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(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧錦州 121013; 2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶北碚 400716; 3.大連天寶綠色食品有限公司,遼寧大連116001; 4.浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司,浙江舟山315200; 5.大連東霖食品股份有限公司,遼寧大連116007)

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草魚(yú)魚(yú)皮不同分子量肽段體外抗氧化性能的研究

蔡路昀1,2,冷利萍1,李秀霞1,呂艷芳1,勵(lì)建榮1,2,*,趙葳3,馬永鈞4,沈琳5

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧錦州 121013; 2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶北碚 400716; 3.大連天寶綠色食品有限公司,遼寧大連116001; 4.浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司,浙江舟山315200; 5.大連東霖食品股份有限公司,遼寧大連116007)

采用堿性蛋白酶對(duì)草魚(yú)皮進(jìn)行水解,并將水解產(chǎn)物通過(guò)截留分子量為10、5和3 kDa的超濾膜,得到>10、5～10、3～5和<3 kDa 四種不同分子量肽段組分。主要研究了粗蛋白水解產(chǎn)物經(jīng)截留后不同分子量肽段的體外抗氧化活性及其功能,結(jié)果表明相同濃度下3～5和<3 kDa肽段組分在清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基方面比蛋白水解產(chǎn)物或其它肽段組分的效果顯著(p<0.05),而>10 kDa肽段組分與Fe2+螯合能力最強(qiáng)。然而,與還原型的L-谷胱甘肽相比,>10、5～10、3～5 kDa肽段組分具有較弱的清除超氧陰離子自由基能力,肽的氨基酸序列在其抗氧化活性中起到關(guān)鍵作用。結(jié)果表明,<3 kDa肽段組分可作為功能性天然抗氧化劑添加到保健食品中。

草魚(yú),魚(yú)皮,水解產(chǎn)物,抗氧化能力,不同分子量肽段

人體和其它需氧生物體內(nèi)均會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)進(jìn)而引發(fā)許多健康問(wèn)題[1]。氧化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生自由基,其在信號(hào)傳導(dǎo)中起主要作用[2]。然而,過(guò)多的自由基能夠迅速與其它氧化物質(zhì)反應(yīng),進(jìn)而對(duì)細(xì)胞組織或機(jī)體造成多種損傷和病變[3]。一些合成抗氧化劑如二丁基羥基甲苯(BHT)和叔丁基氫醌(TBHQ)能夠用于減緩食品中的氧化反應(yīng)。然而,為了避免合成抗氧化劑對(duì)健康造成潛在危害,開(kāi)發(fā)一種既安全又廉價(jià)的天然抗氧化劑,已成為現(xiàn)代食品、醫(yī)藥和保健品行業(yè)的熱門課題之一。

蛋白質(zhì)是天然生物活性肽的主要來(lái)源,蛋白質(zhì)水解是食品中蛋白質(zhì)通過(guò)胃消化、蛋白酶水解和微生物酶共同作用而發(fā)生的[4-5],多肽和游離氨基酸即為蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物。事實(shí)上,一些生物活性多肽用于治療諸如高血壓、高血脂、炎癥、糖尿病、微生物感染、免疫障礙甚至癌癥等疾病時(shí)效果顯著[5]。目前已知它們可以作為抑制由活性氧誘導(dǎo)的氧化損傷的自由基清除劑,因此從食物來(lái)源中提取天然抗氧化肽已經(jīng)引起研究者的廣泛關(guān)注[6]。

草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)是一種在亞洲及北美洲湖泊河流中常見(jiàn)的淡水魚(yú)。草魚(yú)目前主要加工成魚(yú)糜制品,而在生產(chǎn)魚(yú)糜制品的過(guò)程中,會(huì)產(chǎn)生魚(yú)皮等廢棄物,因此如果對(duì)草魚(yú)皮進(jìn)行加工利用,不僅可以提高魚(yú)類的利用價(jià)值和水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)附加值,同時(shí)還能減少資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。草魚(yú)蛋白含有豐富的甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)和精氨酸(Arg)[7]。Ren等[8]報(bào)道草魚(yú)肌肉蛋白的水解產(chǎn)物具有抗氧化性質(zhì)。另外有研究報(bào)道了草魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白的提取條件和魚(yú)皮蛋白水解產(chǎn)物的功能特性[9-10],然而,卻很少有對(duì)草魚(yú)魚(yú)皮肽段體外抗氧化活性的研究。本研究旨在確定草魚(yú)魚(yú)皮蛋白水解產(chǎn)物及其通過(guò)分子量截留后不同大小的肽段組分,測(cè)定草魚(yú)皮酶解產(chǎn)物中不同肽段的抗氧化性,便于進(jìn)一步分離純化,并分析其氨基酸組成和體外抗氧化能力,將來(lái)可以根據(jù)不同肽段的不同強(qiáng)弱抗氧化性進(jìn)行區(qū)別應(yīng)用,為其他研究魚(yú)皮或水產(chǎn)品抗氧化肽的研究者提供研究借鑒,也為我們下一步的研究基礎(chǔ)做好探索。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

