蛋白表面可及性的氨基酸序列。

1.2.5 B細(xì)胞抗原表位預(yù)測 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的螺旋、折疊區(qū)段因有大量的氫鍵維持結(jié)構(gòu),起結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用不與抗原發(fā)生作用,而轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲區(qū)域多位于分子表面,空間結(jié)構(gòu)利于與抗體結(jié)合。同時(shí)當(dāng)親水性>0,抗原指數(shù)>0,柔韌性>0,表面可及性>1時(shí),形成抗原表位的可能性大。因此通過DNAStar軟件,綜合其上各參數(shù)可推導(dǎo)出該蛋白的抗原區(qū),得出幾丁質(zhì)酶蛋白的B細(xì)胞抗原表位[11-12]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 19.0中Duncan進(jìn)行多重比較(p<0.05為顯著性),分析柑橘不同品種之間幾丁質(zhì)酶的差異性表達(dá)。B細(xì)胞抗原表位預(yù)測利用DNAstar軟件(http://www.dnastar.com/)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1定量PCR檢測不同物種中幾丁質(zhì)酶的表達(dá)

通過測定琯溪蜜柚、甜橙和溫州蜜柑果實(shí)中幾丁質(zhì)酶基因的相對(duì)表達(dá)量,表明在不同的種類中幾丁質(zhì)酶的含量存在著顯著性的差異。由圖1得到,琯溪蜜柚(pummelo)和甜橙(orange)果實(shí)中幾丁質(zhì)酶的含量基本相同,而溫州蜜柑(satsuma)果實(shí)中的含量最高,并顯著性的高于甜橙和琯溪蜜柚,表達(dá)量分別是琯溪蜜柚的25.65倍,甜橙的13.05倍。

圖1 幾丁質(zhì)酶在琯溪蜜柚、甜橙和溫州蜜柑果實(shí)中的表達(dá)Fig.1 The relative expression level of chitinase in pummelo,orange and satsuma注：不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

圖2 柑橘中幾丁質(zhì)酶與其他物種的同源比較Fig.2 Amino acid sequence alignments of chitinase in citrus with other plants注:黑色和灰色分別表明序列的相同和相似性,相對(duì)保守的區(qū)域ChtBD1和Glyco_hydro_19顯示在序列上方。

從幾丁質(zhì)酶在溫州蜜柑果實(shí)中的高表達(dá),可以得到溫州蜜柑是一種過敏食物,溫州蜜柑是柑橘中最常見的食用品種。柑橘在國際上也被列為過敏(Allergy)食品之一,有研究表明在歐洲,如意大利、西班牙等國家,食用柑橘后誘發(fā)的過敏人群達(dá)到17%,部分幼童在食用柑橘后也會(huì)產(chǎn)生過敏現(xiàn)象[13]。過敏可以是體液(抗體)或者是細(xì)胞免疫機(jī)制介導(dǎo)的,并導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[14]。在大多數(shù)情況下,在過敏反應(yīng)中的大部分過敏原都屬于IgE類,與血清蛋白的調(diào)控密切相關(guān),如幾丁質(zhì)酶。這些個(gè)體可以歸類于患有IgE-介導(dǎo)的過敏反應(yīng)[15-17]。利用過敏病人血清中特異性IgE檢測柑橘,發(fā)現(xiàn)柑橘中還存在其它過敏原,如萌發(fā)素類蛋白和抑制蛋白(profilin)等[18-19],可見通過過敏血清中的IgE抗體篩選得到柑橘中更多的過敏原。有研究表明,在對(duì)195個(gè)過量食用溫州蜜柑果實(shí)的志愿者調(diào)查中,有41%的人群出現(xiàn)明顯的體溫升高、嘴唇干裂、咳嗽和口腔綜合癥等“上火”的癥狀,而這些人群的血清中IgE的含量從66.82 kU/L增加到69.87 kU/L,嗜酸性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞的數(shù)量、嗜堿性粒細(xì)胞、血小板的含量和血紅蛋白的濃度同時(shí)都發(fā)生了改變[20]。這些因素都可以通過產(chǎn)生細(xì)胞因子進(jìn)而在炎癥中起著重要的作用。例如嗜酸性粒細(xì)胞通過表達(dá)受體識(shí)別信號(hào)將病原體或宿主源性危險(xiǎn)信號(hào)放大,引發(fā)免疫反應(yīng)并誘導(dǎo)釋放的促炎細(xì)胞因子和趨化因子,發(fā)生炎癥反應(yīng)[21]。

