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(1.三明出入境檢驗檢疫局,福建三明 365000; 2.寧德出入境檢驗檢疫局,福建寧德 352000)

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唐慶強1,陳澤宇1,陳舒奕2,張信仁1,程立軍1,張云1

(1.三明出入境檢驗檢疫局,福建三明 365000; 2.寧德出入境檢驗檢疫局,福建寧德 352000)

采用高效液相色譜(HPLC)和電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)聯用測定香菇及香菇培養(yǎng)料中亞砷酸鹽As(Ⅲ)、砷酸鹽As(Ⅴ)、一甲基砷酸鹽(MMA)、二甲基砷酸鹽(DMA)和砷甜菜堿(AsB)等5種砷元素化合物。樣品經70 ℃超聲萃取,陰離子色譜柱分離,ICP-MS檢測,5種不同形態(tài)的砷分離效果良好,線性范圍0～100.0 ng/mL,相關系數在0.9999以上,加標回收率81.0%～108.9%之間,相對偏差1.6%～6.3%(n=6)。用實際樣品檢測,培養(yǎng)料中的砷元素主要以As(V)的形式存在,其含量與栽培時間關系不大。鮮香菇和干香菇中則含有較多的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和AsB,雖然總砷結果符合國標限量要求,但高毒的無機砷占大多數。

高效液相色譜聯用電感耦合等離子體質譜(HPLC-ICP-MS)，香菇，培養(yǎng)料，砷，形態(tài)分析

香菇是一種味道鮮美且富含香菇多糖、香菇嘌呤、核酸、麥角甾醇等生理活性成分的食用菌。研究表明,經常食用香菇能夠增加人體免疫力,還具有防癌抗癌、降低血壓和膽固醇的作用[1]。種植香菇的栽培基質主要是木屑、棉籽殼、玉米芯、秸桿、麥麩等農林副產品,同時需要加入一定量的石灰、石膏、過磷酸鈣等添加劑,木本植物對重金屬有一定的吸收積累、轉化作用,使其不能短期釋放到環(huán)境中。有研究表明,香菇在生長過程中會轉化和富集培養(yǎng)基中的重金屬[2]。近年來關于香菇中檢出砷元素的報道不斷增加,如王玥龍[3]測定了大慶地區(qū)的鮮香菇中的砷,其總砷含量范圍為0.150～0.445 mg/kg,高于黑木耳、干黃蘑和干榛蘑。鄭偉華等[4]測定了烏魯木齊地區(qū)多種食用菌中的砷,含量范圍為4.6×10-4～0.42 mg/kg,檢出率為100%。胡桂仙等[5]測定了浙江省香菇中的砷,干制香菇中總砷的含量范圍為0.150～0.950 mg/kg,同時測定的黑木耳和銀耳。

砷的化合物形態(tài)主要包括有機砷和無機砷兩大類,無機砷包括亞砷酸鹽(As(Ⅲ))和砷酸鹽(As(Ⅴ)),有機砷包括一甲基砷酸鹽(MMA)、二甲基砷酸鹽(DMA)、砷甜菜堿(AsB)、砷膽堿和砷糖等[6]。不同形態(tài)的砷毒性差異很大,砷糖、砷甜菜堿等有機砷幾乎沒有毒性,而無機砷的毒性卻很高。國際癌癥研究中心已將無機砷及其化合物確認為I級致癌物質,并將一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA)列為潛在的致癌物質[7-8]。

目前國內外常采用高效液相色譜(HPLC)聯用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)[9-10]、原子熒光光譜(AFS)[11-12]等方法分析不同形態(tài)的砷化合物。液相色譜聯用氫化物發(fā)生-原子熒光法(HPLC-AFS)雖然較為常用,但分析結果最全面可靠的是液相色譜串聯有機質譜法(HPLC-ICP-MS)[13]。本實驗結合國內外文獻報道,探討使用高效液相色譜聯用電感耦合等離子體質譜法,檢測香菇及其培養(yǎng)料中多種砷形態(tài)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

Altus A-10型高效液相色譜儀 美國PerkinElmer公司;NexION 300D型電感耦合等離子體質譜儀 美國PerkinElmer公司;3-18K高速離心機 德國Sigma公司;VERSASTAR型酸度計 美國Thermo公司;M S 3D S25型渦旋儀 德國IKA公司。

