,,,, ,大衛(wèi),,顧瑞

(揚州大學食品科學與工程學院,江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室,江蘇揚州 225001)

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發(fā)酵條件對膽固醇降解能力的影響

戴穎,瞿恒賢,瓦云超,黃玉軍,陳霞,陳大衛(wèi),楊正泉,顧瑞霞*

(揚州大學食品科學與工程學院,江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室,江蘇揚州 225001)

通過對混合菌株發(fā)酵條件進行優(yōu)化,提高混合菌株膽固醇降解能力與活菌數(shù),旨在獲得高效降膽固醇的混合菌株,為乳酸菌應用提供依據(jù)。選取四株具有輔助降膽固醇活性乳酸菌將其1∶1∶1∶1混合,并通過單因素實驗和響應曲面分析方法,以膽固醇降解率和活菌數(shù)為指標對混合菌株培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。以MRS培養(yǎng)基為基礎,更換不同碳氮源,確定混合菌株最適發(fā)酵條件為:乳糖24.19 g/L、胰蛋白胨8.41 g/L,培養(yǎng)溫度28.28 ℃,培養(yǎng)時間30 h,接種量5.24%。經(jīng)優(yōu)化后,混合菌株膽固醇降解率由39.56%提高到53.43%,增加了35.06%;活菌數(shù)由8.87 lgCFU/mL提高到9.63 lgCFU/mL,與優(yōu)化前相比上升了一個數(shù)量級。

混合乳酸菌,降膽固醇,發(fā)酵條件,響應面分析法

隨著人們生活水平的提高,膳食營養(yǎng)越來越豐富,但伴隨的負面影響卻是冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化等心血管和腦血管疾病的發(fā)病率持續(xù)上升。這些疾病對人類健康造成嚴重危害。如何減少膽固醇攝入和降低人體血清中膽固醇的水平已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注,研究不限飲食、不影響食品風味、經(jīng)濟實用的降低食品及人體血清中膽固醇水平的方法已成為當前的研究熱點[1]。

乳酸菌可以降低血清膽固醇,調(diào)節(jié)血脂水平,因此其受到國內(nèi)外營養(yǎng)學、醫(yī)學、微生物學等各界人士的普遍關(guān)注。國內(nèi)外大量實驗證實,服用乳酸菌及其產(chǎn)品可以減少人體血清膽固醇,具有降低心腦血管疾病發(fā)病率的功效[2-3]。賴文等[4]從四川泡菜中分離到一株植物乳桿菌,該菌不僅具有較強降膽固醇能力,同時還具有較強耐酸、耐高濃度膽汁鹽的能力并將其作為未來菌種開發(fā)的菌源。然而,目前的研究仍然存在一些問題:體外實驗雖然證明乳酸菌可以吸收膽固醇分子,但這些體外實驗多是在pH為6.0或更低的水溶液內(nèi)進行的,膽固醇的減少是源于被菌體吸收還是被菌體吸附的問題仍存在爭議。

已有的研究針對單菌株比較多,而對多菌株混合降膽固醇研究甚少,本實驗在前期實驗研究的基礎上,以實驗室保藏的四株具有輔助降膽固醇作用的乳酸菌為原料,將其混合并對混合菌株培養(yǎng)基碳氮源、起始pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間及接種量進行優(yōu)化,以改善混合菌株發(fā)酵條件,使其降膽固醇能力和活菌數(shù)得到充分提高,為生產(chǎn)高效降膽固醇功能性乳制品奠定基礎并提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

四株具有輔助降膽固醇特性的鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)grx10、干酪乳桿菌(L.casei)g9、發(fā)酵乳桿菌(L.Fermentum)f5和長雙歧桿菌(B.longum)w10及其1∶1∶1∶1簡單混合菌株 實驗室篩選保存;膽固醇、三氯化鐵、蔗糖酯等化學試劑 國藥集團化學試劑有限公司。

JF-SX-500全自動滅菌鍋 日本TOMY公司;SPX-150BSH-Ⅱ生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;Legend mach1.6R高速冷凍離心機 美國塞默飛世爾科技有限公司;Bio-Tck ELX800酶標儀 美國寶特公司。

