龔輝松

[摘要]目的 分析補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方對(duì)骨質(zhì)疏松骨折骨痂中CTGF、Osterix因子表達(dá)的影響。方法 選擇6月齡清潔級(jí)健康雌性SD大鼠60只，隨機(jī)分為3組：模型組、西藥組和中藥組，每組20只。骨質(zhì)疏松骨折模型成功后，中藥組和西藥組分別給予補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方和阿倫磷酸鈉混懸液灌服，模型組進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，1個(gè)月后取各組骨折的骨痂，進(jìn)行體外培養(yǎng)，各組骨痂給予對(duì)應(yīng)含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)。采用熒光定量PCR法檢測(cè)各組CTGF、Osterix因子的表達(dá)。結(jié)果 在CTGF表達(dá)方面，中藥組和西藥組中的CTGF mRNA含量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在Osterix表達(dá)方面，中藥組和西藥組中的Osterix mRNA含量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且中藥組的Osterix mRNA含量高于西藥組（P<0.05）。結(jié)論 補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方能在一定程度上促進(jìn)骨痂的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)骨折愈合，為骨質(zhì)疏松性骨折愈合的機(jī)制和防治方法提供了一種新的途徑。

[關(guān)鍵詞]補(bǔ)腎健脾中藥；骨質(zhì)疏松骨折；骨痂；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子；Osterix

[中圖分類(lèi)號(hào)] R683 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）05（a）-0063-04

[Abstract]Objective To analyze the influence of Chinese Herbal Compound of Tonifying Kidney and Strengthening Spleen on CTGF and Osterix factor expression in callus of osteoporotic fracture.Methods 60 female SD rats of clean-class aged six-month were selected and they were randomly divided into 3 groups：model group，western medicine group and traditional Chinese medicine group （TCM group） （n=20）.After the success of the osteoporosis′ fracture model，TCM group was given Chinese Herbal Compound of Tonifying Kidney and Strengthening Spleen and the western medicine group was given sodium alendate suspension.The model group was given routine culture.After 1 month，the callus of each group was taken and cultured in vitro.The callus of each group was cultured with the corresponding serum.CTGF and Osterix expression in each group were detected by fluorescence quantitative PCR.Results The expression of CTGF mRNA in TCM group and western medicine group was significantly higher than that in model group （P<0.05）.Osterix mRNA level in TCM group and western medicine group were significantly higher than those in model group （P<0.05），and the content of Osterix mRNA in TCM group was higher than that in western medicine group （P<0.05）.Conclusion Chinese herbal Compound of Tonifying Kidney and Strengthening Spleen can promote the growth of callus to a certain extent，thus promote fracture healing，and it provides the new way for the mechanism and prevention and treatment methods osteoporosis′fracture healing.

[Key words]Chinese herbal medicine of tonifying kidney and strengthening spleen；Osteoporosis fracture；Callus；Connective tissue growth factor；Osterix

骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重的并發(fā)癥是骨質(zhì)疏松性骨折，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。骨質(zhì)疏松性骨折是由于骨強(qiáng)度下降所致。目前已知的影響骨強(qiáng)度的因素主要有骨量、骨微結(jié)構(gòu)、骨的幾何形狀、皮質(zhì)骨厚度和多孔程度、骨組織構(gòu)成材料的內(nèi)在性能等[1]。骨質(zhì)疏松性骨折的防治已成為了全世界關(guān)注的課題。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折愈合機(jī)制以及對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折局部骨痂的“質(zhì)量”的研究相對(duì)較少，且主要針對(duì)體內(nèi)環(huán)境中的骨痂進(jìn)行探討。本研究通過(guò)建立骨質(zhì)疏松性骨折模型及骨痂組織體外培養(yǎng)體系，運(yùn)用中藥血清藥理學(xué)的研究方法，模擬中藥在體內(nèi)作用于骨痂組織的模式，觀察補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方對(duì)體外環(huán)境中骨痂生物學(xué)特性的變化以及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）、Osterix因子表達(dá)的影響，揭示補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折骨痂生物學(xué)特性影響的作用機(jī)制，為中醫(yī)“腎主骨”理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。亦為研究骨質(zhì)疏松性骨折愈合的生理病理機(jī)制和治療方法提供一種新的思維模式。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

6月齡清潔級(jí)健康雌性SD大鼠60只，其體重為（260±30）g。隨機(jī)分為3組：模型組、西藥組和[l1]中藥組；每組20只。所有動(dòng)物均為廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

