鄭 曉，徐金麗，徐光軍

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，國家煙草專賣局病蟲害監(jiān)控與綜合治理重點實驗室，青島 266101）

抑芽丹在煙草上的消解趨勢及安全性評價

鄭 曉，徐金麗，徐光軍

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，國家煙草專賣局病蟲害監(jiān)控與綜合治理重點實驗室，青島 266101）

為評價抑芽丹在煙草上的消解趨勢及安全性，建立了一種簡單可行的殘留量測定方法，并開展兩年兩地消解動態(tài)和最終殘留研究。結(jié)果表明，煙草以酸化甲醇提取，SPE-C18固相萃取小柱凈化，高效液相色譜測定，抑芽丹最低檢測濃度為0.1 mg/kg。在1.0～80.0 mg/kg添加水平下，抑芽丹在鮮煙葉和干煙葉中的平均回收率分別為81.81%～95.89%和82.01%～83.08%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.39%～7.03%和1.04%～1.71%。在消解動態(tài)試驗施藥后21 d，抑芽丹在煙草上的消解率超過90%，理論半衰期7.9～9.6 d，消解趨勢符合一級動力學(xué)方程；施藥后7 d，抑芽丹最終殘留量低于80 mg/kg的指導(dǎo)性殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，安全風(fēng)險處于較低水平。

抑芽丹；煙草；殘留；消解趨勢；安全性

抑芽丹（maleic hydrazide, MH），又稱馬來酰肼，化學(xué)名稱為順丁烯二酰肼，是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，可被植物的根部或葉面吸收，由木質(zhì)部和韌皮部傳導(dǎo)至植株體內(nèi)，通過阻止細(xì)胞分裂，從而抑制植物生長，常用來防止貯藏期的馬鈴薯、大蒜、蘿卜等發(fā)芽[1-2]，以及控制煙草側(cè)芽生長，提高煙葉品質(zhì)[3]。1995年美國確定抑芽丹對人體有致癌風(fēng)險，將其列入PIC名單，隨后日本、歐盟等國嚴(yán)格限用，我國目前只在煙草和馬鈴薯上登記使用[4]。2006年1月9日，《煙草控制框架公約》（FCTC）在我國正式生效[5]，控?zé)煹耐瑫r，煙草的農(nóng)藥使用和殘留問題以及煙葉安全性更加受到關(guān)注。

國際煙草科學(xué)研究合作中心（CORESTA）和中國煙草企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（YQ50—2014）規(guī)定煙草上抑芽丹的指導(dǎo)性殘留限量為80 mg/kg，雖然限量值相對較高，但我國煙葉在出口貿(mào)易中也曾出現(xiàn)殘留量超標(biāo)現(xiàn)象。為進一步明確抑芽丹在煙草上的消解趨勢和最終殘留量情況，在優(yōu)化殘留分析方法的基礎(chǔ)上，開展兩年兩地消解動態(tài)和最終殘留試驗，并對比分析研究結(jié)果與殘留限量和推薦安全間隔期之間的一致性，為客觀評價抑芽丹在煙草上的安全性提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1試驗材料

試驗于2013年和2014年分別在山東省青島市中國農(nóng)科院煙草研究所即墨試驗基地和四川省西昌市中國農(nóng)科院煙草研究所西南試驗基地進行。山東試驗點煙草品種為NC89，四川試驗點煙草品種為CF27。供試農(nóng)藥為30.2%抑芽丹水劑，由重慶雙豐化工有限公司提供。

1.2試驗設(shè)計

1.2.1 田間試驗設(shè)計 試驗設(shè)3個處理，每個處理分3個重復(fù)小區(qū)，小區(qū)面積30 m2，隨機排列，小區(qū)間設(shè)保護行，另設(shè)不施藥對照小區(qū)。根據(jù)農(nóng)藥登記資料，30.2%抑芽丹水劑抑制煙草腋芽，推薦稀釋倍數(shù)為40～50倍。

消解動態(tài)試驗（處理1）：稀釋倍數(shù)26.67倍（制劑用量12375 mL/hm2），用水量900 L/hm2，于旺長中后期在煙草葉片上1次噴霧施藥。

最終殘留試驗（處理2、3）：按照20 mL/株的藥液用量和16500株/hm2的種植密度計算，藥液用量330 L/hm2。其中處理2稀釋倍數(shù)40倍（制劑用量8250 mL/hm2），處理3稀釋倍數(shù)26.67倍（制劑用量12375 mL/hm2）。分別于煙草打頂后1次杯淋施藥。

