戴 宇，劉 凱，姚秀華

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院婦科，廣東 深圳 518000）

卵巢腫瘤是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的三大惡性腫瘤之一，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首，因其發(fā)病比較隱匿，許多卵巢癌被確診時(shí)已是晚期。而在卵巢惡性腫瘤中，上皮性卵巢癌約占90%，腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和以鉑類為基礎(chǔ)的化療是上皮性卵巢癌的主要治療原則。但隨之而來(lái)的腫瘤細(xì)胞耐藥問(wèn)題使相當(dāng)一部分患者在手術(shù)合化療后仍會(huì)出現(xiàn)疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)，致使其5年生存率還不到30%。因此，尋找惡性腫瘤的早期診斷指標(biāo)以及尋找基因的靶向治療方法逐漸成為一個(gè)研究的熱點(diǎn)，鈣網(wǎng)蛋白 (calreticulin，CRT)為主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (endoplasmic reticulum，ER)且高度保守的一種Ca2+結(jié)合蛋白，包括協(xié)助蛋白質(zhì)加工折疊、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣平衡、抑制腫瘤血管新生和參與抗原遞呈及細(xì)胞凋亡等功能。最近發(fā)現(xiàn)，CRT在臨床腫瘤的診斷及治療方面有著不可估計(jì)的應(yīng)用前景，成為研究熱點(diǎn)之一。但有關(guān)CRT在卵巢癌中的研究尚無(wú)報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)CRT在不同生理、病理狀態(tài)下的卵巢組織中蛋白的表達(dá)，從而尋找可預(yù)測(cè)腫瘤惡性潛能的生物學(xué)標(biāo)志物，為采取有效的預(yù)防措施，選擇新的治療靶點(diǎn)，制定合理有效的綜合治療方案奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取深圳市婦幼保健院2013-01—2015-12間手術(shù)切除的組織標(biāo)本，包括40例上皮性卵巢癌，20例卵巢良性腫瘤，10例正常卵巢組織，上皮性卵巢癌患者40例，其中漿液性癌28例，粘液性癌12例；高-中分化癌14例，低分化癌26例；按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，I～I(xiàn)I期11例，III～I(xiàn)V期29例；有淋巴轉(zhuǎn)移25例，未轉(zhuǎn)移15例，所有的病例術(shù)前均未接受放療、化療或激素治療。良性卵巢腫瘤20例，10例正常卵巢組織 (來(lái)自卵巢活檢、子宮肌瘤或功能性子宮出血、子宮脫垂的病例行全子宮切除同時(shí)行卵巢切除，病理證實(shí)卵巢組織無(wú)異常者)，病理診斷經(jīng)兩位病理專家確證。組織標(biāo)本10%甲醛固定，石蠟包埋，制備成4μm厚切片。

1.2 方法

免疫組織化學(xué)檢查采用S-P兩步法。鼠抗人CRT多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物科技公司，工作濃度1∶200。免疫組化S-P試劑盒購(gòu)自福州邁新試劑公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司，整個(gè)過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每批染色均設(shè)已知陽(yáng)性切片（肝癌）作陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

每張切片于400倍光鏡下隨即選取4個(gè)視野，采用Metamorph/DP10/BX41顯微圖像分析系統(tǒng)，對(duì)其中一個(gè)具有代表意義的陽(yáng)性結(jié)果視野的棕黃色顆粒進(jìn)行標(biāo)記，以此標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)檢測(cè)所有視野的陽(yáng)性結(jié)果，以參數(shù)積分光密度（integral optical density，IOD）代表蛋白顆粒密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量單位以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和獨(dú)立樣本Dunnett t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在上皮性卵巢癌中表達(dá)水平明顯高于在卵巢良性腫瘤及正常卵巢組織中的表達(dá)（見(jiàn)表1）。進(jìn)一步分析CRT的表達(dá)與卵巢癌某些臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，CRT與組織病理分級(jí)（P＜0.05）、臨床分期（P＜0.05）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）有關(guān)，與組織學(xué)分型（P＞0.05）無(wú)關(guān)（見(jiàn)表2）。

圖1 CRT在上皮性卵巢癌中的表達(dá)（S-P 400×）

圖2 CRT在正常卵巢組織中的表達(dá)（S-P 400×）

表1 CRT在正常卵巢組織及上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)（±s）

表1 CRT在正常卵巢組織及上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)（±s）

注:1)vs 2)，P＜0.05；1)vs 3)，P＜0.05；2)vs 3)，P＜0.05。

分組正常卵巢組織1)良性卵巢腫瘤2)上皮性卵巢癌3)例數(shù)OPN F/P 10 20 40(IOD值)3.21±4.50 16.54±7.04 90.26±10.29 F=9.55 P＜0.05