草魚(yú)魚(yú)皮 錦州當(dāng)?shù)厮a(chǎn)加工企業(yè)提供;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、還原型L-谷胱甘肽(GSH)、亞油酸、ABTS、乙二胺四乙酸(EDTA)、三氯乙酸(TCA)、鄰苯三酚 美國(guó)Sigma公司;堿性蛋白酶(2.0×105U/g) 江蘇瑞陽(yáng)生物科技有限公司;截流分子10、5、3 kDa Pellicon纖維素平板膜,有效膜面積均為0.5 m2Millipore公司;其余試劑 均為分析純,錦州國(guó)藥器化玻有限公司。

PL602-L電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;Optima 4300 DV電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 美國(guó)Perkin Elmer公司;L-8900氨基酸分析儀;PE Victor X3酶標(biāo)儀 美國(guó)Perkin elmer公司;高速冷凍離心機(jī) Thermo公司;Free Zone2.5真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司;超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司;UV-2550紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;Pellicon小型超濾系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 草魚(yú)皮蛋白水解產(chǎn)物的制備 將冷凍干燥的草魚(yú)皮切成(0.5×0.5 cm2)小塊,取干燥的魚(yú)皮(10 g)浸泡在500 mL異丙醇中用于脫脂,并在室溫下連續(xù)攪拌。將脫脂魚(yú)皮溶解在400 mL蒸餾水中,并且使用0.1 mol/L NaOH將混合物的pH調(diào)節(jié)至8.5,隨后加入堿性蛋白酶(12000 U/g)。將混合物在50 ℃的條件下連續(xù)攪拌加熱120 min[8]。酶解后取出水解產(chǎn)物,90 ℃水浴10 min滅酶,然后以10000×g離心20 min。取出上清液在真空冷凍干燥機(jī)(壓力0.035 mBar,溫度-48 ℃)中凍干24 h得到草魚(yú)皮蛋白水解產(chǎn)物粉末(GPH)。

1.2.2 不同分子量肽段制備 將300 mg GPH加入到6 mL蒸餾水中并充分混和。將GPH溶液通過(guò)0.22 μm過(guò)濾膜過(guò)濾。將獲得的混合物通過(guò)10、5和3 kDa的一次性超濾膜截留,得到四個(gè)截留組分:>10、5～10、3～5和<3 kDa。將所得多肽組分分別凍干并保存在-20 ℃的干燥裝置中。

1.2.3 基本組成分析 參考AOAC[11]方法分析測(cè)定水分、蛋白質(zhì)、脂肪和灰分的含量。

1.2.4 氨基酸組成測(cè)定 取100 mg GPH或肽段的粉末溶于6 mol/L HCl中,充氮密封后于110 ℃水解24 h。結(jié)束后轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上50 ℃進(jìn)行旋蒸,并將殘余物溶解在0.1 mol/L HCl中定容至25 mL。最后取20 μL上樣測(cè)定各樣品的氨基酸組成。

1.2.5 抗氧化活性的測(cè)定 參考張華[12]設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)濃度,將GPH和四種不同分子量的肽段組分分別配制成濃度為1、3和5 mg/mL,進(jìn)行體外抗氧化活性的測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.1 DPPH自由基清除力測(cè)定 DPPH自由基的清除能力使用96孔板測(cè)定。將樣品溶解于含有1.0%(w/v)Triton X-100的磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH7.0)中,將DPPH自由基溶解于95%乙醇中。將樣品溶液等分成0.1 mL與0.1 mL的DPPH溶液混合,最后得到多肽的測(cè)定濃度分別為1、3和5 mg/mL,隨后將混合溶液放在黑暗中反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后,使用酶標(biāo)儀在517 nm處測(cè)定溶液的吸光度。磷酸鹽緩沖液等分成0.1 mL與0.1 mL DPPH溶液混合作為空白。使用濃度為1 mg/mL的GSH做為對(duì)照。DPPH自由基清除能力的公式如下:

DPPH自由基清除率(%)=[(Ab-As)/Ab]× 100

式中,Ab是空白的吸光度,As是樣品的吸光度。

1.2.5.2 還原力測(cè)定 按照Oyaizu[13]的還原力測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。

表1 草魚(yú)皮蛋白水解液和不同分子量的肽段的基本組成Table 1 Proximate compositions of GPH and its different molecular weight peptide fractions

