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(藥食同源植物資源開發(fā)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川抗菌素工業(yè)研究所,成都大學(xué),四川成都 610052)

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紅曲霉菌胞外多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及抗氧化活性測定

賈紅倩,劉嵬,梁立,鄭瑞鳳,冉琳,顏軍,茍小軍,何鋼*

(藥食同源植物資源開發(fā)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川抗菌素工業(yè)研究所,成都大學(xué),四川成都 610052)

目的:分離純化紅曲霉菌胞外多糖(Exopolysaccharide,EPS),測定各組分的抗氧化活性并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步表征。方法:紅曲霉菌發(fā)酵液經(jīng)乙醇沉淀獲得胞外多糖,經(jīng)精制除雜和DEAE-纖維素柱層析法分離純化獲得多糖組分,再分別用高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)、柱前衍生PMP-HPLC法測定相對分子質(zhì)量(Mw)和單糖組成,測定多糖組分清除DPPH和羥自由基的能力,評價(jià)其體外抗氧化活性。結(jié)果:EPS經(jīng)分離得到三個(gè)組分EPS-1、EPS-2和EPS-3,相對分子質(zhì)量分別為8673、143537、238742 Da。EPS-1、EPS-2均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖組成,摩爾比為1∶0.301∶2.052∶3.614和1∶2.475∶1.950∶1.532,EPS-3由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖組成,摩爾比為1∶0.401∶0.066∶0.307∶2.974。三個(gè)多糖組分對DPPH·和羥自由基均有清除能力,并與多糖濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL時(shí),三個(gè)組分對DPPH清除率分別為16.4%、15.9%和14.8%;對清除羥自由基的清除率分別為40.4%、39.6%、63.8%。結(jié)論:紅曲霉菌胞外多糖各組分的相對分子質(zhì)量和單糖組成比例均有差異;對羥自由基、DPPH·的清除作用也存在差異,這種活性差異可能與各組分Mw及結(jié)構(gòu)差異相關(guān)。

紅曲霉菌,胞外多糖,分離純化,單糖組成,抗氧化活性

真菌胞外多糖是真菌的次級代謝產(chǎn)物,是真菌在液態(tài)培養(yǎng)過程中分泌到細(xì)胞外的易與菌體分離的水溶性膠質(zhì)多糖,因其獨(dú)特的物理學(xué)特性,廣泛應(yīng)用于各種食品的增稠、穩(wěn)定、乳化等。由于真菌胞外多糖的提取無需進(jìn)行細(xì)胞破碎處理,提取工藝簡單,目前對其提取和活性的研究日益受到研究者的重視[1]。紅曲霉菌(Monascuspurpureus)為散囊菌目子囊菌屬曲霉菌科真菌,主要用途為生產(chǎn)降脂藥物洛伐他丁以及紅曲米等降脂食品,是一種珍貴的藥食兩用真菌,具有殺菌、防腐、解毒、消食、活血、健脾等功效[2]。

近年來,已有學(xué)者對紅曲霉菌多糖進(jìn)行研究,但研究內(nèi)容集中在多糖的提取工藝優(yōu)化,以及多糖的抑菌、抗腫瘤、抗氧化等活性的報(bào)道[3-8],但缺乏紅曲霉菌胞外多糖的組成以及各組分的結(jié)構(gòu)、活性的報(bào)道。在前人的研究基礎(chǔ)上,通過液體深層發(fā)酵獲得紅曲霉菌胞外多糖,經(jīng)精制、分離純化、結(jié)構(gòu)表征、抗氧化活性的初步研究,為紅曲霉菌胞外多糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)解析、構(gòu)效關(guān)系研究和資源合理利用做鋪墊。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

菌種:紅曲霉菌(編號:CGMCC-3.5834) 購自中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心;紅曲霉菌液體培養(yǎng)基 葡萄糖50 g,蛋白胨15 g,磷酸氫二鉀5 g,硫酸鎂2.5 g,水1000 mL,pH自然,121 ℃滅菌20 min;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氫氧化鈉、D-葡萄糖(Glc)、D-阿拉伯糖(Ara)、D-鼠李糖(Rha)、D-半乳糖(Gal)、D-甘露糖(Man)、D-葡萄糖醛酸(GlcUA)、D-(+)-半乳糖醛酸(GalUA)、三氯甲烷、甲醇、濃硫酸、苯酚 分析純,成都科龍化學(xué)試劑公司;標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(DextranT-10,40,70,500,2000) 購自北京索萊寶科技有限公司;乙腈 色譜純,購自默克公司。