1.2實驗方法

1.2.1 菌株活化 將四株菌株參照文獻[5]中的方法進行活化。

1.2.2 試劑配制 MRS培養(yǎng)基[6]、富膽固醇培養(yǎng)基[7-8];茚三酮顯色液[9]、硫磷鐵試劑(P-Fe-S)[10]配制方法參照文獻方法進行配制。

1.2.3 膽固醇降解率的測定 將活化好的乳酸菌按5%的接種量接種在富膽固醇培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,1800×g離心10 min,取上清液0.2 mL,加4.8 mL的無水乙醇,4000×g離心5 min,取上清液2 mL,加2 mL硫磷鐵顯色劑,混勻,待反應管冷卻到室溫后,在20 min內(nèi)測定560 nm處的OD值記作OD測量,以不接菌的富膽固醇培養(yǎng)基為對照測定560 nm處的OD值記作OD空白,計算出膽固醇降解率D,每個處理做3個重復,取平均值。降解率換算如下:

D(%)=(OD空白-OD測量)/OD空白×100

1.2.4 菌株同化率及沉淀膽固醇能力測定 參照文獻[9]方法，將1.2.3中得到的菌體沉淀,用無菌生理鹽水洗滌3遍,補充生理鹽水至5 mL,1800×g 離心10 min,分別測定560 nm處的OD值記做OD沉淀,以不接菌的富膽固醇培養(yǎng)基為對照測定560 nm處的OD值記作OD空白,計算出洗滌液中膽固醇降解率D2,D2即為膽固醇沉淀率,D1為乳酸菌同化率。

D2(%)=OD沉淀/OD空白×100

D1=D-D2

1.2.5 活菌數(shù)測定 按照GB4789.35-2010[11],采用MRS平板傾注法進行測定。

1.2.6 膽鹽水解酶(BSH)活性測定[12]取1 mL在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的菌株培養(yǎng)液,4 ℃、10000 r/min離心10 min,菌體用磷酸鈉緩沖溶液(0.1 mol/L,pH6.5)充分洗滌2次,再用3.5 mL磷酸鈉緩沖溶液懸浮,冰浴中進行超聲波破碎15 min(100 W,工作時間/間隙時間為3 s/5 s),1800×g離心10 min,取0.1 mL的上清液,加入1.8 mL 磷酸鈉緩沖溶液和0.1 mL的6 mmol/L牛磺膽酸鈉于試管中,振蕩混勻,37 ℃水浴30 min后,加入2.0 mL 15%的三氯乙酸充分混勻終止反應后,離心(1800×g,10 min),取上清液2 mL,加入1 mL的茚三酮顯色液,旋渦振蕩后,煮沸15 min,冷卻后測定其在570 nm處的吸光度值。按照文獻[13]中計算公式計算出BSH酶活。

BSH酶活=(aa×V反應液體積)/(V酶液×30)

式中,aa表示吸光度值對照標準曲線得到的氨基酸量,單位mmol/L;V反應液體積表示的顯色液的體積,本實驗中為3 mL;V酶液表示參加反應的酶液量,本實驗中為0.1 mL;30表示反應時間30 min。

1.2.7 單因素實驗 以MRS培養(yǎng)基為基礎,分別以葡萄糖、淀粉、乳糖、蔗糖為碳源,添加量20 g/L,以大豆蛋白胨、胰蛋白胨、魚粉蛋白胨、聚蛋白胨為氮源,添加量10 g/L,接種量5%,37 ℃培養(yǎng)24 h,測定活菌數(shù)及膽固醇降解率。

以篩選出的最佳碳氮源作為富膽固醇培養(yǎng)基碳氮源，添加量分別為20 g/L和10 g/L。

將混合菌株按5%的接種量接種到10 mL pH為6.5的富膽固醇培養(yǎng)基中,分別在28、30、33、35、37、40和42 ℃培養(yǎng)24 h,測定活菌數(shù)及膽固醇降解率。

將菌液按5%的接種量接種到10 mL pH為6.5的富膽固醇培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng),分別在20、25、30、35、40和45 h取樣,測定活菌數(shù)及膽固醇降解率。

將菌液分別按1%、3%、5%、7%、9%的接種量接種到10 mL pH為6.5的富膽固醇培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h取樣,測定活菌數(shù)及膽固醇降解率。