3 討論

CRT最先由Ostwald和Maclennan于1974年從骨骼肌肌漿網(wǎng)中首次分離獲得，是一種普遍存在且高度保守的內(nèi)質(zhì)鈣結(jié)合蛋白。CRT是熱休克蛋白家族的一員，分子大小約46kD，由單一基因編碼，人類CRT基因位于第19號(hào)染色體(p13.2～p13.3)，由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，長(zhǎng)度為1254 bp，編碼由417個(gè)氨基酸組成的酸性蛋白質(zhì)，最初被認(rèn)為是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白，主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，普遍存在于除酵母和原核生物以外的哺乳動(dòng)物細(xì)胞及植物中。后有研究發(fā)現(xiàn)，CRT還存在于胞膜、胞質(zhì)或胞外基質(zhì)等，即所謂的非ER-CRT[1]。CRT由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，包括球狀N-末端結(jié)構(gòu)域、富脯氨酸P結(jié)構(gòu)域和酸性C末端結(jié)構(gòu)域[2]，每個(gè)結(jié)構(gòu)均發(fā)揮獨(dú)特的病理生理學(xué)作用。鈣網(wǎng)蛋白最初的功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度的穩(wěn)定及作為分子伴侶、協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊[3]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)CRT是多功能蛋白質(zhì)，在抗原的提呈、血管的發(fā)生、細(xì)胞黏附、細(xì)胞凋亡及自身免疫系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用，CRT表達(dá)量的改變可以使細(xì)胞的侵襲、黏附、增殖等生物學(xué)行為發(fā)生改變，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)[4]。

表2 CRT的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（±s）

表2 CRT的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（±s）

臨床病理指標(biāo)組織病理分級(jí)高-中分化低分化臨床分期I～I(xiàn)I期III～I(xiàn)V 期組織學(xué)分型漿液性囊腺癌黏液性囊腺癌淋巴轉(zhuǎn)移例數(shù)OPN表達(dá)（IOD值）t P 14 26 44.30±12.54 90.44±13.42 4.51P＜0.05 11 29 56.32±11.74 110.21±15.06 2.48P＜0.05 28 12 89.41±21.41 93.17±18.56 0.21P＞0.05無(wú)有15 25 61.67±20.24 112.34±18.42 3.04P＜0.05

惡性腫瘤死亡率高的一個(gè)重要的原因是不能早期診斷，許多患者在明確診斷后往往已經(jīng)是晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳的治療時(shí)機(jī)。而缺乏特異性高、敏感性強(qiáng)的腫瘤標(biāo)記物是導(dǎo)致不能早期診斷的直接原因。因此，尋找出新的有利于早期診斷的腫瘤標(biāo)記物意義重大。近年許多研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤中CRT及其裂解片段有量的改變。Liu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞膜上的CRT表達(dá)水平與腫瘤的病理分型和分期相關(guān)，小細(xì)胞肺癌的CRT水平低于腺癌，然而鱗狀細(xì)胞癌表達(dá)均比前兩者高。Sheng等[6]研究結(jié)果顯示，胰腺癌中CRT mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織，CRT過(guò)表達(dá)者的預(yù)后好于低表達(dá)者。Kageyama等[7]發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者尿液中CRT表達(dá)較正?；颊吒?，且靈敏度及特異性分別達(dá)67%、80%。Kabbage等[8]研究發(fā)現(xiàn)，CRT在乳腺癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，尤其在高侵襲性的乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)量高于低侵襲性細(xì)胞。CRT在肝癌、食管癌、結(jié)腸癌[9]等腫瘤中也呈高表達(dá)，近年CRT逐漸成為婦科腫瘤領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。劉倩等[10]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜樣腺癌中CRT mRNA水平和蛋白表達(dá)水平較正常子宮內(nèi)膜均升高，韓冰等[11]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CRT在絨癌耐藥細(xì)胞系中高表達(dá)，下調(diào)CRT后耐藥指數(shù)明顯降低，推測(cè)CRT可能參與絨癌耐藥。以上研究表明，CRT有望成為多種腫瘤的新標(biāo)記物,有利于協(xié)助惡性腫瘤的早期診斷。

本研究結(jié)果顯示CRT主要定位在細(xì)胞的胞漿，其表達(dá)與上皮性卵巢癌的組織病理分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)。CRT進(jìn)一步加快了腫瘤細(xì)胞的進(jìn)程。因此，檢測(cè)CRT可能成為卵巢癌診斷性標(biāo)志物及有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)改善卵巢癌患者的預(yù)后具有重要的意義。最終使降低卵巢癌患者的復(fù)發(fā)率，提高5年生存率成為可能。

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