1.2液相色譜及ICP-MS條件

色譜柱:Dionex IonPac AS19(250 mm×4.0 mm)陰離子交換柱;Dionex IonPac AS19(50 mm×4.0 mm)陰離子保護柱;流動相:A相(10 mmol/L乙酸鈉,3 mmol/L硝酸鉀,2 mmol/L磷酸二氫鈉,0.2 mmol/L乙二胺四乙酸鐵鈉(EDTA),用氨水調節(jié)pH至10.7),B相(無水乙醇):A+B=99+1。流速:1.0 mL/min;進樣量:50 μL;ICP-MS功率:1350 W;高純氬氣為載氣;泵速20 r/min;駐留時間:1000 ms;采集質量數m/z=75;采集模式:標準模式。

1.3樣品處理

稱取4.0 g香菇或香菇培養(yǎng)料,加入38 mL純水,渦旋混勻后,在70 ℃水浴中超聲提取40 min,加入2 mL 3%乙酸溶液沉淀蛋白,于冰箱中4 ℃靜置10 min,于4 ℃高速離心機中以18000 r/min離心5 min,取上清液過0.22 μm水系濾膜后上機測定。

1.4數據處理

用Empower3軟件處理檢測結果和數據,外標法定量。

2 結果與討論

2.1流動相選擇

文獻中有使用碳酸銨[14]、磷酸氫二銨+硝酸銨[15]、碳酸鈉+乙酸鈉[16]等作為流動相,考慮到砷的化合物多是以離子形式存在,并且常用磷酸鹽作為陰離子淋洗液,故選用磷酸二氫鈉作為流動相,乙酸鈉能改善AsB、DMA和As(Ⅲ)的分離度,并加入EDTA保護陰離子色譜柱。香菇培養(yǎng)料主要包括雜木、石膏等物質,含有較高的氯化物,加入硝酸鉀能改變氯離子的出峰時間,避免對As造成干擾。同時,有文獻記載[17]加入乙醇后測試的靈敏度可增高,因此在流動相中加入1%的乙醇,并調節(jié)pH改變各種形態(tài)砷在陰離子柱上的保留時間來達到良好的分離效果。通過對以上影響因素的分析并參考相關文獻[18-19],選取2 mmol/L磷酸二氫鈉+0.2 mmol/L乙二胺四乙酸鐵鈉+10 mmol/L乙酸鈉+3 mmol/L硝酸鉀+1%乙醇為流動相,調節(jié)pH=10.7。圖1為選用該流動相的5種形態(tài)砷標準品(2.5 μg/L)的色譜圖,從圖1中可見,5種形態(tài)砷的分離度均大于1.5,保留時間在11 min之內。

圖1 5種形態(tài)砷標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of five arsenic species

2.2提取條件的優(yōu)化

文獻中對形態(tài)砷的提取有采用酸、水、甲醇-水和其他溶劑的,提取方式則包括濕法消解法、微波消解法、水浴提取法和超聲萃取法等[6-14],研究表明,單獨進行無機砷測定時常使用濃硝酸等強酸消化富集,要測定更多不同形態(tài)砷化合物時大多采用甲醇-水作為提取液,但甲醇雖然對有機砷的提取有益,但也會抑制無機砷的萃取效率。陳晞[15]等對比了鹽酸提取、沸水提取和超聲提取3種處理方式,劉崴[19]等研究了60、70、95和150 ℃下的不同提取條件,結果表明,酸提取會造成基線漂移和極寬的干擾峰,沸水提取回收率較低,60～70 ℃為較理想的提取溫度,因此,本實驗使用70 ℃條件下超聲萃取的提取方式,采用加標回收測試的結果表明,該提取條件下方法回收率在81.0%～108.9%,提取效果較為理想。

2.3 ICP-MS條件優(yōu)化

檢測前,使用1.0 mg/L的Be、Mg、In、U、Ce混合調諧液對ICP-MS進行調諧,調整載氣流速、采樣深度、炬管位置、透鏡參數等至最佳狀態(tài),使調諧后的儀器靈敏度達到中質量數(In114.904)≥40000,同時氧化物CeO/Ce<3%,雙電荷產率Ce2+/Ce+<3%。

2.4線性范圍和檢出限

對濃度分別為0.0、2.5、5.0、10.0、50.0、100.0 ng/mL的5種形態(tài)砷混合標準溶液進樣分析,以峰面積對濃度計算線性回歸。結果表明,在該濃度范圍內,5種形態(tài)砷線性范圍良好,線性相關系數r>0.9999。對標準溶液進行逐級稀釋,以信噪比(S/N)為10∶1時所對應的濃度及樣品前處理最大稀釋倍數計算定量檢測限,結果見表1。

表1 5種形態(tài)砷的線性回歸方程及相關系數Table 1 Linear regression equations and correlation coefficients of 5 arsenic species