將菌液按5%的接種量接種到10 mL pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的富膽固醇培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,測定活菌數(shù)及膽固醇降解率。

1.2.8 響應面實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以混合菌株碳源、氮源及溫度和接種量為考察因素,利用Box-Behnken實驗設計進行參數(shù)優(yōu)化,因素水平設計見表1,以活菌數(shù)及膽固醇降解率為響應值。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface experiment

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 應用軟件SPSS 17.0,Excel,Origin2016,Design-Expert8.0.6進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1 不同碳氮源對混合菌株活菌數(shù)及膽固醇降解率的影響 不同碳氮源對乳酸菌生長和膽固醇降解率的影響結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 不同碳源對膽固醇降解率及活菌數(shù)的影響Fig.1 The effect of carbon source on the cholesterol reducing ability and total colonies

圖2 不同氮源膽固醇降解率及活菌數(shù)的影響Fig.2 The effect of nitrogen source on the cholesterol educing ability and total colonies

由圖1可以看出,當以乳糖為單一碳源時,混合菌株膽固醇降解率和活菌數(shù)明顯高于葡萄糖、蔗糖和淀粉。以乳糖為碳源時,膽固醇降解率達到41.73%左右,活菌數(shù)達到9.16 lgCFU/mL左右,遠遠高于其他碳源。雖然乳糖為雙糖,但其可水解為葡萄糖和半乳糖,而這兩種糖都是可以被乳酸菌利用的,混合菌株對淀粉的利用效果不太理想,這可能是由于淀粉是一種高分子多糖,需要充分的水解才能被吸收利用。因此,選擇乳糖為碳源有利于提高混合菌株膽固醇降解率和活菌數(shù)。同時，根據(jù)碳源添加量實驗結(jié)果(文中未列出)進一步確定了培養(yǎng)基碳源最佳添加量為20.0 g/L。

由圖2可以看出,不同氮源對混合菌株膽固醇降解率和活菌數(shù)的影響相對比較大。當以胰蛋白胨為氮源時,混合菌株膽固醇降解率及活菌數(shù)均明顯高于其他氮源,分別達到42.55%、9.12 lgCFU/mL。因此,為了有效地提高混合菌株降膽固醇能力、增加菌株活菌數(shù),選擇胰蛋白胨作為培養(yǎng)基氮源。進一步實驗確定了培養(yǎng)基最佳氮源添加量為10.0 g/L。

2.1.2 不同培養(yǎng)溫度對混合菌株活菌數(shù)及膽固醇降解率的影響 不同培養(yǎng)溫度對乳酸菌生長和膽固醇降解率的影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出,溫度差異對混合菌株膽固醇降解率和活菌數(shù)影響均較為顯著,當培養(yǎng)溫度在35 ℃左右時,可以獲得較高的膽固醇降解率和活菌數(shù),分別達到42.54%和9.11 lgCFU/mL,而當溫度太高或太低時,菌株膽固醇降解率及活菌數(shù)都處于較低水平。

圖3 培養(yǎng)溫度對膽固醇降解率及活菌數(shù)的影響Fig.3 The effect of temperature on the cholesterolreducing ability and total colonies

2.1.3 不同培養(yǎng)時間對混合菌株活菌數(shù)及膽固醇降解率的影響 不同培養(yǎng)時間對乳酸菌生長和膽固醇降解率的影響結(jié)果如圖4所示。從圖4可以得到,時間對菌株膽固醇降解率的影響要高于對活菌數(shù)的影響。菌株培養(yǎng)30 h左右時,膽固醇降解率和活菌數(shù)均達到最高值,分別為53.24%和9.45 lgCFU/mL。因此,混合菌株最佳培養(yǎng)時間定為30 h。

圖4 培養(yǎng)時間對膽固醇降解率及活菌數(shù)的影響Fig.4 The effect of fermentation time on the cholesterolreducing ability and total colonies

2.1.4 不同接種量對混合菌株活菌數(shù)及膽固醇降解率的影響 不同接種量對乳酸菌生長和膽固醇降解率的影響結(jié)果如圖5所示。由圖5可看出,接種量的差異對混合菌株膽固醇降解率和活菌數(shù)的影響均較為顯著,當接種量在5%左右時,膽固醇降解率和活菌數(shù)均明顯高于其他接種量,達到44.35%、9.21 lgCFU/mL。