中藥組采用補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方灌服，藥物的主要組成包括：黃芪12 g，補(bǔ)骨脂15 g，淫羊藿15 g，菟絲子12 g，肉蓯蓉15 g，熟地15 g，白芍10 g等組成。根據(jù)臨床用藥劑量及新藥研究中動(dòng)物用藥劑量要求，該方的提取藥物，含生藥量1.65 g/ml。西藥組采用阿倫磷酸鈉片配制成0.055 mg/ml濃度的阿倫磷酸鈉混懸液（杭州默沙東制藥有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字J20080069）。

1.3含藥血清的制備

每組中10只大鼠給予相應(yīng)的藥物連續(xù)灌胃2周，其中西藥組和中藥組以蒸餾水定容至上述所需濃度，每日灌胃1次，模型組給予正常飲食。最后1次給予動(dòng)物灌胃后的2 h，對(duì)動(dòng)物行心臟采血。獲得的全血置于含EDTA抗凝試管中，5～10 min后，以3000 r/min離心15 min，吸取上清，加以滅活，抽濾除菌，放置-20℃冰箱保存。

1.4 動(dòng)物造模

每組中另外10只作動(dòng)物模型，采用10%水合氯醛溶液作麻醉，以0.33 ml/100 g腹腔注射，待5 min后，大鼠麻醉完全，采用背側(cè)入路行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)以造模。3個(gè)月后，行骨密度檢查，證實(shí)模型成功后，對(duì)各組麻醉，消毒右下肢，取膝內(nèi)側(cè)髕旁切口約1 cm，逐層分離切開(kāi)，將髕骨及韌帶向外側(cè)推開(kāi)，暴露膝關(guān)節(jié)，屈曲膝關(guān)節(jié)，暴露髁間窩，鉆入0.5 mm克氏針，至股骨轉(zhuǎn)子下，做髓內(nèi)固定，剪斷克氏針，殘端長(zhǎng)度以不影響關(guān)節(jié)活動(dòng)為度。利用骨折發(fā)生裝置將股骨造成閉合性骨折[2-3]。

1.5給藥方法

骨質(zhì)疏松骨折的模型成功后，各組開(kāi)始灌胃治療，灌胃給藥容積為10 ml/kg，模型組灌服蒸餾水；西藥組和中藥組以蒸餾水定容至上述所需濃度，每日灌胃1次，治療時(shí)間為1個(gè)月。

1.6骨痂的體外培養(yǎng)

摘取眼球取大鼠外周血3～4 ml，取血后處死，置于75%的乙醇浸泡15 min，置于無(wú)菌臺(tái)上，切開(kāi)皮膚及皮下，分離肌肉，暴露骨折段，取出骨痂，PBS漂洗后放于Eppendorf管作備用。大鼠處死前24 h禁食。將新鮮骨痂標(biāo)本切成1 mm×1 mm×1 mm大小，經(jīng)過(guò)兩次含有青霉素及鏈霉素的PBS液漂洗后，放入培養(yǎng)板，加等量bGJB培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2中靜置培養(yǎng)，24 h后換液，根據(jù)分組情況分別加用含藥血清與bGJB培養(yǎng)液共同培養(yǎng)，1周后收集標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.7 指標(biāo)的檢測(cè)及結(jié)果的計(jì)算

采用熒光定量PCR檢測(cè)各組骨痂中的CTGF 和 Osterix 的mRNA含量。使用引物和探針設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0，除了考慮引物、探針設(shè)計(jì)的通用原則外，此引物Tm值要求在58～60℃，探針Tm值在68～70℃，以保證探針特異性雜交。序列表見(jiàn)表1。

按照抽提的總RNA應(yīng)馬上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：取2 μl RNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：30℃ 10 min，42℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min；取1 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）進(jìn)行熒光定量PCR。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的原理，以β-actin基因mRNA的表達(dá)為內(nèi)對(duì)照。ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（β-actin），然后計(jì)算實(shí)驗(yàn)組各樣本的ΔCt與對(duì)照組樣本的ΔCt的差值，從而得到ΔΔCt，ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對(duì)照組）。采用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。表示實(shí)驗(yàn)組測(cè)定基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組樣本基因的表達(dá)的變化倍數(shù)，將2-ΔΔCt作為最后的定量結(jié)果用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件包分析，計(jì)量資料用x±s表示，采用方差分析和t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

在CTGF表達(dá)方面，中藥組和西藥組的CTGF mRNA含量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但中藥組與西藥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在Osterix表達(dá)方面，中藥組和西藥組的Osterix mRNA含量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且中藥組的Osterix mRNA含量高于西藥組（P<0.05）（表2）。