L-1260高效液相色譜儀、DAD-二極管陣列檢測器 安捷倫科技有限公司;L-2000液相色譜儀、L-2490示差折光檢測器 上海天美科技有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮儀器有限公司;GL-21M 型高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;FD-1C-55型凍干機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;BS-100A自動部分收集器 上海青浦滬西儀器廠;UV-5100B型可見光分光光度儀 上海元析儀器有限公司

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅曲霉菌胞外多糖的制備 紅曲霉菌種子液接種到液體培養(yǎng)基中,25 ℃,180 r/min條件下恒溫培養(yǎng)6 d。胞外多糖的制備參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行[9-10],發(fā)酵液10000 r/min離心10 min,取上清液進(jìn)行濃縮,加入4倍體積無水乙醇過夜沉淀多糖。10000 r/min離心10 min收集多糖沉淀,沉淀加入適量蒸餾水復(fù)溶,10000 r/min離心10 min,除去不溶物質(zhì),上清液再用Sevage試劑除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)直到溶液在280 nm和254 nm處無吸收為止。精制多糖溶液進(jìn)行真空冷凍干燥備用。

1.2.2 多糖的含量測定 采用徐光域等人改進(jìn)的苯酚-硫酸法[11]測定多糖含量。以系列標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),以490 nm處吸光值為縱坐標(biāo)制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,將多糖樣品吸光值代入回歸方程得到紅曲霉菌胞外多糖中的單糖濃度,即可測得多糖含量。

1.2.3 紅曲霉菌胞外多糖的分離純化 利用多糖帶電荷差異采用陰離子交換方法進(jìn)行分離。稱取精制紅曲霉菌胞外多糖凍干樣品2.0 g復(fù)溶于蒸餾水中,10000 r/min離心10 min,取上清過DEAE-纖維素柱層析,先用蒸餾水洗脫,再用0.1、0.15、0.2 mol/L NaCl溶液各洗脫200 mL,流速2 mL/min,每管5 mL自動部分收集器收集組分,共160管。取每管收集液適量,用硫酸-苯酚法顯色檢測[11]。以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制洗脫曲線,并分別收集各峰組分,濃縮,凍干。

1.2.4 多糖的分子量測定 采用高效凝膠滲透色譜法(High Performance Gel Permeation Chromatography,HPGPC)測定。色譜條件:色譜柱為YMC PACK-Diol 200 ?(300 mm×8.0 mm ID,S-5 μm,20 nm),流動相為蒸餾水;流速0.8 mL/min,柱溫室溫;檢測器為示差折光檢測器;上樣量為20 μL。

將系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品以及各多糖組分配制成2 mg/mL溶液分別進(jìn)樣分析,記錄洗脫峰的保留時(shí)間。以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對數(shù)值為縱坐標(biāo),以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)得線性回歸方程。將各多糖組分的保留時(shí)間代入回歸方程求得多糖分子量。

1.2.5 單糖組成分析

1.2.5.1 色譜條件 DAD-二極管陣列檢測器;XB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);柱溫:35.0 ℃;流動相:溶劑A:0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(KH2PO4-NaOH,pH6.72);溶劑B:乙腈,時(shí)間梯度1～5～10～35～40 min分別為19%～21%～21%～19%;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量20 μL;檢測波長:250 nm。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)單糖的衍生化 按文獻(xiàn)方法[12]分別取對照品甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖0.010 g,精密稱定,用蒸餾水溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶定容至刻度,搖勻,即得。取各單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL于試管中,分別加入1 mL 0.25 mol/L NaOH和1 mL 0.25 mol/L PMP-甲醇溶液,渦旋混勻后70 ℃水浴90 min,冷卻至室溫。用0.3 mol/L的HCl溶液將pH調(diào)至5.6,渦旋混勻,加入2 mL氯仿萃取3次,靜置備用。

1.2.5.3 多糖組分的水解及衍生化分析 將紅曲霉菌胞外多糖各組分配制成2 mg/mL的多糖溶液,取2 mL于安瓿瓶中,加入0.3 mL 2 mol/L濃硫酸,充氮?dú)饷芊?110 ℃水解2 h,0.3 mol/L的NaOH中和,離心得上清液,按照1.2.5.2方法衍生后,HPLC進(jìn)樣分析。

