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(1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122; 2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

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馬艷麗1,讓一峰1,趙偉2,*,楊瑞金2

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122; 2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

本文研究了白蕓豆α-淀粉酶抑制劑(α-AI)對(duì)α-淀粉酶的抑制特性。通過探究淀粉濃度、孵育時(shí)間、α-淀粉酶活力、淀粉類型對(duì)白蕓豆α-AI抑制作用的影響來反映α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制特性。結(jié)果表明:白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制作用屬于非競爭性抑制,該抑制作用基本不受淀粉類型的影響,會(huì)隨孵育時(shí)間的延長而顯著增強(qiáng)(p<0.05),當(dāng)α-淀粉酶活力過高(>1.125 U)時(shí),抑制作用顯著降低(p<0.05)。

白蕓豆,α-淀粉酶抑制劑,抑制率,抑制特性

α-淀粉酶抑制劑(α-AI)能夠有效地抑制人及其他動(dòng)物體內(nèi)唾液和腸道α-淀粉酶活力,阻礙淀粉等碳水化合物的分解消化,具有減少食物攝入量、控制體重增長、減緩脂肪蓄積和降低血糖水平等生理作用[1],因而在防控肥胖癥和糖尿病方面具有廣闊的前景[2-4]。自然界中存在的α-AI安全性較高[5],在眾多谷物和豆類α-AI中,白蕓豆α-AI抑制活性更強(qiáng),生物安全性更高[6]。因而白蕓豆α-AI的提取與利用具有重要的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。國外對(duì)白蕓豆α-AI的研究較多[7-9],且其產(chǎn)品較多地集中在美、日、歐等發(fā)達(dá)國家或地區(qū)[10],而我國鮮有白蕓豆α-AI的相關(guān)產(chǎn)品。本文研究了一款國產(chǎn)白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制特性,旨在指導(dǎo)其實(shí)際應(yīng)用的方法和范圍,為其綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

白蕓豆淀粉酶抑制劑(α-AI) 活力>3000 U/g,深圳新產(chǎn)業(yè)健康管理有限公司公司;豬胰α-淀粉酶 美國Sigma-Aldrich公司;馬鈴薯淀粉、大米淀粉、小麥淀粉、玉米淀粉 標(biāo)示總糖含量分別為88.3%、85.9%、90.2%和81.7%,市售;3,5-二硝基水楊酸(DNS)、可溶性淀粉等 均為分析純。

還原糖自動(dòng)分析儀 日本日立公司;WK-1000A型高速藥物粉碎機(jī) 青州市精誠機(jī)械有限公司;PK-820電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;UV-1100型紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

表1 α-淀粉酶抑制率測定體系Table 1 Determination system for inhibition rate on α-amylase

注:-表示未添加。1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白蕓豆α-AI抑制類型的測定 將白蕓豆α-AI用PBS(pH6.9)配制成濃度為10 mg/mL的抑制劑溶液。將不同濃度(0.0125、0.025和0.05 mg/mL)的α-淀粉酶液與抑制劑溶液或PBS于37 ℃下孵育10 min后,測定添加抑制劑的α-淀粉酶與未添加抑制劑的α-淀粉酶催化濃度為10 mg/mL可溶性淀粉的反應(yīng)速率(mg/min),反應(yīng)速率以每分鐘生成的葡萄糖量(mg)計(jì)算。以α-淀粉酶濃度為橫坐標(biāo),以反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)繪制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)圖像。

將濃度為0.025 mg/mL的α-淀粉酶液分別與10 mg/mL抑制劑溶液和PBS于37 ℃下孵育10 min后,測定添加抑制劑的α-淀粉酶與未添加抑制劑的α-淀粉酶催化不同濃度(5、10、15 mg/mL)可溶性淀粉溶液的反應(yīng)速率。以1/S為橫坐標(biāo),以1/V為縱坐標(biāo)繪制Lineweaver-Burk曲線。

1.2.2α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制率的測定 參照Yang[11]的方法,將α-淀粉酶抑制劑溶液適當(dāng)稀釋使其對(duì)α-淀粉酶的抑制率(AR,%)低于50%。將0.25 mLα-淀粉酶液(1.5 U/mL)和0.25 mL適當(dāng)稀釋的抑制劑溶液加入到0.5 mL、0.2 mol/L PBS中(pH6.9),于37 ℃水浴10 min,加入0.5 mL 1%(w/w)可溶性淀粉溶液,精確反應(yīng)5 min后加入1 mL DNS試劑以終止反應(yīng)。將反應(yīng)液于沸水浴中加熱10 min后迅速置于冰水浴中冷卻至室溫,然后加入5 mL去離子水,混合均勻后于540 nm波長下測定吸光值。在測定過程中,設(shè)置空白管、空白對(duì)照管和抑制對(duì)照管?？瞻坠苤胁惶砑訕悠?空白對(duì)照管中不加α-淀粉酶液和樣品,抑制對(duì)照管中不加α-淀粉酶液,體積不足處均以PBS補(bǔ)足,反應(yīng)體系如表1所示。α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制率(AR)按式(1)計(jì)算:

