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(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，軍事獸醫(yī)研究所,省部共建吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林長春 130122; 3.溫州大學(xué)病毒病研究所,浙江溫州 325035)

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乳酸菌破壁方法的比較研究

潘榮榮1,2,王茂鵬2,+,李昌2,3,邸洋2,榮鳳君2,杜壽文2,朱羿龍2,劉立明3,朱國強(qiáng)1,*,金寧一2,3,*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，軍事獸醫(yī)研究所,省部共建吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林長春 130122; 3.溫州大學(xué)病毒病研究所,浙江溫州 325035)

本實(shí)驗(yàn)旨在探索一種快速、高效、經(jīng)濟(jì)的乳酸菌破壁方法。通過甘氨酸破壁法、反復(fù)凍融破壁法、溶菌酶破壁法、氧化鋯珠破壁法、超聲波破壁法以及3種復(fù)合破壁法對植物乳桿菌Lactobacillus.plantarum1.557進(jìn)行破壁處理,并以革蘭氏染色和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)為評價(jià)方法,比較破壁效果和破壁時(shí)間的差異。此外,通過β-葡萄糖醛酸酶(GUS)活力的測定對氧化鋯珠破壁法所提蛋白進(jìn)行活性檢測,通過瓊脂糖凝膠電泳對氧化鋯珠破壁法所提RNA的質(zhì)量進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明:氧化鋯珠破壁法優(yōu)勝于其他幾種處理方法,該法所提取的 GUS蛋白具有蛋白活性,提取的RNA的OD260/OD280的比值在1.8～2.1 之間,符合標(biāo)準(zhǔn)的比值,純度較高,降解程度低。因此,氧化鋯珠破壁法適用于快速提取乳酸菌菌體蛋白和總RNA,它是一種快速、高效、經(jīng)濟(jì)的乳酸菌破壁方法。

乳酸菌,破壁方法,氧化鋯珠,蛋白提取,RNA提取

乳酸菌是一類重要的工業(yè)菌株,被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵,有著重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其合成代謝產(chǎn)物具有降膽固醇、降血壓、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫等作用[1]。近年來,利用乳酸菌系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白也已引起廣泛關(guān)注,但由于乳酸菌屬于革蘭氏陽性菌,具有厚而致密的剛性細(xì)胞壁,致使乳酸菌內(nèi)源蛋白、表達(dá)的非分泌性外源蛋白以及其他非分泌性代謝產(chǎn)物的提取效率極低[1-2]。因此,研究乳酸菌破壁方法以提高乳酸菌蛋白以及各種代謝產(chǎn)物的獲得率具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。

細(xì)胞破壁方法很多,如:化學(xué)法,如酸熱法、化學(xué)滲透法;物理法,如反復(fù)凍融法、超聲破壁法、機(jī)械法和微波法等;生物法,如酶溶法等,各有優(yōu)缺點(diǎn)[3]。我們需要根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇合適的破壁方法[4]。目前,國內(nèi)外系統(tǒng)地研究乳酸菌破壁方法的報(bào)道較少,而利用不同的破壁方法相互疊加對乳酸菌進(jìn)行復(fù)合處理的研究尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道,該研究以期為乳酸菌內(nèi)源蛋白、表達(dá)的外源蛋白以及多種代謝產(chǎn)物的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

菌株Lactobacillus.plantarum1.557 本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒pSIP411 山東大學(xué)祁慶生教授惠贈(zèng);MRS培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;甘氨酸 Promega公司;溶菌酶 購自北京索萊寶科技有限公司;革蘭氏染色液 購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;Trizol 購自Invitrogen公司;RIPA裂解液(強(qiáng))P0013 購自碧云天公司;4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷(4-NPG) 購自上海寶曼生物科技有限公司。