注:同行不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(p<0.05);表2同。1.2.5.3 超氧陰離子自由基的清除率測(cè)定 按照Xie[14]方法測(cè)定超氧陰離子自由基的清除率。

1.2.5.4 ABTS自由基清除能力測(cè)定 按照Wiriyaphan[15]的方法測(cè)定ABTS。

1.2.5.5 Fe2+螯合能力測(cè)定 按照Decker和Welch[16]螯合FeCl2的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5.6 亞油酸體系測(cè)定抗氧化能力 按照Farvin[17]的亞油酸體系測(cè)定抗氧化能力。

表2 草魚(yú)皮蛋白水解液和不同分子量肽段的氨基酸組成(%)Table 2 Amino acid compositions of GPH and its different molecular weight peptide fractions(%)

1.3數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行三次重復(fù)測(cè)量,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。將數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),使用Duncan’s多重范圍檢驗(yàn)(SAS版本8.1),p<0.05被認(rèn)為是有顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1草魚(yú)不同分子量肽段的基本組成分析

通過(guò)截留分子量為10、5、3 kDa的超濾膜來(lái)獲得GPH的不同分子量的肽段,并獲得四個(gè)肽段組分(>10、5～10、3～5、<3 kDa)。GPH和不同分子量肽段的基本組成成分如表1所示。所有樣品含有非常高的蛋白質(zhì)含量(GPH:82.1%;>10 kDa:89.1%;5～10 kDa:90.4%;3～5 kDa:90.2%;<3 kDa:92.3%)和非常低的脂肪含量(0.03%～0.88%)。王立峰等[18]研究發(fā)現(xiàn)不同分子量肽段的抗氧化活性的強(qiáng)弱與氨基酸的種類、組成、疏水性以及其在肽鏈中的位置有關(guān)。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位,賦予蛋白質(zhì)特定的分子結(jié)構(gòu)形態(tài),使它的分子具有生化活性。結(jié)果表明草魚(yú)魚(yú)皮蛋白質(zhì)含量非常豐富,說(shuō)明草魚(yú)皮是制備抗氧化肽的良好來(lái)源。

低脂肪含量可能是通過(guò)異丙醇和水解脫脂使脂肪含量降低。Gbogouri等[19]報(bào)道酶蛋白水解產(chǎn)物脂肪含量低。在酶水解的過(guò)程中,由于草魚(yú)皮去除了脂質(zhì)結(jié)構(gòu),細(xì)胞膜傾向于收縮并形成不溶性物質(zhì)[20]。GPH和肽段各組分的灰分含量分別為9.3%、6.8%、2.9%、2.5%和3.3%,這與Ktari等[21]通過(guò)酶處理烏賊加工副產(chǎn)物得到的結(jié)果相似。

2.2氨基酸組成分析

GPH和四種肽段的氨基酸組成成分如表2所示。由表2可知,在GPH和四種不同分子量的肽段中氨基酸的占比不盡相同,GPH和>10 kDa組分中Lys和Arg含量較高,3～5 kDa組分中Leu含量最高,<3 kDa組分中Gly和Pro含量較高。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),多肽中包含疏水性氨基酸(Val、Pro、Tyr、Leu、Ala、Lys、Met)都普遍具有較強(qiáng)的抗氧化性能[22-23]。Udenigwe和Aluko[5]報(bào)道疏水性氨基酸在DPPH自由基清除,超氧化物自由基清除和還原力的測(cè)定中發(fā)揮主要作用,表2表明除>10 kDa(23.1%)肽段外,GPH和其它肽段組分具有更高的疏水性氨基酸水平(34.2%～38.8%),這可能對(duì)DPPH自由基清除,超氧化物自由基清除和還原力的抗氧化效果有一定的貢獻(xiàn)。Hernández等[24]研究發(fā)現(xiàn)His在OH清除劑、金屬離子螯合劑等方面表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化性能,因此被認(rèn)為是對(duì)抗氧化性有較大貢獻(xiàn)的氨基酸之一,相比其它組分,>10 kDa組分中His含量最高,這與抗氧化能力測(cè)試中其亞鐵離子清除率最高比較吻合。Segura-Campos等[25]表明芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp)的存在有助于增強(qiáng)抗氧化能力,是因?yàn)檫@些氨基酸中吲哚基和苯環(huán)可供氫,緩解或終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),自身的穩(wěn)定性可以通過(guò)共振來(lái)維持[24],其中GPH中芳香族氨基酸含量最高(8.58%)、5～10和<3 kDa組分含量次之(7.73%和7.04%),這與具體的抗氧化結(jié)果有一定的關(guān)系。Saito等[26]認(rèn)為His對(duì)于亞油酸的過(guò)氧化有抑制作用,GPH和5～10、3～5、<3 kDa組分中His含量在2.0%～3.2%之間。