1.2.6 紅外光譜分析 取紅曲霉菌胞外多糖各組分適量,同KBr混合研磨均勻,壓片后進(jìn)行紅外光譜分析,掃描范圍為400～4000 cm-1。

1.2.7 抗氧化活性的測定

1.2.7.1 羥自由基的清除能力 取不同濃度紅曲霉菌胞外多糖溶液1.0 mL,分別加入FeSO4溶液2.0 mL,水楊酸-乙醇1.5 mL,H2O20.1 mL振蕩混勻,37 ℃水浴保溫30 min,波長510 nm下測量吸光值。以1.0 mL蒸餾水代替多糖溶液測得空白對照吸光值[13]。

清除率(%)=[(A0-As)/A0]×100

式中,A0為空白管的吸光度,As為加入樣品后的吸光度。

1.2.7.2 DPPH·的清除能力 取不同濃度紅曲霉菌胞外多糖溶液0.1 mL,分別加入3.9 mL 0.1 mmol/L DPPH(95%乙醇配制),渦旋混勻,避光37 ℃反應(yīng)30 min,高速離心10 min;取0.1 mL純水,加入3.9 mL 0.1 mmol/L DPPH混勻作空白對照,0.1 mL純水加3.9 mL 的95%乙醇作參比,混勻后暗處反應(yīng)30 min,517 nm處測定吸光值[13]。

清除率(%)=(1-As/A0)×100

式中,A0為空白管的吸光度,As為加入樣品后的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及多糖含量

由圖1可知,葡萄糖在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi),濃度與吸光度值線性良好,曲線方程Y=0.7344X-0.0127,r=0.9993(Y為吸光度值,X為葡萄糖濃度，mg/mL)。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose

紅曲霉菌胞外多糖溶液(稀釋10倍)的吸光值為0.3692,代入回歸方程中并乘以稀釋倍數(shù),得紅曲霉菌胞外多糖濃度為5.23 mg/mL。

2.2紅曲霉菌胞外多糖的分離純化

DEAE-纖維素柱層析結(jié)果見圖2。分別合并1～40管、42～80管、收集第80～100管作為紅曲霉菌胞外多糖的三個(gè)組分(EPS-1,EPS-2,EPS-3)。

圖2 紅曲霉菌胞外多糖洗脫曲線Fig.2 The result of DEAE-cellulose column chromatography

2.3相對分子質(zhì)量的測定

測定系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的保留時(shí)間,以保留時(shí)間對相對分子質(zhì)量的對數(shù)作圖,得線性回歸方程Y=-0.5483X+8.8252,r=0.9539(X為保留時(shí)間,Y為分子量對數(shù))。將紅曲霉菌胞外多糖三個(gè)組分在相同色譜條件下進(jìn)樣分析,并記錄各組分色譜峰的保留時(shí)間,代入線性回歸方程,計(jì)算得EPS-1、EPS-2、EPS-3的相對分子質(zhì)量(Mw)分別為8673、143537、238742 Da,結(jié)果見表1。

表1 分子量測定結(jié)果Table 1 The results of molecular weights of EPSs and standard samples

2.4單糖組成分析

2.4.1 單糖衍生物的分離 取各單糖衍生物(1 mg/mL)1 mL置于10 mL容量瓶中,加蒸餾水定容配成混合單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1 mL稀釋100倍,按照1.2.5.1色譜條件,HPLC進(jìn)樣分析,得到混合單糖標(biāo)準(zhǔn)圖譜。由圖3可知,7種單糖衍生物得到了良好的分離。

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of mixed standard monosaccharides

2.4.2 線性關(guān)系 分別取1.2.5.2項(xiàng)下所得各單糖衍生物溶液1 mL,加入蒸餾水稀釋成6個(gè)不同濃度,按照1.2.5.1色譜條件進(jìn)樣分析。根據(jù)單糖的濃度對相應(yīng)峰面積進(jìn)行線性回歸(Y表示峰面積,X表示濃度),結(jié)果見表2。

表2 單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Regression equations of monosaccharides