超聲波破碎儀 寧波新芝科器研究所;MCO-18M型CO2恒溫培養(yǎng)箱 日本 SANYO公司;5417R小型臺式高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司;Tissue Lyser II組織研磨儀 QIAGEN公司;0.1 μm氧化鋯珠 河源帝諾新材料有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)與收集 將L.plantarum1.557 MRS平板培養(yǎng)基上新鮮活化的單菌落挑至5 mL MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃靜置培養(yǎng)過夜。12000 r/min,離心1 min,收集菌體。用1 mL預(yù)冷的洗滌液(100 mmol/L磷酸緩沖液,10 mmol/L EDTA)洗滌菌體,洗滌3次,再用PBS洗滌3次,離心,收集菌體。

1.2.2 氧化鋯珠的前處理 用5.8 mol/L HCl覆蓋氧化鋯磨介,室溫振蕩處理過夜。棄上清,加入滅菌水清洗(每次清洗都要反復(fù)振蕩),共洗10次。最后,放入平皿中鋪散開,75 ℃烘干備用[5]。

1.2.3 乳酸菌的破壁處理

1.2.3.1 氧化鋯珠破壁法 用1.5 mL離心管稱取0.013 g左右的菌體,加入300 μL預(yù)冷的RIPA裂解液并重懸菌體,再加入1 g左右預(yù)冷的氧化鋯珠。放入組織研磨儀中振蕩研磨(振蕩頻率為每秒30次)研磨15 min。研磨結(jié)束后,用1 mL注射器在研磨后的離心管底部扎一個(gè)小孔,并將扎孔的離心管立即放入另一新的預(yù)冷的1.5 mL離心管,4 ℃,5000 r/min,離心5 min,收集研磨后的蛋白上清和菌體[5]。

1.2.3.2 低功率(400 W)超聲波破壁法 用1.5 mL離心管稱取2管相同重量(0.01 g左右)的菌體,加入300 μL預(yù)冷的RIPA裂解液并重懸菌體。在冰浴條件下分別超聲破碎30 min和1 h(功率400 W,工作30 s,間隔30 s)。超聲結(jié)束后,4 ℃,12000 r/min,離心5 min,收集超聲后的蛋白上清和菌體[3-4]。

1.2.3.3 大功率(1500 W)超聲波破壁法 用1.5 mL離心管稱取2管相同重量(0.01 g左右)的菌體,加入300 μL預(yù)冷的RIPA裂解液并重懸菌體。在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎20 min(功率1500 W,工作5 s,間隔9 s)。超聲結(jié)束后,4 ℃,12000 r/min,離心5 min,收集超聲后的蛋白上清和菌體[3-4]。

1.2.3.4 反復(fù)凍融破壁法 用1.5 mL離心管稱取重量為0.013 g左右的菌體,加入300 μL預(yù)冷的RIPA裂解液并重懸菌體。于液氮中反復(fù)凍融3次,每次冷凍時(shí)間20 min,37 ℃水浴中解凍20 min[6-7]。

1.2.3.5 溶菌酶破壁法 用1.5 mL離心管稱取重量為0.013 g左右的菌體,將菌體重懸于300 μL含溶菌酶(10 mg/mL)的PBS(pH8.0)。在37 ℃水浴中處理30 min,處理結(jié)束后,12000 r/min,離心5 min,收集溶菌酶處理后的蛋白上清和菌體[8-9]。

1.2.3.6 甘氨酸破壁法 將L.plantarum1.557 MRS平板培養(yǎng)基上新鮮活化的單菌落挑至5 mL含2%甘氨酸的MRS培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)過夜。然后,按照方法1.2.1收集菌體。

1.2.3.7 凍融-研磨復(fù)合破壁法 用1.5 mL離心管稱取2管相同重量(0.013 g左右)的菌體。然后,按照方法1.2.3.4反復(fù)凍融菌體3次,解凍后,直接加入1 g左右預(yù)冷的氧化鋯珠,放入組織研磨儀中振蕩研磨(振蕩頻率為每秒30次),分別在研磨5 min后,10 min后取出一管,置于冰上。然后,用1 mL注射器在研磨后的離心管底部扎一個(gè)小孔,并將扎孔的離心管立即放入另一新的預(yù)冷的1.5 mL離心管,4 ℃,5000 r/min,離心5 min,收集研磨后的蛋白上清。