式(1)

式中,A1、A2、A3和A4分別為540 nm下空白管、空白對(duì)照管、抑制管和抑制對(duì)照管的吸光值。

α-AI活力(U)定義:在37 ℃、pH6.9下,在α-淀粉酶催化淀粉水解的反應(yīng)中,1 min內(nèi)抑制1 μmol葡萄糖生成所需α-AI的量。α-AI活力按式(2)計(jì)算:

α-AI活力=AR×1.5×n×V

式(2)

式中:1.5:α-淀粉酶液的活力(U/mL);n:樣品稀釋倍數(shù);V:樣品總體積(mL)。

1.2.3 淀粉濃度對(duì)白蕓豆α-AI抑制作用的影響 將白蕓豆α-AI用PBS(pH6.9)配制成濃度為2 mg/mL的抑制劑溶液,然后將抑制劑溶液適當(dāng)稀釋,使其抑制率低于50%,在抑制活力測定過程中,添加不同濃度(0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%,w/v)的可溶性淀粉溶液,測定在不同淀粉濃度下白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制率。

1.2.4 孵育時(shí)間對(duì)白蕓豆α-AI抑制作用的影響 在抑制活力測定過程中,使抑制劑溶液與α-淀粉酶的孵育時(shí)間分別為10、30、60、90、120 min,測定在不同孵育時(shí)間下白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制率。

1.2.5α-淀粉酶活力對(duì)白蕓豆α-AI抑制作用的影響 在抑制活力測定過程中,添加不同活力(0.1875、0.375、0.75、1.125、1.5、1.875 U)的α-淀粉酶溶液,測定在不同α-淀粉酶活力下白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制率。

1.2.6 淀粉類型對(duì)白蕓豆α-AI抑制作用的影響 根據(jù)馬鈴薯淀粉、大米淀粉、小麥淀粉和玉米淀粉的標(biāo)示總糖含量將其分別配制成1%(w/v)的淀粉溶液。在抑制活力測定過程中,分別用馬鈴薯淀粉溶液、大米淀粉溶液、小麥淀粉溶液和玉米淀粉溶液代替可溶性淀粉溶液,測定在不同類型淀粉溶液下白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制率。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理方法 數(shù)據(jù)結(jié)果表示為三次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析及Ducan’s多重檢驗(yàn)(p<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1白蕓豆α-AI的抑制類型

酶的抑制劑的抑制類型與其應(yīng)用范圍有著緊密聯(lián)系[12]。根據(jù)抑制動(dòng)力學(xué)曲線可以判斷抑制劑的抑制類型。圖1所示為白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制動(dòng)力學(xué)圖。未被抑制和被抑制的α-淀粉酶的酶解速率曲線幾乎相交在原點(diǎn),這與可逆抑制特征曲線[13]相符,因此可以判定白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制作用是可逆的。結(jié)合Lineweaver-Burk圖(圖2)可以看出,未被抑制和被抑制α-淀粉酶的Lineweaver-Burk線在橫軸上的截距幾乎是一致的,而且被抑制α-淀粉酶的Lineweaver-Burk線在縱軸上的截距大于未被抑制α-淀粉酶,由此可見,白蕓豆α-AI與α-淀粉酶發(fā)生抑制作用后,α-淀粉酶酶解反應(yīng)中的米氏常數(shù)(Km)不變,而最大反應(yīng)速率(Vmax)變小,因此白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制作用屬于非競爭性抑制。

圖1 白蕓豆α-AI的抑制動(dòng)力學(xué)圖Fig.1 Inhibition kinetic diagram of α-AI

圖2 白蕓豆α-AI的Lineweaver-Burk圖Fig.2 Lineweaver-Burk diagram of α-AI

2.2淀粉濃度對(duì)白蕓豆α-AI抑制作用的影響

非競爭性抑制劑對(duì)酶的抑制作用不受底物濃度的影響,因此淀粉濃度的增加不會(huì)削弱白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制作用。圖3所示為不同淀粉濃度下白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制作用曲線。淀粉濃度的增加(0.25%～2%)不會(huì)顯著影響白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制率(p>0.05)。由于在抑制率低于50%時(shí),抑制率能較真實(shí)地反應(yīng)α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制作用[14],因此,測定前將抑制劑溶液適當(dāng)稀釋,使其抑制率低于50%。

圖3 淀粉濃度對(duì)白蕓豆α-AI抑制作用的影響Fig.3 Effects of starch concentration on the inhibition of α-AI注：標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)，圖4～圖6同。