2.2幾丁質(zhì)酶對(duì)應(yīng)的氨基酸序列

通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索,得到柑橘幾丁質(zhì)酶的蛋白質(zhì)序列登錄號(hào)為CAA93847.1。幾丁質(zhì)酶共編碼的283個(gè)氨基酸,所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為

2.3幾丁質(zhì)酶的同源比較

用BLAST對(duì)柑橘中幾丁質(zhì)酶的蛋白質(zhì)序列與其他物種,如大麥(Hordeumvulgare)、小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)、苜蓿(Medicago)和茄屬植物(SolanumL.)進(jìn)行同源性比對(duì)搜索后的結(jié)果如圖2，氨基酸序列的相似度分別是78%、76%、82%、84%和73%,表明其在氨基酸序列上有較高的相似性,說明這些物種之間可能會(huì)導(dǎo)致交叉過敏的現(xiàn)象。通過SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)對(duì)幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)域預(yù)測,得到包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,分別是幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域(ChtBD1)和甲殼素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Glyco_hydro_19),其中這兩個(gè)保守序列在對(duì)應(yīng)氨基酸的序列上方用黑色標(biāo)明指出。相似的表位結(jié)構(gòu)域具有相同免疫原性的活性,從而決定了與IgE相互作用的反應(yīng)。柑橘果實(shí)中的幾丁質(zhì)酶和其他物種具有氨基酸序列的較高同源性,因此在食用或者接觸同類食物中要注意防止發(fā)生交叉過敏反應(yīng)或者可能會(huì)出現(xiàn)休克等嚴(yán)重的癥狀。

2.4幾丁質(zhì)酶的空間結(jié)構(gòu)

利用DNAStar生物軟件中Gamier-Robson方法對(duì)蛋白質(zhì)α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的氨基酸區(qū)域進(jìn)行預(yù)測,得到的結(jié)果如圖3所示。將每一個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別列出,得到幾丁質(zhì)酶的序列如表2所示。

圖3 幾丁質(zhì)酶的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列Fig.3 The corresponding A(α-helix),B(β-helix), T(turn)and C(coil)amino acid sequences of chitinase

表2 預(yù)測幾丁質(zhì)酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列Table 2 Prediction secondary amino acid sequences of chitinase

表3 幾丁質(zhì)酶抗原指數(shù)、柔韌性、親水性及蛋白表面可及性的氨基酸序列Table 3 Prediction amino acid sequences of chitinase antigenic index,flexible regions,hydrophilicity and surface probability

2.5幾丁質(zhì)酶蛋白的B細(xì)胞表位預(yù)測

蛋白質(zhì)中的表面可及性、柔韌性等特征在與抗原結(jié)合與形成的方面發(fā)揮著重要的作用。利用DNAStar生物軟件中Jameson-Wolf方法分析得到幾丁質(zhì)酶的抗原指數(shù)、Karplus-Schulz得到幾丁質(zhì)酶的柔韌性、Kyte-Doolittle法和Emini法分別獲得幾丁質(zhì)酶的親水性和表面可及性的氨基酸序列,其具體的序列分布如圖4所示。

圖4 幾丁質(zhì)酶的親水性、柔韌性、抗原指數(shù)及蛋白表面可及性相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列Fig.4 The hydrophilicity,flexible regions,antigenic index and surface probabilityamino acid sequences of chitinase

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的親水性>0、柔韌性>0、蛋白表面可及性>1和抗原指數(shù)>0時(shí),形成與抗原結(jié)合表位的可能性增大,因此根據(jù)圖4中,所顯示的區(qū)域和DNAstar軟件中每個(gè)氨基酸所對(duì)應(yīng)的數(shù)值,提取幾丁質(zhì)酶在親水性>0、柔韌性>0、蛋白表面可及性>1和抗原指數(shù)>0時(shí),所對(duì)應(yīng)的氨基酸區(qū)域進(jìn)行列表,如表3所示。