2.3肽段的體外抗氧化活性分析

在本研究中,通過(guò)不同的抗氧化機(jī)制來(lái)評(píng)價(jià)肽段的抗氧化活性。采用六種體外測(cè)定方法評(píng)價(jià)肽段的抗氧化性質(zhì):DPPH自由基清除能力、還原力、超氧陰離子自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、與金屬離子螯合能力和抑制亞油酸氧化。

2.3.1 DPPH自由基清除能力分析 圖1表示GPH和各分子量肽段組分在清除DPPH自由基方面具有較高的抗氧化活性,且隨著樣品濃度的增加,自由基的清除能力也隨之增強(qiáng),這與之前Farvin等[16]報(bào)道結(jié)果一致。各組分在5 mg/mL 濃度清除DPPH自由基能力均顯著(p<0.05)高于1和3 mg/mL。在四個(gè)組分中,<3 kDa組分表現(xiàn)出最強(qiáng)的DPPH自由基清除能力,當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí),DPPH自由基的清除能力為70.14%,僅次于1 mg/mL GSH(94.96%),而GPH和3～5 kDa組分在5 mg/mL濃度時(shí)的DPPH自由基清除率無(wú)顯著差異(p>0.05)。整體看來(lái),<3 kDa組分表現(xiàn)出最強(qiáng)的DPPH自由基清除能力,而>10和5～10 kDa組分在清除DPPH自由基方面顯著低于其它組分(p<0.05),結(jié)合氨基酸組成的分析,可能是<3 kDa組分中疏水性氨基酸的含量和有效作用綜合提高了其DPPH自由基清除能力,>10 kDa組分中疏水性氨基酸的含量少和5～10 kDa組分中疏水性氨基酸的有效抗氧化基團(tuán)暴露程度降低了其DPPH自由基清除能力。這與張翀[27]在大黃魚(yú)蛋白源抗氧化肽的制備、性質(zhì)及抗氧化機(jī)理研究中發(fā)現(xiàn),利用不同截留分子量的超濾膜分離大黃魚(yú)蛋白源抗氧化粗肽,<3 kDa組分表現(xiàn)出最強(qiáng)的DPPH自由基清除能力結(jié)果類似。張榮華[28]在豬皮膠原蛋白酶解物的抗氧化特性中研究不同分子量的豬皮膠原蛋白酶解物組分對(duì)DPPH自由基的清除能力,發(fā)現(xiàn)在濃度為5 mg/mL時(shí),5～10 kDa組分對(duì)DPPH自由基的清除能力的最強(qiáng),清除率為27.03%。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在濃度為5 mg/mL時(shí),不同分子量的肽組分對(duì)DPPH自由基的清除率都要比豬皮膠原酶解物組分對(duì)DPPH自由基的清除能力強(qiáng),尤其<3 kDa組分,對(duì)自由基的清除率為70.14%。

圖1 草魚(yú)皮蛋白水解液和不同分子量肽段組分的DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging activities of GPH and different molecular weight peptide fractions注:不同小寫(xiě)字母代表組內(nèi)不同濃度的差異顯著性(p<0.05),不同大寫(xiě)字母代表組間同等濃度的差異顯著性(p<0.05);圖2～圖5同。

2.3.2 還原力測(cè)定分析 還原力測(cè)定通常用于評(píng)價(jià)抗氧化劑得失電子和穩(wěn)定自由基的能力。如圖2所示,GPH和肽段組分都具有一定程度的還原力,并均隨濃度的增大而增強(qiáng),比較GPH和肽段組分發(fā)現(xiàn),<3 kDa組分具有顯著的還原力(p<0.05)。Bougatef等[29]研究發(fā)現(xiàn)肽的還原力隨著樣品濃度的增加而增加,這與本文趨勢(shì)一致。濃度同為1 mg/mL,四種肽段組分的還原能力都在0.128～0.315內(nèi),較相同濃度下的GSH(1.34)還原能力顯著降低(p<0.05),而5 mg/mL的<3 kDa組分還原力能力大大增強(qiáng),僅次于1 mg/mL的GSH,這可能與<3 kDa組分中疏水性氨基酸的含量有關(guān),此濃度下暴露出更多有效抗氧化基團(tuán),作為良好的電子供體,起到抗氧化的功效。

圖2 草魚(yú)皮蛋白水解液和不同分子量肽段組分的還原力Fig.2 Reducing power of GPH and different molecular weight peptide fractions