3討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松屬“骨痿“范疇?！端貑?wèn)·痿論》云：“此乃腎水不足，水不勝火；則骨枯髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿?！逼洳∫虿C(jī)，當(dāng)首責(zé)于腎虛。由于各種原因?qū)е履I（氣、陰、陽(yáng)）的不足，影響骨髓和血之化源，精不生髓，骨失髓血充養(yǎng)，易發(fā)生骨骼脆弱無(wú)力之證，即骨質(zhì)疏松性骨折。同時(shí)，中醫(yī)學(xué)亦認(rèn)為骨質(zhì)疏松性骨折愈合就是“瘀去、新生、骨合”的過(guò)程，且在“腎主骨”理論指導(dǎo)下進(jìn)行組方用藥，國(guó)內(nèi)的研究[4]表明補(bǔ)腎中藥提高了機(jī)體內(nèi)分泌腺系統(tǒng)的功能，改善了下丘腦-垂體-性腺軸的功能，增加了體內(nèi)的性激素，調(diào)整了內(nèi)環(huán)境，從而達(dá)到抑制骨吸收，增加骨形成的目的，起到提高骨量的作用。魏合偉等[5-6]的研究已證明以“補(bǔ)腎法”擬定的中藥骨康方對(duì)骨代謝有雙向作用，既可抑制骨吸收，又可促進(jìn)骨形成，縮短再造周期，提高骨生物力學(xué)性能，改善骨的質(zhì)量，是一個(gè)較理想的治療骨質(zhì)疏松癥的藥物。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)其含藥血清中含有類(lèi)性激素樣作用的物質(zhì)；能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和礦化，并促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原。

本研究所用方由黃芪、補(bǔ)骨脂、淫羊藿、菟絲子、肉蓯蓉、熟地、白芍等組成，全方諸藥共奏補(bǔ)腎壯骨、健脾益氣之功效。該方以補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎助陽(yáng)壯骨為君藥。輔之肉蓯蓉、淫羊藿、菟絲子加強(qiáng)其補(bǔ)腎壯陽(yáng)之功為臣藥。同時(shí)配以黃芪補(bǔ)中益氣；熟地、白芍滋陰益精，培補(bǔ)后天生化之源以充腎精，又可達(dá)到補(bǔ)中寓通，補(bǔ)而不滯的目的，共為佐藥，故本方具有補(bǔ)腎壯骨、健脾益氣的作用。

骨折修復(fù)的最終目的是盡可能恢復(fù)受傷骨的最大力學(xué)強(qiáng)度，修復(fù)骨折不僅要恢復(fù)骨形態(tài)的連續(xù)，更重要的是重建骨的支撐功能[7]。骨痂被認(rèn)為是一種黏彈性物質(zhì)，會(huì)隨著骨愈合過(guò)程而發(fā)生變化，由此出現(xiàn)剛度與強(qiáng)度變化的不同步[8]。張勝利等[9]的研究表明，骨質(zhì)疏松后，皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的生物力學(xué)性能均發(fā)生了改變：在骨折愈合的不同時(shí)期骨痂局部的形狀、截面積、均勻性等發(fā)生變化，對(duì)于骨質(zhì)疏松骨折而言，骨皮質(zhì)變薄，骨彈性下降，骨脆性增加，骨骼的生物力學(xué)性能下降。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)骨折愈合的認(rèn)識(shí)不斷深化，現(xiàn)已知有大量的細(xì)胞生長(zhǎng)因子在骨折愈合的不同階段參與并調(diào)控了實(shí)質(zhì)過(guò)程，如CTGF及Osterix因子對(duì)骨細(xì)胞的增殖和分化有重要作用。

CTGF是CCN家族中的成員，是一種由349個(gè)氨基酸組成，分子量為34～38 KD的富含半胱氨酸的分泌肽，目前該家族共有CTGF/fisp-12，cef10/Cyr61和Nov三個(gè)成員，參與了體內(nèi)的多種病理生理過(guò)程，在骨折愈合中發(fā)揮重要作用。研究表明[10-11]，其可促進(jìn)軟骨細(xì)胞、生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞、肥大軟骨細(xì)胞的增殖，并參與膜內(nèi)骨化和骨建?；蛑厮埽虼嗽诰S持骨量方面有重要作用。在本研究中，中藥組和西藥組的CTGF mRNA含量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)與意義，說(shuō)明補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方能進(jìn)一步提高骨痂的生長(zhǎng)。