因此綜合以上所有參數(shù),即表面可及性>1、柔韌性>0、親水性>0、抗原指數(shù)>0和氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列,將其在表3中共同擁有的區(qū)域,取交集從小到大進(jìn)行羅列,分別為62～69、96～100、126～133、145～149、155～159、169～172、179～182、189～190、208、256～262。由于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊有較穩(wěn)定的氫鍵作用,因此不易與其他物質(zhì)相作用,而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲多位于蛋白質(zhì)的表面區(qū)域,則更易于與抗體結(jié)合,形成抗原表位的可能性也越大[11]。以上列出氨基酸區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)都屬于β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲,因此可以得出幾丁質(zhì)酶蛋白的抗原結(jié)合區(qū)氨基酸的區(qū)域分別可能為62～69、96～100、126～133、145～149、155～159、169～172、179～182、189～190、256～262。通過對(duì)幾丁質(zhì)酶B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測分析,利用對(duì)該片段進(jìn)行基因功能和生物技術(shù)的方法改造,為后續(xù)研究培育低過敏的柑橘品種提供了一定的理論依據(jù)。但是本文中對(duì)于抗原性的預(yù)測均為二級(jí)結(jié)構(gòu),對(duì)于依賴于三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象抗原表位有局限性,因此還需要結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)鑒定。

3 結(jié)論

柑橘不同的品種中,幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)量存在顯著不同,其中在溫州蜜柑果實(shí)中的表達(dá)量顯著的高于琯溪蜜柚和甜橙的果實(shí)。相對(duì)于其他兩者,溫州蜜柑較容易引起過敏。

通過與大麥、小麥、玉米、苜蓿和茄屬植物進(jìn)行同源性比對(duì)搜索后的結(jié)果,得到其在氨基酸序列上有較高的相似性,相似的氨基酸序列具有相同免疫原性的活性,決定了與IgE相同作用的反應(yīng),說明這些物種之間可能會(huì)導(dǎo)致交叉過敏的現(xiàn)象。因此在食用或者接觸同類食物中要注意防止此類反應(yīng)。

B細(xì)胞抗原表位是抗原分子與體內(nèi)產(chǎn)生抗體能夠結(jié)合的氨基酸序列。通過對(duì)幾丁質(zhì)酶B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測,得到氨基酸序列在62～69、96～100、126～133、145～149、155～159、169～172、179～182、189～190和256～262時(shí),這些區(qū)域可能結(jié)合抗體?？梢詫?duì)該氨基酸片段進(jìn)行改造,對(duì)研究培育低過敏的柑橘品種或者有針對(duì)性的治療過敏人群提供了一定的理論依據(jù)。

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TheexpressionofallergenchitinaseincitrusfruitandthepredictionofBcellepitopes

YANHui-qing,LUOQing-hua,HUANGXiao-long*

(College of Life Science,Guizhou Normal University,Guiyang 550001,China)

Class I chitinase plays an important part inallergy of lots of plant food. This allergen has a relationship with and responsible for latex-fruit syndrome. Chitinase was harmful to human health on some conditions. In our study chitinase was isolated from citrus fruits. Compared with fruits of orange and pummelo,the relative expression level of chitinase in satsuma fruits was significant higher than the others. Cross-reactivity of allergen was also found,for the reason that high similarity of the amino acid sequences with many other varieties. The secondary structure with DNAStar was obtained. Meanwhile the corresponding amino acid sequences of antigen index>0,surface probability>1,hydrophilicity>0,flexible regions>0 were all obtained. When the sequences of amino acid were corresponding to these conditions,as well as that the secondary structures wereβ-turn and irregular corners,the chance of B-cell epitopes was higher. Based on the comprehensive prediction analysis,we could infer that B-cell epitopes of chitinase had the high probability in regions of 62～69,96～100,126～133,145～149,155～159,169～172,179～182,189～190,256～262.These results could provide theoretical basements for antibody preparation and many other researches.

citrus allergen;chitinase;cell epitopes

2016-11-23

閆慧清(1987-)，女，博士，講師，主要從事園藝植物功能成分方面的研究，E-mail:qingyanhui@sohu.com。

*通訊作者:黃小龍(1986-)，男，博士，副教授，主要從事園藝植物功能成分方面的研究，E-mail:huangxiaolong@gznu.edu.cn。

博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目(11904-0514156，11904-0514157)；貴州省自然科學(xué)基金(黔科合J字[2015]2117號(hào))；“通識(shí)教育基礎(chǔ)課程-營養(yǎng)與健康”課程團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目和品牌團(tuán)隊(duì)(KT2014014H；KT2016015B)。

TS201.2+5

:A

:1002-0306(2017)12-0135-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.025