2.3.3 超氧陰離子自由基的清除率測(cè)定分析 GPH和四種肽段組分對(duì)超氧陰離子自由基的清除率如圖3所示。當(dāng)樣品濃度達(dá)到最大時(shí),所有樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率最高為5 mg/mL的<3 kDa組分(40.88%),5 mg/mL的GPH次之(36%),該結(jié)果均低于抗氧化劑GSH的值(91.37%)。Wang等[30]從玉米蛋白水解產(chǎn)物多肽中也得到了類似的結(jié)果,其清除超氧陰離子自由基的清除率為34.94%,略低于本文研究。Samak等[31]從植物提取物中也發(fā)現(xiàn)其酶解液中具有清除超氧陰離子自由基的能力,其效果稍好于本研究發(fā)現(xiàn)的<3 kDa組分。Wang等[32]從蚌類水解產(chǎn)物中提取新型的抗氧化肽在相同濃度下清除超氧陰離子自由基的能力與我們結(jié)果相似。然而,同等度下>10 kDa和5～10 kDa組分對(duì)于超氧陰離子自由基清除能力無(wú)顯著差異(p>0.05),<3 kDa組分的清除能力較GPH的略高,這些結(jié)果表明可能清除超氧陰離子自由基的抗氧化基團(tuán)主要是小分子肽段,經(jīng)超濾膜分離后多集中在<3 kDa組分中,>10 kDa和5～10 kDa組分中截留分子量較大。

圖3 草魚(yú)皮蛋白水解液和不同分子量肽段組分的超氧陰離子自由基清除能力Fig.3 Superoxide radical scavenging activities of GPH and different molecular weight peptide fractions

圖4 草魚(yú)皮蛋白水解液和不同分子量肽段組分的ABTS自由基清除能力Fig.4 ABTS radical scavenging activities of GPH and different molecular weight peptide fractions

2.3.4 ABTS自由基清除能力測(cè)定分析 ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)(圖4)顯示，ABTS自由基清除率與樣品濃度呈線性關(guān)系。隨著濃度的增加,其ABTS自由基清除能力也逐漸增加。Cheung等[33]研究太平洋鱈魚(yú)蛋白水解產(chǎn)物也得到同樣趨勢(shì)。低于5 mg/mL濃度時(shí),GPH和四種組分的清除能力較弱,而5 mg/mL濃度下,<3和3～5 kDa組分的ABTS自由基清除率分別為51.78%和43.64%,GPH次之(40.62%),均低于GSH(94.62%,1 mg/mL)對(duì)ABTS自由基的清除率。與超氧陰離子結(jié)果相似,相同濃度下>10和5～10 kDa兩種組分對(duì)于清除ABTS自由基無(wú)顯著差異(p>0.05)。Hernández等[26]將發(fā)酵乳中水溶部分通過(guò)RP-HPLC進(jìn)行分離純化得到抗氧化肽,研究其活性發(fā)現(xiàn)Tyr對(duì)ABTS自由基清除貢獻(xiàn)較大,這類氨基酸的苯環(huán)可供氫,而從表2中氨基酸分析結(jié)果來(lái)看,GPH、>10、5～10、3～5、<3 kDa組分的Tyr含量分別為5.47%、2.17%、2.27%、3%、3.49%,其中>10和5～10 kDa兩種組分的含量接近均偏低,這與Hernández等的發(fā)現(xiàn)吻合。

2.3.5 Fe2+螯合能力測(cè)定 過(guò)渡金屬離子Fe2+、Cu2+和Co2+可以作為電子供體,并與過(guò)氧化物迅速反應(yīng),形成烷氧自由基[34]。因此,螯合過(guò)渡金屬離子可以評(píng)估其抗氧化能力。此外,亞鐵離子可促進(jìn)脂質(zhì)氧化物的分解,進(jìn)而形成有活性的烷氧基和揮發(fā)性氧化產(chǎn)物,因此,螯合亞鐵離子可以抑制脂質(zhì)氧化。GPH和四種肽段與EDTA及亞鐵離子的螯合能力如圖5所示,同種樣品,隨著濃度的增加,亞鐵離子的螯合能力均逐漸增強(qiáng)。當(dāng)5 mg/mL濃度時(shí),除5～10 kDa組分外的其它所有組分與Fe2+螯合率均超過(guò)40%,并顯著低于EDTA與Fe2+的螯合能力(96.34%,1 mg/mL)。在3和5 mg/mL濃度下,>10 kDa組分均表現(xiàn)出最高的Fe2+螯合率。Ajibola等[35]研究非洲豆薯種子的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物也表現(xiàn)出相似的金屬螯合率。吳金鴻[36]以絲綢廢水中的絲膠為原料,水解得到三個(gè)抗氧化肽,發(fā)現(xiàn)特征肽段氨基酸組成中均含有氨基酸Lys和/或Pro,從氨基酸組成結(jié)果中發(fā)現(xiàn)>10 kDa組分中Lys含量最高(18.23%),<3 kDa組分中Pro含量最高(10.16%),這與>10 kDa組分具有最高的Fe2+螯合率一致。同時(shí),Saiga等[37]也通過(guò)研究證實(shí)亞鐵離子螯合與多肽中的特定氨基酸密切相關(guān)。