對照：不施藥。

所有試驗操作均參照文獻[6]、[7]實施。

1.2.2 田間試驗取樣 處理1：分別在施藥后1 h、1、3、5、7、14、21、28、35、42 d，在試驗小區(qū)內(nèi)隨機采集40～50片生長正常、無病害的葉片，切碎混勻后四分法留樣300 g，裝入塑料袋中，粘好標(biāo)簽，貯存于-20 ℃冰柜中。小區(qū)邊行和每行距離兩端0.5 m內(nèi)不采樣（施藥前、施藥后7、28 d，采集對照樣品）。

處理2、3：于施藥后7、14、21 d，在試驗小區(qū)內(nèi)隨機采集100片正常成熟的煙草葉片，經(jīng)三段式工藝烘烤、粉碎混勻后四分法留樣200 g，裝入塑料袋中，粘好標(biāo)簽，貯存于-20 ℃冰柜中。小區(qū)邊行和每行距離兩端0.5 m內(nèi)不采樣（同步采集對照樣品）。

1.3樣品測定

1.3.1 主要儀器與試劑 高效液相色譜儀-紫外檢測器（HPLC-UV），Waters Alliance e 2695/2489；超聲波振蕩器，BLVD PARD WSZ-200A；渦旋混合儀，Dragon MX-F；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，HEIDOLPH ADVANTAGE；千分之一電子天平，SHIMADZUUW420H；萬分之一電子天平，ER-182A。

抑芽丹標(biāo)準(zhǔn)品，純度97.5%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇，分析純、色譜純，國藥集團（上海）化學(xué)試劑有限公司；磷酸，分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；鹽酸，分析純，煙臺三和化學(xué)試劑有限公司。提取液，酸化甲醇（80 mL甲醇+20 mL去離子水+1 mL 4 mol/L HCl）。SPE-C18固相萃取小柱，500 mg/6 mL。淋洗液，0.3%磷酸水溶液。

1.3.2 測定方法 （1）提取。稱取鮮煙葉樣品10.0 g（干煙葉樣品2.0 g），置于50 mL離心管中，加入20 mL提取液，經(jīng)渦旋混合儀振蕩2 min和超聲波震蕩器提取20 min后，以4000 r/min離心5 min。吸取上層清液10 mL，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上50 ℃減壓濃縮蒸除甲醇，待凈化。（2）凈化。分別用5 mL甲醇、5 mL去離子水預(yù)淋洗SPE-C18小柱，將提取液殘渣轉(zhuǎn)移到柱中，用8 mL淋洗液淋洗SPE-C18小柱，收集全部淋出液并定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，待測定。（3）檢測條件。色譜柱：CNW-Athena C18-WP柱，5.0 μm，4.6 mm×250 mm；流動相：梯度洗脫（表1）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；測定波長：205 nm；進樣量10 μL。（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。準(zhǔn)確稱取0.05 g抑芽丹標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液溶解并定容至刻度，以此作為抑芽丹標(biāo)準(zhǔn)品母液。吸取一定量的母液，依次配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，按（3）的條件進行測定，以抑芽丹進樣濃度為橫坐標(biāo)、相應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0.1～20.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，抑芽丹標(biāo)準(zhǔn)溶液線性方程為y=84706x+2070.5（r=1），其中y為抑芽丹響應(yīng)峰面積，x為抑芽丹進樣濃度。

表1流動相梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of mobile phase

2 結(jié) 果

2.1方法的靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度

分別用最低檢測濃度（LOQ）、添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度。抑芽丹在鮮煙葉和干煙葉中最低檢測濃度為1.0 mg/kg。在對照煙葉中添加一定濃度的抑芽丹標(biāo)準(zhǔn)溶液，用1.3.2的方法提取、凈化和測定。在1.0～80.0 mg/kg添加水平下，抑芽丹在鮮煙葉中平均回收率為81.81%～95.89%，RSD為2.39%～7.03%，在干煙葉中平均回收率為82.01%～83.08%，RSD為1.04%～1.71%。結(jié)果表明，該方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則要求（表2、圖1）。

表2抑芽丹在鮮煙葉和干煙葉中的添加回收率Table 2 Recovery rates of Maleic hydrazide in green and dried tobacco leaves