1.2.3.8 溶菌酶-研磨復(fù)合破壁法 用1.5 mL離心管稱取2管相同重量(0.013 g左右)的菌體。然后,按照方法1.2.3.5 用溶菌酶處理菌體30 min,處理結(jié)束后,分別直接加入1 g左右預(yù)冷的氧化鋯珠,接下來按照方法1.2.3.7進(jìn)行氧化鋯珠研磨和收集研磨后的蛋白上清。

1.2.3.9 甘氨酸-研磨復(fù)合破壁法 按照方法1.2.3.6用2%甘氨酸處理菌株并收集處理后的菌體。用1.5 mL離心管稱取2管相同重量(0.013 g左右)的菌體,分別加入300 μL預(yù)冷的RIPA裂解液并重懸菌體,再分別加入1 g預(yù)冷的氧化鋯珠。接下來按照方法1.2.3.7進(jìn)行氧化鋯珠研磨和收集研磨后上清。

1.2.4 革蘭氏染色 對分別經(jīng)氧化鋯珠破碎、超聲破碎、反復(fù)凍融、溶菌酶處理、甘氨酸處理的菌體進(jìn)行革蘭氏染色,按照革蘭氏染色液試劑盒說明書來進(jìn)行操作。

1.2.5 SDS-PAGE分析 從收集的蛋白上清中各取50 μL,直接加入12.5 μL 5×SDS 樣品緩沖液,充分混勻,煮沸5 min,各取15 μL煮沸后樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

1.2.6 GUS酶活力的測定 將菌株L.plantarum1.557(已電轉(zhuǎn)入了質(zhì)粒pSIP411)在MRS平板培養(yǎng)基上活化后的單菌落挑至5 mL MRS 液體培養(yǎng)基,37 ℃靜置過夜培養(yǎng)。以1%(V/V)的接種量轉(zhuǎn)接到6 mL MRS 液體培養(yǎng)基(紅霉素15 μg/mL)中,37 ℃靜置培養(yǎng)4 h(OD=0.3左右)。培養(yǎng)4 h后,取出3 mL菌液加入誘導(dǎo)劑 SppIP(100 ng/mL),剩余3 mL菌液不加誘導(dǎo)劑作為對照。然后,繼續(xù)培養(yǎng)6 h。按照方法1.2.1和1.2.3.1進(jìn)行菌體和蛋白上清的收集。取誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的研磨上清各50 μL,分別加入500 μL含1.25 μmol/L 4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷(4-NPG)的GUS Buffer(pH=7 50 mmol/L磷酸緩沖液10 mmol/Lβ-巰基乙醇1 mmol/L EDTA 0.1% TritonX-100，37 ℃溫育,觀察顏色變化[10]。

1.2.7 乳酸菌RNA的提取 用1.5 mL離心管稱取6管相同重量(0.01 g左右)的菌體,分別加入300 μL預(yù)冷的Trizol并重懸菌體,再分別加入1 g左右預(yù)冷的氧化鋯珠。然后,將其中的5管放入組織研磨儀中振蕩研磨(振蕩頻率為每秒30次),另外1管不研磨作為對照。然后,分別在研磨5、10、15、20 min后取出一管,置于冰上。接下來按照方法1.2.3.1收集菌體碎片和上清,用上清重懸菌體碎片后,接下來按照Trizol總RNA提取法進(jìn)行RNA的提取并用NanoDrop 2000紫外分光光度儀測定RNA濃度。

圖2 L.plantarum 1.557不同破壁方法SDS-PAGE效果圖Fig.2 SDS-PAGE renderings of different wall-breaking method