圖5 草魚(yú)皮蛋白水解液和不同分子量肽段組分的亞鐵離子清除能力Fig.5 Fe2+ chelating activities of GPH and different molecular weight peptide fractions

2.3.6 亞油酸體系測(cè)定抗氧化能力 脂質(zhì)氧化是多不飽和脂肪酸中的亞甲基碳自由基失去氫原子的過(guò)程。圖6表示相同濃度下(1 mg/mL)GPH和四種肽段組分在7 d中抑制亞油酸氧化的能力,并用空白組和天然抗氧化劑GSH(1 mg/mL)作對(duì)照。3和5 mg/mL濃度與1 mg/mL濃度抑制效果無(wú)顯著差異,因此僅采用1 mg/mL濃度下實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。圖6顯示空白組(無(wú)抗氧化劑)的吸光度在第3 d達(dá)到峰值為0.923,在3 d后呈下降趨勢(shì),這可能是由于亞油酸氧化產(chǎn)物的形成和分解[38]。較高的吸光度表示較高的氧化程度,然而各個(gè)組分具有較低的吸光度。因此,與空白組相比,四種組分在抑制亞油酸氧化方面均具有顯著作用(p<0.05),并且效果與GSH活性相似,四種組分抑制能力相當(dāng),均可作為本研究抑制亞油酸氧化,整體趨勢(shì)與Girgih等[39]從鮭魚(yú)肽得到的結(jié)果類似。Saito等[26]提出His對(duì)于亞油酸的過(guò)氧化有抑制作用,各組分含量均在2.5%左右,對(duì)于亞油酸氧化的抑制能力無(wú)顯著差異,可能是由于His可以作為電子受體,并接受不飽和脂肪酸在氧化過(guò)程中產(chǎn)生的自由電子,進(jìn)而可以抑制脂肪的氧化。

圖6 草魚(yú)皮蛋白水解液和不同分子量肽段組分的抑制油脂氧化能力Fig.6 Inhibition of lipid oxidation activities of GPH and different molecular weight peptide fractions

3 結(jié)論

草魚(yú)魚(yú)皮蛋白水解產(chǎn)物通過(guò)三種不同截留分子量的超濾膜,得到四種不同分子量的肽段組分,通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)它們?cè)隗w外具有不同的抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)表明,在大多數(shù)的體外測(cè)定實(shí)驗(yàn)中,低分子量的肽段較其它肽段組分具有顯著的抗氧化能力,尤其是5 mg/mL的<3 kDa肽段組分清除DPPH自由基效果顯著,清除率為70.14%,可作為功能性天然抗氧化劑添加到保健食品中;>10 kDa(5 mg/mL)肽段組分與Fe2+具有較強(qiáng)的螯合能力,可用于減少亞鐵離子引起的氧化;1 mg/mL的GPH和四種肽段組分均可用于亞油酸氧化抑制方面,便于緩解高脂食品的氧化。相比GSH,<3 kDa肽段組分在超氧陰離子、ABTS自由基清除能力方面還有不足,還需深入細(xì)化研究,因?yàn)榭寡趸钚詮?qiáng)弱與氨基酸的種類、組成、疏水性以及其在肽鏈中的位置排列有關(guān)。因此,下一步我們將對(duì)不同分子量的肽段進(jìn)行分離、純化鑒定,研究抗氧化肽的抗氧化具體機(jī)制,探索抗氧化肽的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,并將純抗氧化肽用于要求較高的醫(yī)療衛(wèi)生方面。

[1]Chalamaiah M,Dinesh,Kumar B,Hemalatha R,et al. Fish protein hydrolysates-Proximate composition,amino acid composition,antioxidant activities and applications-A review[J]. Food Chemistry,2012,135(4):3020-3038.

[2]Poole L B,Sch?neich C. Introduction-What we do and do not know regarding redox processes of thiols in signaling pathways[J]. Free Radical Biology and Medicine,2015,80:145-147.

[3]Sae-leaw T,O’callaghan Y C,Benjakul S,et al. Antioxidant,immunomodulatory and antiproliferative effects of gelatin hydrolysates from seabass(Latescalcarifer)skins[J]. International Journal of Food Science & Technology,2016,51(7):1545-1551.

[4]Hamed I,?zogul F,Regenstein J M. Industrial applications of crustacean by-products(chitin,chitosan,and chitooligosaccharides):A review[J]. Trends in Food Science & Technology,2016,48:40-50.

[5]Udenigwe C C,Aluko R E. Chemometric analysis of the amino acid requirements of antioxidant food protein hydrolysates[J]. International Journal of Molecular Sciences,2011,12(5):3148-3161.