2.3孵育時(shí)間對(duì)白蕓豆α-AI抑制作用的影響

圖4所示為不同孵育時(shí)間下白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制作用曲線。隨著孵育時(shí)間的延長,抑制率不斷增大。當(dāng)孵育時(shí)間從15 min延長到60 min時(shí),抑制率提高了2.90倍。隨著孵育時(shí)間的進(jìn)一步延長,抑制率緩慢增大。當(dāng)孵育時(shí)間為120 min時(shí),抑制率達(dá)91.38%。在以往的研究中,白蕓豆α-AI完全抑制α-淀粉酶活力所需的孵育時(shí)間不超過120 min[15],而本文中孵育時(shí)間達(dá)到120 min后,抑制率仍然未達(dá)到100%,這可能是抑制體系中所加入的抑制劑活力較低的緣故。盡管孵育時(shí)間超過30 min后抑制率高于50%,但抑制率的上升趨勢則很好地說明了孵育時(shí)間影響著α-AI的抑制作用。因此,在實(shí)際應(yīng)用中,餐前適當(dāng)時(shí)刻攝入白蕓豆α-AI可能會(huì)增強(qiáng)α-AI對(duì)腸道α-淀粉酶的抑制作用。

圖4 孵育時(shí)間對(duì)白蕓豆α-AI抑制作用的影響Fig.4 Effects of preincubation time on the inhibition of α-AI

2.4α-淀粉酶活力對(duì)白蕓豆α-AI抑制作用的影響

圖5所示是在不同α-淀粉酶活力下白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制作用曲線。當(dāng)α-淀粉酶活力為0.1875～1.125 U時(shí),抑制率無顯著變化(p>0.05)。當(dāng)α-淀粉酶活力高于1.125 U時(shí),抑制率顯著下降(p<0.05)。當(dāng)α-淀粉酶活力為1.875 U時(shí),抑制率僅為7.33%。這一現(xiàn)象說明白蕓豆α-AI對(duì)較高活力α-淀粉酶的抑制作用較小。胰蛋白酶抑制劑(TI)能夠刺激胰臟分泌更多的α-淀粉酶,因而含過高TI活力的白蕓豆α-AI產(chǎn)品在體內(nèi)無法發(fā)揮預(yù)期的生理作用[16]。

圖5 α-淀粉酶活力對(duì)白蕓豆α-AI抑制作用的影響Fig.5 Effects of α-amylase activity on the inhibition of α-AI

2.5淀粉類型對(duì)白蕓豆α-AI抑制作用的影響

馬鈴薯淀粉、大米淀粉、小麥淀粉和玉米淀粉是廣泛存在于人們?nèi)粘ｏ嬍持械牡矸垲愋汀D6所示為在不同淀粉類型下白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制作用。盡管當(dāng)?shù)矸垲愋筒煌瑫r(shí),白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制作用會(huì)出現(xiàn)顯著的變化(p<0.05),但這些變化并不是極顯著(p>0.01),因此白蕓豆α-AI能夠廣泛用于抑制α-淀粉酶對(duì)日常飲食中淀粉的水解。

圖6 淀粉類型對(duì)白蕓豆α-AI抑制作用的影響Fig.6 Effects of starch breed on the inhibition of α-AI

3 結(jié)論

α-淀粉酶的抑制特性影響其應(yīng)用范圍,因此掌握白蕓豆中α-AI的抑制特性可以更好地指導(dǎo)白蕓豆α-AI的實(shí)際應(yīng)用。本文通過研究得出白蕓豆α-AI對(duì)α-淀粉酶的抑制作用屬于非競爭性抑制,其抑制作用基本不受淀粉類型的影響,隨孵育時(shí)間的延長其抑制作用顯著增強(qiáng)(p<0.05),而當(dāng)α-淀粉酶活力過高(>1.125 U)時(shí),其抑制作用顯著降低(p<0.05)。本研究為白蕓豆α-AI的應(yīng)用提供理論依據(jù),有利于白蕓豆資源的開發(fā)利用。

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Studyontheinhibitorypropertiesofα-amylaseinhibitorfromwhitekidneybeans

MAYan-li1,RANGYi-feng1,ZHAOWei2,*,YANGRui-jin2

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China; 2.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The inhibitory properties ofα-amylase inhibitor(α-AI)from white kidney beans were analyzed by the effect of starch concentration,preincubation time,α-amylase activity and starch breed on the inhibition ofα-AI. The results showed that the inhibition ofα-AI onα-amylase was non-competitive and the variation of starch did not affect the inhibition. With the extension of preincuation time,the inhibition significantly increased(p<0.05). While withα-amylase activity exceeded 1.125 U,the inhibition significantly decreased(p<0.05).

white kidney bean;α-amylase inhibitor;inhibition rate;inhibitory property

2016-10-14

馬艷麗(1987-)，女，博士研究生，研究方向：食品加工與配料，E-mail:yanli_ma@sina.cn。

*通訊作者:趙偉(1982-)，男，博士，教授，研究方向：食品加工，E-mail:zhaow@jiangnan.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31522044,31271977)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(JUSRP51406A)。

TS214.9

:A

:1002-0306(2017)12-0109-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.020