2 結(jié)果與分析

2.1幾種單純破壁方法的分析比較

2.1.1 幾種單純破壁方法革蘭氏染色效果的分析比較 由圖1可知,甘氨酸破壁法(A、B)、反復(fù)凍融破壁法(E、F)僅可使菌壁受到一定程度破壞(破壁處理后,革蘭氏染色菌體變紅),但無法破壞整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu),菌體蛋白無法釋放。低功率(400 W)超聲波破壁法(I、K)在超聲30 min后,細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍比較完整,菌體破碎不完全,需要較長時(shí)間(1 h左右)才可破壞整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。而氧化鋯珠破壁法(G、H)、大功率(1500 W)超聲波破壁法(L、M)、溶菌酶破壁法(C、D)這三種方法都可在較短時(shí)間內(nèi)(15～30 min)破壞完整細(xì)胞結(jié)構(gòu),使菌體蛋白得到釋放。

圖1 不同破壁方法革蘭氏染色效果圖(100×)Fig.1 gram renderings of differentwall-breaking method(100×)注:A、B為甘氨酸處理結(jié)果,A未處理,B處理后;C、D為溶菌酶處理結(jié)果,C未處理,D處理30 min后;E、F為反復(fù)凍融結(jié)果,E未處理,F反復(fù)凍融后;G、H為鋯珠研磨結(jié)果,G未處理,H鋯珠研磨15 min后;I～K為低功率(400 W)超聲處理結(jié)果,I未處理,J超聲30 min后,K超聲1 h后;L～M為大功率(1500 W)超聲處理結(jié)果,L未處理,M超聲20 min后。

2.1.2 幾種單純破壁方法 SDS-PAGE效果的分析比較 由圖1可知,甘氨酸破壁法和反復(fù)凍融破壁法無法有效破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),菌體蛋白釋放不完全。因此,我們只對溶菌酶破壁法、氧化鋯珠破壁法、超聲波破壁法進(jìn)行了SDS-PAGE分析。由圖2可知,溶菌酶雖然可以破壞菌體完整細(xì)胞結(jié)構(gòu),但PAGE條帶的數(shù)目卻缺少許多,說明仍有許多菌體蛋白沒有釋放到上清中。大功率(1500 W)超聲波破壁法和低功率(400 W)超聲波破壁法的PAGE圖片條帶數(shù)目少且清晰度差,說明菌體蛋白收獲不完全。氧化鋯珠破壁法的PAGE圖片條帶數(shù)目多且清晰度高,說明菌體蛋白收獲較完全。

2.2幾種復(fù)合破壁方法的分析比較

由圖1、圖2可知,上述幾種破壁方法對乳酸菌的菌壁均有一定程度的破壞作用,為了進(jìn)一步提高其破壁效率,又將不同的破壁方法相疊加對乳酸菌進(jìn)行復(fù)合處理。由圖3可知,菌體不經(jīng)任何處理,加入RIPA后直接鋯珠研磨(單純氧化鋯珠破壁法),在研磨5 min后,PAGE條帶數(shù)少很多(尤其30 kD以下),研磨不充分,但在研磨10 min后,PAGE條帶數(shù)多且清晰度高,說明菌體蛋白收獲較完全。對于幾種復(fù)合處理方法,只有甘氨酸-研磨復(fù)合破壁法,在研磨5 min后,就達(dá)到了單純氧化鋯珠破壁法研磨10 min的效果,在破壁時(shí)間上略有縮短。而溶菌酶-研磨復(fù)合破壁法,在研磨5 min和10 min后,在30 kD以下的PAGE條帶數(shù)少很多且清晰度差,研磨效果不如單純氧化鋯珠破壁法。對于反復(fù)凍融-研磨復(fù)合破壁法,在破壁效果及破壁時(shí)間上也沒有明顯的優(yōu)勢。

圖3 復(fù)合破壁法 SDS-PAGE效果圖Fig.3 SDS-PAGE rendering of compound wall-breaking method注:1、2:經(jīng)溶菌酶處理后,氧化鋯珠分別研磨5、10 min;3、4:經(jīng)反復(fù)凍融三次后,氧化鋯珠分別研磨5、10 min;5、6:經(jīng)2%甘氨酸處理后,氧化鋯珠分別研磨5、10 min;7、8:未經(jīng)任何處理,加入RIPA后,直接研磨5,10、min;9:溶菌酶處理30 min后,離心取上清,直接跑SDS-PAGE;M:(14～100 kDa)Protein Marker。