表3 單糖組成及摩爾比Table 3 Composition and molar ratio of monosaccharides of EPS

2.4.3 紅曲霉菌胞外多糖衍生物分析 EPS-1、EPS-2、EPS-3的HPLC圖譜見圖4。由峰面積及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得EPS各單糖質(zhì)量濃度,與摩爾質(zhì)量之比得各單糖摩爾濃度,各單糖摩爾濃度之比即為摩爾比,結(jié)果見表3。

圖4 紅曲霉菌胞外多糖衍生物色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of EPS注:a:EPS-1,b:EPS-2,c:EPS-3。

2.5紅曲霉菌胞外多糖各組分的紅外光譜分析

各胞外多糖組分紅外光譜如圖5所示。在3400 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰主要是由多糖的配糖體羥基伸縮振動引起的,羥基形成氫鍵締合后,O-H鍵拉長,偶極矩增大,因此表現(xiàn)強(qiáng)而寬的峰;2900 cm-1附近的吸收峰為C-H的伸縮振動吸收峰;1670 cm-1附近出現(xiàn)的較強(qiáng)吸收峰是C-O伸縮振動引起的;1470 cm-1附近的吸收峰為C-H的變角振動吸收峰。由紅外圖譜可知EPS-1、EPS-2、EPS-3具有明顯的糖類化合物的特征。此外,EPS-3和EPS-1及EPS-2相比,在1099、1072、920 cm-1附近出現(xiàn)吸收峰。1099 cm-1是C-O的伸縮振動吸收峰;1072 cm-1附近出現(xiàn)的峰是吡喃糖環(huán)內(nèi)酯和羥基的吸收峰,是糖環(huán)上C-O-O醚鍵的不對稱伸縮振動;920 cm-1是吡喃糖環(huán)的非對稱伸縮振動吸收。這表明EPS-3的糖鏈組成與EPS-1和EPS-2存在差異。

圖5 紅曲霉菌胞外多糖組分的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrum of EPS

2.6抗氧化活性

2.6.1 DPPH·的清除 不同濃度的三個(gè)多糖組分對DPPH的清除率結(jié)果見圖6。在0.2～1 mg/mL范圍內(nèi),三個(gè)多糖組分對DPPH的清除能力均與多糖濃度呈正相關(guān),當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL時(shí),三個(gè)組分對DPPH清除率分別為16.4%、15.9%和14.8%。

圖6 多糖組分對DPPH的清除率Fig.6 DPPH radical scavenging activity of EPS

2.6.2 羥自由基的清除 不同濃度的三個(gè)多糖組分對羥自由基的清除率結(jié)果見圖7。當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL時(shí),EPS-3對清除羥自由基的清除率為63.8%,呈現(xiàn)出較高的清除羥自由基的能力,而EPS-1和EPS-2分別為40.4%和39.6%。

圖7 多糖組分對羥自由基的清除率Fig.7 Hydroxyl radical scavenging activity of EPS

3 結(jié)論

紅曲霉菌胞外多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱分離純化獲得三個(gè)組分EPS-1、EPS-2、EPS-3,通過高效凝膠色譜法分析其相對分子質(zhì)量(Mw)分別為8673、143537、238742 Da。單糖組成分析和紅外光譜數(shù)據(jù)表明EPS-1和EPS-3可能是以半乳糖為主鏈組成的雜多糖,具體結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究。三個(gè)組分對DPPH和羥自由基均有一定的清除能力,并在一定的濃度范圍內(nèi)紅曲霉菌胞外多糖對羥自由基和DPPH·的清除作用與濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL時(shí),三個(gè)組分對DPPH·清除率分別為16.4%、15.9%和14.8%,對羥自由基的清除率分別為40.4%、39.6%和63.8%。結(jié)果表明紅曲霉菌胞外多糖各級組分之間的抗氧化活性、單糖組成比例均存在一定差異,這可能與Mw及其結(jié)構(gòu)相關(guān)[14]。

[1]阿燕. 真菌多糖抗氧化活性的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)雜志,2012,32(4):83-86.

[2]李秀巖,魏健,孫振雷. 紅曲多糖的提取與發(fā)酵工藝的優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(21):5653-5654.

[3]周芳美,朱曉松,潘佩蕾,等. 紅曲霉菌胞外多糖的抗腫瘤活性研究[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2011(1):123-124.

[4伍健萍. 紅曲霉發(fā)酵多糖條件及抗氧化活性的初步研究[D].天津:天津科技大學(xué),2012.