2.5回收率與精密度

在干香菇、鮮香菇樣品和香菇培養(yǎng)料樣品上進行加標回收率實驗,根據稱樣量分別加入相當于10.0、20.0和30.0 μg/kg質量濃度的形態(tài)砷標準溶液,按本文方法測定,重復進樣6次,扣除樣品空白后計算回收率和精密度,結果見表2。方法的回收率在81.0%～108.9%,精密度在1.6%～6.3%之間。

2.6實際樣品檢測

圖2 培養(yǎng)料樣品(a)、鮮香菇樣品(b)和干香菇樣品(c)的HPLC-ICP-MS色譜圖Fig.2 HPLC-ICP-MS chromatograms of the culture medium sample(a),fresh Lentinus edodes sample(b) and dried Lentinus edodes sample(c)

從香菇種植基地選取接種2、60、99 d的香菇培養(yǎng)料和從市場上購買的3批鮮香菇、5批干香菇樣品,按所建立的檢測方法考察其中的形態(tài)砷分布情況,分析結果的色譜圖如圖2所示。在干香菇和鮮香菇中均檢出了5種形態(tài)砷化合物,但MMA含量較低,在香菇培養(yǎng)料中檢出As(Ⅴ),并檢出少量As(Ⅲ)和AsB,測定結果見表3。結果表明,培養(yǎng)料中的砷元素主要以As(Ⅴ)的形式存在,鮮香菇和干香菇中則含有較多的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和AsB,而無論在培養(yǎng)料還是香菇中,MMA檢出率都最低,表明香菇及培養(yǎng)料中的MMA不穩(wěn)定或易被分解。從砷元素的分布情況來看,培養(yǎng)料中只檢出As(Ⅴ),而接種后栽培時間的延長對其含量影響不大。干香菇中含量最高的砷化合物是As(Ⅲ),其次是AsB,分別占到全部形態(tài)砷元素的42.0%～57.0%和15.5%～26.8%。鮮香菇中含量最高的分別是As(Ⅲ)和As(Ⅴ),占比達到全部形態(tài)砷元素的32.0%～38.2%和25.4%～37.2%。從檢測結果來看,雖然干香菇和鮮香菇樣品中的砷元素檢測結果滿足GB 2762-2012[20]標準中總砷小于0.5 mg/kg(食用菌及其制品)和GB 7096-2003[21]中干食用菌總砷小于1.0 mg/kg，鮮食用菌總砷小于0.5 mg/kg的限量要求,但高毒無機砷的含量整體高于低毒的有機砷,在食品安全上也應引起關注。

表3 實際樣品檢測結果(μg/kg)Table 3 Analytical results of samples(μg/kg)

注:LOQ:定量檢測限。

3 結論

香菇及香菇培養(yǎng)料經熱水結合超聲波提取后,采取液相色譜分離,并利用電感耦合等離子體質譜測定5種形態(tài)砷元素的含量。結果表明,該方法準確高效,準確度和精度均滿足檢測需要。實際樣品中,培養(yǎng)料中的砷元素主要以As(V)的形式存在,其含量與栽培時間關系不大。鮮香菇和干香菇中則含有較多的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和AsB,雖然總砷結果符合國標限量要求,但高毒的無機砷占大多數。

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SpeciesanalysisofarsenicinLentinusedodesandculturemediumbyHPLC-ICP-MS

TANGQing-qiang1,CHENZe-yu1,CHENShu-yi2,ZHANGXin-ren1,CHENGLi-jun1,ZHANGYun1

(1.Sanming Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Sanming 365000,China; 2.Ningde Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Ningde 352000,China)

The method for determination of arsenite(As(Ⅲ)),arsenate(As(Ⅴ)),methylarsonic acid(MMA),dimethylarsinic acid(DMA),and arsenic betaine(AsB)arsenic species inLentinusedodesand culture medium by HPLC-ICP-MS has been developed.Samples were extracted with ultrasonic instrument in 70 ℃,then separated by HPLC on an anion chromatography and quantification by ICP-MS. Good linearities of 5 arsenic species were observed with correlation coefficients above 0.9999,the linear range was 0～100.0 ng/mL.Recoveries were between 81.0% and 108.9% and the relative standard deviation were within 1.6%～6.3%(n=6).With the actual samples tested the As(V)was the main species in culture medium.The content had little relation with its cultivation time.It had more content As(Ⅲ),As(Ⅴ)and AsB inLentinusedodes. Although the total arsenic results conform to the requirements of the national standards,but high toxic inorganic arsenic are majority.

HPLC-ICP-MS;Lentinusedodes;culture medium;arsenic;species analysis

2016-11-30

唐慶強(1981-)，男，碩士，工程師，研究方向：食品檢測技術與應用，E-mail:tqqls@163.com。

福建出入境檢驗檢疫局科技計劃(FK2013-27)。

TS207.3

:A

:1002-0306(2017)12-0017-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.003