因此,綜合考慮成本問題、操作的簡捷性以及工藝放大的可行性,單純氧化鋯珠破壁法是一種適用于乳酸菌破壁的快速、高效、經(jīng)濟(jì)的破壁方法。

2.3氧化鋯珠破壁法提取蛋白的活性檢測

從上述革蘭氏染色以及SDS-PAGE結(jié)果可知,對于乳酸菌的破壁,鋯珠破壁法要優(yōu)于其他幾種處理方法,但考慮到此法所提蛋白的活性問題,接下來又通過GUS酶活力的測定對所提蛋白的活性進(jìn)行了定性檢測。若以pSIP411為載體表達(dá)外源蛋白并通過鋯珠破壁法提取,則GUS酶活力檢測實(shí)驗(yàn)可在檢測所提蛋白活性的同時(shí)檢測外源蛋白在乳酸菌中是否表達(dá)。如圖4所示,加入底物4-NPG后,誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生 GUS酶的那一管(左)溶液變黃,而未誘導(dǎo)(右)的則不變黃,說明質(zhì)粒pSIP411在菌株L.plantarum1.557中正常表達(dá)了 GUS酶,且經(jīng)氧化鋯珠研磨提取后仍具有酶活性。說明此方法在蛋白提取過程中未破壞蛋白活性。

圖4 蛋白活性檢測Fig.4 The detection of protein activity注:1:提取的蛋白上清(誘導(dǎo)6 h)； 2:提取的蛋白上清(未誘導(dǎo))。

2.4氧化鋯珠破壁法在RNA提取方面的應(yīng)用

菌壁破碎后,不僅可以釋放出內(nèi)源性蛋白,同樣也可以釋放出核酸以及其他代謝產(chǎn)物。以RNA的提取為例,RNA容易降解,所以提取要迅速。圖5中可看出，菌株經(jīng)鋯珠研磨5 min后,即可提出較高濃度的RNA,且該法所提取的RNA的OD260/OD280的比值在1.8～2.1之間,符合標(biāo)準(zhǔn)的比值,純度較高,降解程度低,能夠繼續(xù)應(yīng)用于后續(xù)的RT-PCR等實(shí)驗(yàn)。因此,氧化鋯珠破壁法也是一種快速、高效提取乳酸菌RNA的方法。

圖5 RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.5 RNA agarose gel electrophoresis注:研磨時(shí)間(RNA濃度,OD260 nm/OD280 nm);1～5:0 min(49 ng/μL,1.75)、5 min(1904.3 ng/μL,2.06)、10 min(3459 ng/μL,2.01)、15 min(3636.8 ng/μL,2.07)、20 min(3741.4 ng/μL,2.08)。

3 討論與結(jié)論

細(xì)胞破壁的方法很多,需要根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇合適的破壁方法。乳酸菌屬于革蘭氏陽性菌,細(xì)胞壁具有很厚的肽聚糖成分,破壁較為困難。溶菌酶可以通過分解肽聚糖中的β-1,4-葡萄糖苷鍵來破壞菌壁,甘氨酸可以通過取代肽聚糖中N-乙酰胞壁酸短肽上的L-丙氨酸和D-丙氨酸來破壞菌壁[2,4]。超聲波可以通過空化效應(yīng)引起的沖擊波和剪切力使細(xì)胞破碎,反復(fù)凍融法是利用凍融過程中內(nèi)部形成的冰晶體對細(xì)胞壁的機(jī)械作用使細(xì)胞破碎[3,6]。氧化鋯珠法是借助研磨中鋯珠與細(xì)胞的切力及碰撞作用來破碎細(xì)胞。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇上述5種方法對乳酸菌進(jìn)行破壁處理。