[5]宋丹丹. 曲霉多糖的提取及其抑菌活性研究[D].長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[6]Srianta I,Ristiarini S,Nugerahani I,et al. Recent research and development of Monascus fermentation products[J]. International Food Research Journal,2014,21(1):1-12.

[7]Wang P. Optimizing the Extraction Technology of Monascus Exopolysaccharide by Response Surface Methodology[J]. Journal of the Chinese Cereals & Oils Association,2011,26(12):83-1666.

[8]Xijun L. Current Study and Prospect on the Photostability of Monascus Pigment[J]. Meat Research,2003,2(64):33-34.

[9]汪鵬榮. 一株高產(chǎn)胞外多糖紅曲霉發(fā)酵和提取工藝及抗氧化活性研究[D].杭州:浙江師范大學(xué),2012.

[10]蔡琴,沈彬彬,張慧,等. 紅曲霉菌胞外多糖提取及抗氧化活性測定[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2010(3):598-600.

[11]徐光域,顏軍,郭曉強(qiáng),等. 硫酸-苯酚定糖法的改進(jìn)與初步應(yīng)用[J]. 食品科學(xué),2005,26(8):342-346.

[12]孫曉春,顏軍,何鋼,等. 川芎多糖的分離純化及其單糖組成測定[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,29(1):56-60.

[13]羅懿洋,任道遠(yuǎn),陳麗芳,等. 杏鮑菇多糖的單糖組成分析及其抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2015(8):158-161.

[14]何鋼,劉嵬,李會萍,等. 銀杏葉多糖分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(22):81-86.

Isolationandpurification,structureidentificationandantioxidantactivityofMonascuspurpureusexopolysaccharide

JIAHong-qian,LIUWei,LANGLi,ZHENGRui-feng,RANLin,YANJun,GOUXiao-jun,HEGang*

(The Key Laboratory of Medicinal and Edible Plants Resources Development of Sichuan Education Commission, Sichuan Industrial Institute of Antibiotics,Chengdu University,Chengdu 610052,China)

Objective:To isolate and purify the crudeMonascuspurpureusexopolysaccharide(EPS)and study the structure identification and antioxidant activity of the exopolysaccharide fractions. Method:The crude polysaccharide was extracted by liquid fermentation and purified by DEAE-cellulose. Molecular weights(Mw)of exopolysaccharide fractions were determined by high performance gel permeation chromatography(HPGPC)and the monosaccharide compositions were determined then by HPLC using precolumnderivatization with 3-methyl-1-phenyl-5-pyrazolone(PMP)separately. The ability of scavenging DPPH and hydroxyl free radical of polysaccharide fractions was tested to evaluate the antioxidant activity. The findings showed that three fractions(EPS-1,EPS-2,EPS-3)were obtained and molecular weights(Mw)were 8673,143537,238742 Da respectively. Both EPS-1,EPS-2 were composed of mannose,rhamnose,glucose and galactose with a molar ratio of 1∶0.301∶2.052∶3.614 and 1∶2.475∶1.950∶1.532,EPS-3 were composed of mannose,rhamnose,Glucuronic acid,glucose and galactose in a molar ratio of 1∶0.401∶0.066∶0.307∶2.974. The ability of removing DPPH and hydroxyl free radicals of polysaccharide fractions were positively related with concentrations. When it was up to 1 mg/mL,the DPPH clearance rate turned out to be 16.4%,15.9% and 14.8% respectively,hydroxyl free radical clearance rate of EPS-3 was 63.8%,and EPS-1,EPS-2 was 40.4% and 39.6% respectively. Conclusion:There existed some difference in monosaccharide composition and relative molecular mass and the ability of scavenging hydroxyl free radical and DPPH scavenging ability among EPSs,which could be associated with Mw and their structures.

Monascuspurpureus;exopolysaccharide;isolation and purification;monosaccharide composition;antioxidant activity

2016-11-04

賈紅倩(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：多糖分析化學(xué)，E-mail：1550926634@qq.com。

*通訊作者:何鋼(1982-)，男，博士，副教授，研究方向：多糖生物化學(xué)，E-mail：hegang@cdu.edu.cn。

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)計(jì)劃項(xiàng)目(2015JY0117)；四川省教育廳基礎(chǔ)計(jì)劃項(xiàng)目(14ZB0374)；四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開發(fā)課題(10Y201501)。

TS201.2

:A

:1002-0306(2017)12-0092-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.017