圖1抑芽丹標(biāo)樣(a)、鮮煙葉CK(b)、鮮煙葉樣品(c)、干煙葉CK(d)、干煙葉樣品(e)典型色譜圖Fig. 1 Chromatogram of Maleic hydrazide in the standard sample (a), control of green tobacco leaves (b), sample of green tobacco leaves (c), control of dried tobacco leaves (d), and sample of dried tobacco leaves (e)

2.2抑芽丹在鮮煙葉中的消解趨勢

表3示出，2年2地試驗的鮮煙葉樣品中，抑芽丹1 h原始沉積量371.95～677.24 mg/kg，施藥后3 d時消解率全部超過70%，施藥后21 d時消解率全部超過90%。理論半衰期7.9-9.6 d，平均9.1 d。

2.3抑芽丹在干煙葉中的最終殘留量

試驗結(jié)果表明（表4），30.2%抑芽丹水劑稀釋40倍施藥1次，施藥7 d后抑芽丹殘留量為5.33～32.07 m

g/kg，14 d時殘留量為3.95～9.26 mg/kg， 21 d時殘留量為1.27～3.57 mg/kg；稀釋26.67倍施藥，施藥7 d后抑芽丹殘留量為7.35～58.33 mg/kg，14 d時殘留量為4.47～16.11 mg/kg，21 d時殘留量為1.55～6.46 mg/kg。

表3抑芽丹在鮮煙葉中的消解動態(tài)Table 3 Degradation dynamics of Maleic hydrazide in green tobacco leaves

表4抑芽丹在干煙葉中的最終殘留量Table 4 Final residues of Maleic hydrazide in dried tobacco leaves

3 討 論

3.1影響煙葉中抑芽丹沉積和消解的因素

藥液在煙草葉片表面的附著量，受煙草品種、葉片面積大小和施藥器械霧滴粒徑等因素影響，而葉片表面藥液的附著量，直接影響消解動態(tài)試驗原始沉積量的大小。抑芽丹作為一種內(nèi)吸性較強的植物生長調(diào)節(jié)劑，葉面噴施后，很快被吸收并傳導(dǎo)至煙株體內(nèi)各部位。煙草旺長中后期，葉片質(zhì)量增加、表面積增長等生長稀釋因素[8]起到了降低農(nóng)藥殘留量的作用。另外，光照、溫度等環(huán)境因素促進農(nóng)藥殘留降解，以及雨水沖刷等物理因素也會加速抑芽丹在煙葉中的降解速率。

3.2影響煙葉中抑芽丹最終殘留量的因素

在煙草生產(chǎn)中，抑芽丹作為抑芽劑，為煙株打頂后在打頂位置一次性杯淋施藥，藥液沿?zé)熤曛髑o向下流至各節(jié)葉腋處，起到抑制腋芽的作用。從試驗結(jié)果分析，在施藥次數(shù)和末次施藥與采收間隔期相同的情況下，施藥劑量越大，葉片中農(nóng)藥殘留量越高，煙葉中抑芽丹的殘留量與施藥量呈正相關(guān)；在施藥劑量和施藥次數(shù)相同的情況下，末次施藥與采收間隔期越長，葉片中農(nóng)藥殘留量越少，所以煙葉中抑芽丹的殘留量與采收間隔期呈負(fù)相關(guān)。

3.3抑芽丹在煙草上的安全風(fēng)險評價

抑芽丹在煙草上的消解趨勢表明其在煙草葉片上消解速率較快，施藥后21 d時消解率已超過90%；最終殘留試驗中施藥后7 d時的最大殘留量為58.33 mg/kg，低于80 mg/kg的指導(dǎo)性殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。

成熟采收的煙葉需經(jīng)過5～7 d的初烤過程，這個過程對降低煙葉農(nóng)藥殘留量作用明顯?？竞蟮臒熑~在卷制前，還需經(jīng)過復(fù)烤和2～3年的儲藏醇化過程，在此期間農(nóng)藥殘留量進一步降低[9]。在燃吸過程，抑芽丹向主流煙氣的遷移率為1.41%～3.67%，向側(cè)流煙氣的遷移率為0.24%～0.86%[10]。對于吸煙人群，煙草攝入量在膳食結(jié)構(gòu)中的比例較低，且煙草中的抑芽丹經(jīng)過田間自然降解、初烘復(fù)烤降解、儲存降解、燃吸遷移等多個環(huán)節(jié)后，殘留量已處于較低水平，其對人體的安全風(fēng)險同樣處于較低水平。