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)上述5種方法對于乳酸菌的破壁均具有一定程度的破壞作用,但一些具有明顯的局限性。甘氨酸破壁法不能達(dá)到充分破除菌壁的目的,僅能在菌體復(fù)制時(shí)才起到破壞作用。反復(fù)凍融法需要反復(fù)操作,耗時(shí)較大,且不能充分破除乳酸菌菌壁[6-7]。酶法破壁相對成本較高,且常常存在產(chǎn)物抑制[8,11],菌體蛋白釋放不完全。低功率超聲波短時(shí)間內(nèi)不能達(dá)到充分破除乳酸菌菌壁的目的,而大功率超聲波容易產(chǎn)生局部高溫,散熱困難,噪音也比較大[4,11]。目前,只有氧化鋯珠破壁法能有效避免上述問題。

因此,為了獲得更好的效果,我們將氧化鋯珠破壁法與其他破壁方法相疊加對乳酸菌進(jìn)行復(fù)合處理,從研究結(jié)果來看,與單純氧化鋯珠破壁法相比,在破壁效果及破壁時(shí)間上沒有明顯的優(yōu)勢。而氧化鋯珠破壁法可以在短時(shí)間內(nèi)破碎裂解樣品且研磨過程中產(chǎn)生的熱量少,可以最大限度的避免核酸的降解和蛋白的變性。

綜上,氧化鋯珠破壁法具有以下優(yōu)勢:氧化鋯珠低磨耗,高硬度,可重復(fù)利用的特點(diǎn)降低了研磨成本[12-13]?？煽焖偻瑫r(shí)處理多個(gè)樣品,具有高通量的特性。研磨時(shí)間短,只需要10～15 min,有效保護(hù)蛋白活性。破壁效果充分,操作簡便。所以,氧化鋯珠破壁法是一種適用于乳酸菌破壁的快速、高效、經(jīng)濟(jì)、高通量的破壁方法。

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Comparisionresearchonthecellwall-breakingmethodsoflacticacidbacteria

PANRong-rong1,2,WANGMao-peng2,+,LIChang2,3,DIYang2,RONGFeng-jun2,DUShou-wen2,ZHUYi-long2,LIULi-ming3,ZHUGuo-qiang1，*,JINNing-yi2,3,*

(1.College of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China; 2.Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Jilin Province,Institute of Military Veterinary,Academy of Military Medical Sciences,Changchun 130122,China; 3. Institute of Viral Diseases,Wenzhou University,Wenzhou 325035,China)

This study aims to explore a rapid,efficient and economical method for breaking lactic acid bacteria cell wall. Five different methods including glycine treatment,repeated freezing and thawing,lysozyme digestion,zirconia beads disruption,ultrasonic treatment and three composite wall-breaking methods were used to treatLactobacillus.plantarum1.557 cells,respectively. And gram staining and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)were used as evaluation method to analyze the difference of cell wall-breaking effects and time costs. In addition,the activity of protein extracted by zirconia beads method was tested by theβ-glucuronidase(GUS)assays. The quality of RNA extracted by zirconia beads method was tested by agarose gel electrophoresis. Results showed that zirconia beads method was better than other methods,the GUS protein extracted by this method had the activity of protein. The OD260/OD280ratio of RNA extracted by this method was between 1.8 and 2.1,which was in accordance with the standard ratio,and the purity was high and the degradation degree was low. Therefore,the zirconia beads method was a fast,efficient and economical method for rapid extraction of lactic acid bacteria bacterial protein and total RNA.

lactic acid bacteria;cell wall-breaking method;zirconia beads;protein extraction;RNA extraction

2016-11-04 +并列第一作者

潘榮榮(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)免疫學(xué)，E-mail：2281078335@qq.com。 王茂鵬(1987-)，男，博士，研究方向：分子免疫學(xué)，E-mail：wangmaopeng@126.com。

*通訊作者:朱國強(qiáng)(1964-)，男，博士，研究方向：(病原)微生物和(動(dòng)物)機(jī)體的相互作用的分子機(jī)理，E-mail ：yzgqzhu@yzu.edu.cn。 金寧一(1956-)，男，博士，研究方向：分子病毒學(xué)與免疫學(xué)，E-mail ：ningyik@126.com。

國家自然科學(xué)基金(31472197)；病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(SKLPBS1435)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)12-0034-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.007