[6]Nikoo M,Benjakul S. Potential application of seafood-derived peptides as bifunctional ingredients,antioxidant-cryoprotectant-A review[J]. Journal of Functional Foods,2015,19:753-764.

[7]Zhang Y,Liu W,Li G,et al. Isolation and partial characterization of pepsin-soluble collagen from the skin of grass carp(Ctenopharyngodon idella)[J]. Food Chemistry,2007,103(3):906-912.

[8]Ren J,Zhao M,Shi J,et al. Purification and identification of antioxidant peptides from grass carp muscle hydrolysates by consecutive chromatography and electrospray ionization-mass spectrometry[J]. Food Chemistry,2008,108(2):727-736.

[9]Liu D,Wei G,Li T,et al. Effects of alkaline pretreatments and acid extraction conditions on the acid-soluble collagen from grass carp(Ctenopharyngodon idella)skin[J]. Food chemistry,2015,172:836-843.

[10]Wasswa J,Tang J,Gu X,et al. Influence of the extent of enzymatic hydrolysis on the functional properties of protein hydrolysate from grass carp(Ctenopharyngodon idella)skin[J]. Food Chemistry,2007,104(4):1698-1704.

[11]Horwitz W. Official methods of analysis of the AOAC International[M]. Gaithersburg,MD,USA. The Association,2000.

[12]張華. 比目魚(yú)皮抗氧化肽的制備及分離純化[D]. 天津大學(xué),2013.

[13]Oyaizu M. Studies on products of browning reaction-antioxidative activity of products of browning reaction[J]. Japanese Journal of Nutrition,1986,44(6):307-315.

[14]Xie Z,Huang J,Xu X,et al. Antioxidant activity of peptides isolated from alfalfa leaf protein hydrolysate[J]. Food Chemistry,2008,111(2):370-376.

[15]Wiriyaphan C,Chitsomboon B,Yongsawadigul J. Antioxidant activity of protein hydrolysates derived from threadfin bream surimi byproducts[J]. Food Chemistry,2012,132(1):104-111.

[16]Decker E A,Welch B. Role of ferritin as a lipid oxidation catalyst in muscle food[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1990,38(3):674-677.

[17]Farvin K H S,Andersen L L,Nielsen H H,et al. Antioxidant activity of Cod(Gadus morhua)protein hydrolysates-Invitroassays and evaluation in 5% fish oil-in-water emulsion[J]. Food Chemistry,2014,149:326-334.

[18]王立峰,王玉梅,張晶,等. 菜籽蛋白水解物體外和細(xì)胞內(nèi)抗氧化性評(píng)價(jià)及氨基酸分析研究[J]. 食品科學(xué),2014(13):49-53.

[19]Gbogouri G A,Linder M,Fanni J,et al. Influence of hydrolysis degree on the functional properties of salmon byproducts hydrolysates[J]. Journal of Food Science,2004,69(8):C615-622.

[20]Shahidi F,Han X Q,Synowiecki J. Production and characteristics of protein hydrolysates from capelin(Mallotusvillosus)[J]. Food Chemistry,1995,53(3):285-293.

[21]Ktari N,Fakhfakh N,Balti R,et al. Effect of degree of hydrolysis and protease type on the antioxidant activity of protein hydrolysates from cuttlefish(Sepiaofficinalis)by-products[J].Journal of Aquatic Food Product Technology,2013,22(5):436-448.

[22]Elias R J,Kellerby S S,Decker E A. Antioxidant activity of proteins and peptides[J]. Critical Reviews of Food Science and Nutrition,2008,48:430-441.

[23]Guo H,Kouzuma Y,Yonekura M. Structures and properties of antioxidative peptides derived from royal jelly protein[J]. Food Chemistry,2009,113:238-245.

[24]Hernández L B,Dávalos A,Bartolomé B,et al. Preparation of antioxidant enzymatic hydrolysates fromα-lactalbumin andβ-lactoglobulin. Identification of active peptides by HPLC-MS/MS[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53(3):588-593.

[25]Segura-Campos M,Ruiz-Ruiz J,Chel-Guerrero L,et al. Antioxidant activity of Vigna unguiculata L. walp and hard-to-cookPhaseolusvulgarisL. protein hydrolysates[J]. CyTA-Journal of Food,2013,11(3):208-215.

[26]Saito K,Jin D H,Ogawa T,et al. Antioxidative properties of tripeptide libraries prepared by the combinatorial chemistry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003,51(12):3668-3674.

[27]張翀. 大黃魚(yú)蛋白源抗氧化肽的制備、性質(zhì)及抗氧化機(jī)理研究[D]. 福州:福建農(nóng)林大學(xué),2016.