4 結(jié) 論

采用高效液相色譜（HPLC-UV）測定鮮煙葉和干煙葉中殘留的抑芽丹，最低檢測濃度為1.0 mg/kg，在鮮煙葉中的平均回收率為81.81%～95.89%，RSD為2.39%～7.03%，在干煙葉中平均回收率為82.01%～83.08%，RSD為1.04%～1.71%，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則要求，可實現(xiàn)對煙葉中抑芽丹殘留量的測定。

抑芽丹在煙葉中的消解趨勢符合一級動力學(xué)方程，施藥后21 d時消解率全部超過90%，理論半衰期平均為9.1 d。最終殘留試驗中施藥后7 d時的最大殘留量低于80 mg/kg的指導(dǎo)性殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，且隨著采樣間隔期的推遲，殘留量進一步降低。抑芽丹作為一種煙草抑芽劑，不與煙草葉片直接接觸，因此嚴(yán)格控制施藥濃度和規(guī)范施藥操作過程是降低煙葉中抑芽丹殘留量和提高安全性的保障。

[1] 宋國春，于建壘，李瑞娟，等. 抑芽丹在馬鈴薯和土壤中的殘留動態(tài)及安全性評價[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（5）：482-485.

[2] 裴明黎，蔣振輝，王秋霜，等. 馬鈴薯中馬來酰肼的高效液相色譜法[J]. 分析測試學(xué)報，2009，28 （5）：611-613.

[3] 楊昀，劉玉林. 煙葉和土壤中抑芽丹殘留分析方法及應(yīng)用研究[J]. 分析化學(xué)，2004，32 （3）：410.

[4] 張宏軍，段麗芳，李賢賓，等. 我國植物生長調(diào)節(jié)劑限量標(biāo)準(zhǔn)與CAC限量標(biāo)準(zhǔn)的比對分析[J]. 農(nóng)藥科學(xué)與管理，2013，34（11）：1-5.

[5] 段寧東. 《煙草控制框架公約》履約動態(tài)及其對煙草發(fā)展的影響[J]. 中國煙草學(xué)報，2008，14（2）：50-55.

[6] 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所. 農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則[S]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[7] 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所. 農(nóng)藥登記殘留田間試驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程[M]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2007.

[8] TEWARY D K, KUMAR V, RAVINDRANATH S D, et al. Dissipation behavior of bifenthrin residues in tea and its brew[J]. Food Control, 2005, 16 (3)： 231-237.

[9] 李義強. 防治煙草黑脛病藥劑的殘留降解及安全性評價與風(fēng)險評估[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[10] 張洪非，唐綱嶺，樓小華，等. 馬來酰肼殘留在卷煙燃燒過程中的轉(zhuǎn)移行為[J]. 煙草科技，2012（11）：60-63.

Degradation Trend and Safety Evaluation of Maleic Hydrazide in Tobacco Leaves

ZHENG Xiao, XU Jinli, XU Guangjun
( Tobacco Research Institute of CAAS, Key Laboratory of Tobacco Pest Monitoring Controlling & Integrated Management, Qingdao 266101, China)

To evaluate the degradation trend and safety of maleic hydrazide in tobacco leaves, a simple and feasible residue analytical method was established, which was used in the study of digestion dynamics and final residues for 2 years. Maleic hydrazide in tobacco leaf samples was extracted with acid methanol and purified on C18 solid phase extraction column. The results showed that the limit of quantification (LOQ) was 0.1 mg/kg by the determination of high performance liquid chromatography. At spiked levels of 1.0-80.0 mg/kg, the average recoveries ranged from 81.81% to 95.89% for green tobacco leaves and from 82.01% to 83.08% for dried tobacco leaves, with relative standard deviations (RSD) of 2.39%-7.03% and 1.04%-1.71%, respectively. The results of maleic hydrazide degradation dynamic tests showed that the digestion rate in green tobacco was over 90% after 21 days of treatment, with the theoretical half-life being 7.9-9.6 days and the digestion trend was in line with the first order kinetic equation. Maleic hydrazide residues after 7 days of spraying were below the MRL of 80 mg/kg. The residual amount of maleic hydrazide in tobacco was at a lower level of safety risk.

maleic hydrazide; tobacco; residue; degradation trend; safety

S481.08

1007-5119（2017）03-0051-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.03.009

鄭 曉（1983-），女，實驗師，主要從事煙草農(nóng)藥殘留分析研究工作。E-mail：zhengxiao@caas.cn

2016-11-02

2017-03-28