Osterix是一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的，對(duì)成骨細(xì)胞分化很重要的轉(zhuǎn)錄因子，屬于Sp/XKLF家族，定位局限于細(xì)胞核。它只在發(fā)育的骨組織中特異表達(dá)，被Lee等[12]認(rèn)為是直接調(diào)節(jié)骨形成protein-2-runx2通路主要因子。另一方面，Osterix被認(rèn)為是sox9和軟骨細(xì)胞的一種負(fù)向調(diào)控因子，可阻止骨或軟骨的祖細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化。Baek等[13]的研究表明，Osterix失去可以延遲成骨細(xì)胞的成熟，導(dǎo)致不成熟的成骨細(xì)胞的積累和減少骨形成的成骨細(xì)胞功能的缺陷，無(wú)明顯骨吸收，因此，認(rèn)為Osterix在積極調(diào)控成骨細(xì)胞分化和骨形成具有重要作用。Kang等[14]用機(jī)械牽張力結(jié)合超聲波刺激成骨細(xì)胞前體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Osterix結(jié)合機(jī)械刺激可加速成骨細(xì)胞的基質(zhì)成熟。Sinha等[15]認(rèn)為，Osterix是成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，它能激活早期成骨細(xì)胞分化成更多成熟的骨細(xì)胞。在本研究中，中藥組和西藥組中的Osterix mRNA含量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥組的Osterix mRNA含量高于西藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方在提高骨痂的生長(zhǎng)有明顯的影響。

綜上所述，補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方能在一定程度上可促進(jìn)骨痂的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)骨折愈合，為防治骨質(zhì)疏松性骨折、促進(jìn)骨折愈合的治療方法提供了一種新的途徑。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Fonseca H，Moreira-Gon？觭alves D，Coriolano HJ，et al.Bone quality：the determinants of bone strength and fragility[J].Sports Med，2014，44（1）：37-53.

[2]程英雄，羅毅文，趙可偉，等.補(bǔ)腎健脾活血法對(duì)SD大鼠骨折愈合過(guò)程中骨痂顯微結(jié)構(gòu)變化的影響[J].新中醫(yī)，2010， 42（8）：126-127.

[3]周曉中，董啟榕，張健.大鼠股骨閉合骨折模型的制作[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2007，26（1）：60-62.

[4]李穎，白波，吳伙燕，等.補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方對(duì)去勢(shì)大鼠血清中Bcl-2和Bax水平的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012， 27（4）：1120-1123.

[5]魏合偉，林一峰.中藥骨康含藥血清中類(lèi)雌二醇樣物質(zhì)含量的測(cè)定[J].中醫(yī)正骨，2003，15（11）：14-16.

[6]李穎，黃宏興，莊洪，等.中藥骨康對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（2）：160-163.

[7]夏群，苗軍，張繼東，等.周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)對(duì)骨折愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志，2003，5（3）：233-235.

[8]賀小兵，盧衛(wèi)忠，唐康來(lái)，等.骨形成蛋白和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β對(duì)兔尺骨骨折愈合后生物力學(xué)性能的影響[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2003，17（3）：2185-2188.

[9]張勝利，王全平.骨質(zhì)疏松性骨折愈合過(guò)程中骨痂局部生物力學(xué)改變的實(shí)驗(yàn)研究[J].西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22（6）：558-560.

[10]Takigawa M，Nakanishi T，Kubota S，et al.Role of CTGF/HCS24/ecogenin in skeletal growth control[J].J Cell Physiol，2003，194（3）：256-266.

[11]Tsai HC1，Su HL，Huang CY，et al.CTGF increases matrix metalloproteinases expression and subsequently promotes tumor metastasis in human osteosarcoma through down-regula？鄄ting miR-519d[J].Oncotarget，2014，5（11）：3800-3812.

[12]Lee DS，Choung HW，Kim HJ，et al.NFI-C Regulates Osteo？鄄blast Differentiation via Control of Osterix Expression[J].Stem Cells，2014，32（9）：2467-2679.

[13]Baek WY，Lee MA，Jung JW，et al.Positive regulation of adult bone formation by osteoblast-specific transcription factor osterix[J].J Bone Miner Res，2009，24（6）：1055-1065.

[14]Kang KS，Lee SJ，Lee HS，et al.Effects of combined mechanical stimulation on the proliferation and differe？鄄ntiation of pre-osteoblasts[J].Exp Mol Med，2011，43（6）：367-373.

[15]Sinha KM，Zhou X.Genetic and molecular control of osterix in skeletal formation[J].J Cell Biochem，2013，114（5）：975-984.

（收稿日期：2017-03-08 本文編輯：許俊琴）