[28]張榮華. 豬皮膠原蛋白酶解物的抗氧化特性研究[D]. 雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[29]Bougatef A,Nedjar-Arroume N,Manni L,et al. Purification and identification of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of sardinelle(Sardinellaaurita)by-products proteins[J]. Food Chemistry,2010,118(3):559-565.

[30]Wang X,Zheng X,Kopparapu N,et al. Purification and evaluation of a novel antioxidant peptide from corn protein hydrolysate[J]. Process Biochemistry,2014,49(9):1562-1569.

[31]Samak G,Shenoy R P,Manjunatha S M,et al. Superoxide and hydroxyl radical scavenging actions of botanical extracts of Wagatea spicata[J]. Food Chemistry,2009,115(2):631-634.

[32]Wang B,Li L,Chi C F,et al. Purification and characterisation of a novel antioxidant peptide derived from blue mussel(Mytilusedulis)protein hydrolysate[J]. Food Chemistry,2013,138(2):1713-1719.

[33]Cheung I W Y,Cheung L K Y,Tan N Y,et al. The role of molecular size in antioxidant activity of peptide fractions from Pacific hake(Merlucciusproductus)hydrolysates[J]. Food Chemistry,2012,134(3):1297-1306.

[34]Gordon M. Antioxidant in food[M]. New York-CRC Press,2001:7-21.

[35]Ajibola C F,Fashakin J B,Fagbemi T N,et al. Effect of peptide size on antioxidant properties of African yam bean seed(Sphenostylisstenocarpa)protein hydrolysate fractions[J]. International Journal of Molecular Sciences,2011,12(10):6685-6702.

[36]吳金鴻. 絲膠肽的制備及其生物活性功能和結(jié)構(gòu)的研究[D]. 無(wú)錫：江南大學(xué),2008.

[37]Saiga A I,Tanabe S,Nishimura T. Antioxidant activity of peptides obtained from porcine myofibrillar proteins by protease treatment[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003,51(12):3661-3667.

[38]Jayaprakasha G K,Singh R P,Sakariah K K. Antioxidant activity of grape seed(Vitisvinifera)extracts on peroxidation modelsinvitro[J]. Food Chemistry,2001,73(3):285-290.

[39]Girgih A T,Udenigwe C C,Hasan F M,et al. Antioxidant properties of Salmon(Salmosalar)protein hydrolysate and peptide fractions isolated by reverse-phase HPLC[J]. Food Research International,2013,52(1):315-322.

Evaluationoftheinvitroantioxidantpropertiesofdifferentmolecularweightpeptidefractionsfromgrasscarp(Ctenopharyngodonidella)skin

CAILu-yun1,2,LENGLi-ping1,LIXiu-xia1,LVYan-fang1,LIJian-rong1,2,*,ZHAOWei3,MAYong-jun4,SHENLin5

(1.College of Food Science and Engineering of Bohai University,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Food Safety Key Lab of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China; 2.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400716,China; 3.Dalian Tianbao Green Foods Co.,Ltd.,Dalian 116001,China; >4.Zhejiang Xingye Group Co.,Ltd.,Zhoushan 315200,China; 5.Dalian Donglin Food Co.,Ltd.,Dalian 116007,China)

Grass carp skins were hydrolyzed using alcalase to obtain crude protein hydrolysate,which was then fractionated by molecular mass into four fractions->10,5～10,3～5,and<3 kDa.Invitroantioxidant activities of the crude hydrolysate and its fractions were studied. Results indicated that the 3～5 and<3 kDa fractions were significantly(p<0.05)higher in scavenging 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)and 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)diammonium salt radicals(ABTS)than crude hydrolysate or other fractions,while the>10 kDa fraction had the highest Fe2+chelating activity. However,the>10,5～10,and 3～5 kDa fractions were weaker superoxide radical scavengers compared with reduced L-glutathione. The amino acid sequences of the peptide fractions might play a crucial role in their antioxidant activities. These results indicate that the<3 kDa fraction has the potential to be used as a natural antioxidant in health food.

Ctenopharyngodonidella;fish skin;hydrolysate;antioxidant activity;different molecular weight peptides fraction

2016-11-23

蔡路昀(1981-)，男，博士，副教授，主要從事水產(chǎn)品貯藏加工和功能食品方面的研究，E-mail:clyun2007@163.com。

*通訊作者:勵(lì)建榮(1964-)，男，博士，教授，主要從事水產(chǎn)品和果蔬貯藏加工及質(zhì)量安全控制方面的研究，E-mail:li34008@126.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31401478)；中國(guó)博士后基金面上項(xiàng)目(2015M570760)；遼寧省自然科學(xué)基金(20170540006)；重慶市博士后特別資助項(xiàng)目(Xm2015021)。

TS254.1

:A

:1002-0306(2017)12-0058-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.011