圖5 接種量對膽固醇降解率及活菌數(shù)的影響Fig.5 Effect of inoculum size on the cholesterol reducing ability and total colonies

2.1.5 不同起始pH對混合菌株活菌數(shù)及膽固醇降解率的影響 不同pH對乳酸菌生長和膽固醇降解率的影響結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出,當pH為6.5時,菌株膽固醇降解率明顯高于其他pH時的膽固醇降解率。因此,將培養(yǎng)基起始pH維持在6.5左右。

表2 響應面設計及實驗結(jié)果Table 2 The experiment results of response surface

圖6 不同起始pH對膽固醇降解率及活菌數(shù)的影響Fig.6 The effect of pH on the cholesterol reducingability and total colonies

2.2培養(yǎng)基碳氮源使用量及發(fā)酵條件優(yōu)化

利用軟件對表2中實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析,經(jīng)擬合得到回歸方程:

Y(膽固醇降解率)=+66.17+2.34A-9.21B-6.01C-1.47D-6.60AB-23.20AC+2.85AD-10.91BC+1.13BD-5.39CD-28.24A2-16.13B2-1.12C2-18.75D2

Y(活菌數(shù))=+9.45+0.071A-6.667E-003B-0.073C-0.051D-0.16AB-0.24AC+0.38AD-0.075BC+0.022BD-0.038A2-0.12B2+3.250E-003C2-0.26D2

對模型進行方差分析(表3、表4),膽固醇降解率回歸模型p值<0.0001且失擬項的p值>0.05,表示模型極顯著,活菌數(shù)回歸模型p值<0.01且失擬項的p值>0.05,表示模型極顯著。膽固醇降解率模型項系數(shù)R2=0.9118,表明預測值與真實值之間有高度的相關(guān)性,活菌數(shù)模型項系數(shù)R2=0.8315,說明模型擬合程度好。模型回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗如下,各因素對膽固醇降解率的影響順序為B胰蛋白胨>C培養(yǎng)溫度>A乳糖>D接種量,各因素對活菌數(shù)的影響順序為C培養(yǎng)溫度>A乳糖>D接種量>B胰蛋白胨。

各交互顯著項的響應面圖見圖7～圖10。由圖7和圖8可以看出,乳糖-培養(yǎng)溫度(p<0.01)和胰蛋白胨-培養(yǎng)溫度(p<0.05)的交互影響對膽固醇降解率的影響較為顯著;由圖9和圖10可以看出乳糖-培養(yǎng)溫度(p=0.0194<0.05)和乳糖-接種量(p=0.001<0.01)的交互影響對混合菌株活菌數(shù)的影響較為顯著。通過響應面設計與分析對各個影響因素進行優(yōu)化組合最終得到混合菌株優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為:乳糖24.19 g/L,胰蛋白胨8.41 g/L,培養(yǎng)溫度28.28 ℃,接種量5.24%。

圖7 乳糖和培養(yǎng)溫度對膽固醇降解率交互影響三維曲面圖Fig.7 Surface of interaction for lactose and temperature on the cholesterol reducing ability

圖8 胰蛋白胨和培養(yǎng)溫度對膽固醇降解率交互影響三維曲面圖Fig.8 Surface of interaction for tryptone and temperature on the cholesterol reducing ability

表3 膽固醇降解率的方差分析Table 3 Variance analysis of cholesterol degradation rate

注:*表示在0.05水平上具有顯著差異,**表示在0.01水平上具有極顯著差異。表4同。

表4 活菌數(shù)的方差分析Table 4 Variance analysis of viable count

表5 優(yōu)化前后混合菌株活菌數(shù)、BSH酶活及膽固醇去除能力的對比Table 5 Comparison of growth,BSH activity and cholesterol-reducing ability of mixstrain

圖9 乳糖和培養(yǎng)溫度對活菌數(shù)交互影響的三維曲面圖Fig.9 Surface of interaction for lactose and temperature on total colonies

圖10 乳糖和接種量對活菌數(shù)交互影響的三維曲面圖Fig.10 Surface of interaction for lactose and inoculum size on total colonies

注:與優(yōu)化前相比,*表示具有顯著性差異(p<0.05)。2.3混合菌株優(yōu)化前后活菌數(shù)、膽鹽水解酶酶活及膽固醇去除能力比較

大量研究表明,雙歧桿菌[14]、干酪乳桿菌[15]、植物乳桿菌[16]等乳酸菌都可產(chǎn)生膽鹽水解酶。而這種酶可以結(jié)合膽酸分解為游離膽酸,從而與膽固醇結(jié)合形成沉淀共同沉淀下來。本實驗對混合菌株優(yōu)化前后活菌數(shù)、膽鹽水解酶酶活及膽固醇去除能力進行比較,結(jié)果見表5。

由表5可知,在MRS培養(yǎng)基中,混合菌株的膽固醇降解率為39.56%,優(yōu)化后混合菌株的膽固醇降解率達到53.43%,提高了35.06%,顯著高于優(yōu)化前膽固醇降解率(p<0.05),其中,沉淀率提高了52.73%,而同化率只提高了29.88%。此外,膽鹽水解酶酶活也增加了48.26%,說明發(fā)酵條件優(yōu)化主要是通過提升菌株膽鹽水解酶酶活和加強菌株共沉淀進而來提高菌株膽固醇去除能力的。從表5中也可以看出,優(yōu)化前混合菌株活菌數(shù)為8.87 lgCFU/mL,優(yōu)化后達到9.63 lgCFU/mL,活菌數(shù)增加了一個數(shù)量級,具有顯著性差異(p<0.05)。

3 結(jié)論

綜合單因素、響應曲面分析結(jié)果,混合菌株在乳糖24.19 g/L,胰蛋白胨8.41 g/L(MRS中其他成分不變),培養(yǎng)溫度28.28 ℃,培養(yǎng)時間30 h,接種量5.24%的條件下培養(yǎng),混合菌株的膽固醇降解率達到53.43%,較優(yōu)化前提高了35.06%,其中,沉淀率提高了52.73%,而同化率只提高了29.88%。此外,膽鹽水解酶酶活也增加了48.26%,說明發(fā)酵條件優(yōu)化主要是通過提升菌株膽鹽水解酶酶活和加強菌株共沉淀進而來提高菌株膽固醇去除能力?；罹鷶?shù)由8.87 lgCFU/mL提高到9.63 lgCFU/mL,比優(yōu)化前增加了一個數(shù)量級。

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Effectsoffermentationconditionsoncholesteroldegradability

DAIYing,QUHeng-xian,WAYun-chao,HUANGYu-jun,CHENXia,CHENDa-wei,YANGZheng-quan,GURui-xia*

(College of Food Science and Engineering,Yangzhou University,Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Safety Control,Yangzhou 225001,China)

In order to improve the ability of cholesterol degradation and the number of viable bacteria,the study optimized the fermentation conditions of mixed strains,aiming at obtaining high efficient cholesterol-degrading strains and providing the basis for the application of lactic acid bacteria. Four strains of lactic acid bacteria with auxiliary cholesterol-lowering activity were selected and mixed with 1∶1∶1∶1 mixture. The single factor experiment and response surface analysis were used to study the effects of cholesterol degradation rate and viable count. Conditions were optimized. The optimum fermentation conditions were as follows:lactose 24.19 g/L,tryptone 8.41 g/L,culture temperature 28.28 ℃,culture time 30 h,inoculation amount 5.24%. After optimization,the degradation rate of cholesterol in the mixed strains increased from 39.56% to 53.43%,increased by 35.06%. The totol colonies was increased from 8.87 lgCFU/mL to 9.63 lgCFU/mL. The viable count was an order of magnitude higher than that before optimization.

mixed lactic acid bacteria;cholesterol-lowering;fermentation conditions;response surface methodology

2016-11-30

戴穎(1991-),女,碩士研究生,主要從事乳品科學方面的研究,E-mail:1245364260@qq.com。

*通訊作者:顧瑞霞(1963-),男,博士,教授,主要從事乳品科學方面的研究,E-mail:rxgu@yzu.edu.cn。

國家自然科學基金(31571855);“十二五”國家科技支撐計劃項目(2013BAD18B12);江蘇省科技支撐項目(BN2014080);江蘇省高校自然科學研究重大項目(12KJA550003)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)12-0123-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.023