毛新新，侯小東，杜詠梅，袁曉龍，顏培珍，

董維杰1,2，張繼旭1,3，王紅剛1,3，張忠鋒1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京，100081；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島266109）

煙草α-西柏三烯二醇的分離及抑制HepG2細(xì)胞活性研究

毛新新1,2，侯小東1，杜詠梅1，袁曉龍1，顏培珍1，

董維杰1,2，張繼旭1,3，王紅剛1,3，張忠鋒1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京，100081；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島266109）

為挖掘煙草中α-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇（α-CBD）在抗腫瘤活性方面的應(yīng)用價(jià)值，從煙花中提取并分離獲得α-CBD，以HepG2腫瘤細(xì)胞為材料，在體外培養(yǎng)條件下，分別應(yīng)用噻唑藍(lán)（MTT）法、集落形成試驗(yàn)和吉姆薩染色法研究了不同質(zhì)量濃度（2.5～80 mg/L）的α-CBD對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、生長和形態(tài)變化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α-CBD具有抑制HepG2細(xì)胞株增殖、降低細(xì)胞克隆形成并使細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡形態(tài)的作用。說明煙草α-CBD具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性，具有深度開發(fā)利用價(jià)值。

煙草；α-西柏三烯二醇；分離；抑制HepG2細(xì)胞活性

我國歷代本草及國內(nèi)外醫(yī)藥文獻(xiàn)均對(duì)煙草的藥用價(jià)值進(jìn)行過論述，現(xiàn)代煙草化學(xué)研究表明，煙草中富含茄尼醇、綠原酸、西松烷二萜等具有重要醫(yī)藥、保健功能的活性成分[1]。

在我國，煙草主要是作為工業(yè)原料用于卷煙生產(chǎn)，研究其主要化學(xué)成分的活性及用途，使其向食品、保健品、醫(yī)藥等行業(yè)發(fā)展，有利于煙草種植業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，發(fā)揮其潛在價(jià)值，具有十分重要的意義。

西松烷型二萜（cembranoid type diterpenes）是一種大環(huán)二萜類天然活性成分，由4個(gè)異戊二烯單元首尾相連組成，具有十四元環(huán)與3個(gè)對(duì)稱分布的甲基和1個(gè)異丙基的母體骨架[2]。最先在松屬植物和煙草中發(fā)現(xiàn)[3-5]，隨后從海洋生物中發(fā)現(xiàn)了多種該化合物[6]。煙草中的西松烷型二萜更多地存在于葉片和花的表面分泌物中，主要包含西柏三烯二醇[7]。α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇作為同分異構(gòu)體，前者含量更高，是西松烷型二萜最主要的成分[8]，而且具有良好的生物活性。AQIL等[9]研究發(fā)現(xiàn)西柏三烯二醇能夠抑制白念珠菌等真菌以及金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等細(xì)菌的生長，NACOULMA等[10]研究發(fā)現(xiàn)煙草中的西松烷二萜混合物能夠抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，MARTINS等[11]證明西柏三烯二醇具有神經(jīng)保護(hù)作用。然而，肝細(xì)胞癌作為死亡率居世界第二的惡性腫瘤，近年來發(fā)生率逐步上升[12]，煙草中西柏三烯二醇對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用研究卻鮮有報(bào)道。為探索煙草中西柏三烯二醇的抗腫瘤活性，充分利用煙草資源，作者從煙草中提取了西柏三烯二醇，以α-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇[(1S, 2E, 4S, 6R, 7E, 11E)-2, 7,11-Cembratriene-4,6-diol，α-CBD]為對(duì)象，體外作用于肝癌HepG2細(xì)胞，探究其抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

煙花樣品于2014年7月采自山東省青島市即墨試驗(yàn)基地，品種為中煙100。人肝癌HepG2細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠（GE Healthcare公司），GF254柱層層析硅膠（青島海洋化工公司），乙醇、正己烷、二氯甲烷，氯仿、丙酮、甲醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青公司），溴化-3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基四氮唑鹽（MTT，Sigma公司），MEM培養(yǎng)基（Hyclone公司），青鏈霉素雙抗（Gibco公司），磷酸緩沖鹽溶液（PBS, Sigma公司）。

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），Bruker AVIII 600型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司），Agilent 1260超高速液相色譜儀（Agilent公司），Multiskan FC酶標(biāo)儀（Thermo公司），T-DH倒置顯微鏡（Nikon公司），HF90二氧化碳培養(yǎng)箱（Heal Force公司），SW-CJ-2FD醫(yī)用超凈臺(tái)（Airtech公司），Centrifuge 5424 R低速離心機(jī)（Eppendorf公司）。

1.2方法

1.2.1 α-CBD的提取、分離 取新鮮煙草花序，用二氯甲烷室溫下浸提3次，每次浸提時(shí)間1～2 s，將提取液合并，過濾，濾液以無水硫酸鈉除去水分后減壓濃縮，獲得膏狀粗提物。取粗提物10 g，用300 mL 70%乙醇溶解、離心，傾出上清液，沉淀以300 mL 70%乙醇洗滌2次，將上清液合并，減壓濃縮至300 mL，加入石油醚萃取3次，每次300 mL，將石油醚層合并，濃縮得淺黃色西松烷二萜粗提物。取西松烷二萜粗提物1 g，進(jìn)行硅膠柱層析分離，層析樣品依次用5：1（V：V）和3：1（V：V）石油醚/乙酸乙酯洗脫，收集石油醚/乙酸乙酯（3：1，V：V）洗脫液第二餾分，濃縮后再經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿/丙酮（5：1，V：V）洗脫分離，獲得無色油狀單體化合物，在中國科學(xué)院化學(xué)物理研究所通過核磁共振波譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 人肝癌HepG2細(xì)胞用MEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素+1%鏈霉素雙抗），置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，按100 μL/孔的量接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h后，試驗(yàn)組加入α-CBD，使其終濃度為2.5、5、10、20、40、60、80 mg/L，對(duì)照組加入完全MEM培養(yǎng)基，每一濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后，吸去上清液，然后每孔加入150 μL DMSO，震蕩5 min，用酶聯(lián)免疫測(cè)定儀檢測(cè)波長為570 nm下每孔的吸光度（A）值[13]，并計(jì)算細(xì)胞活力抑制率：

介紹一部研究天然氣產(chǎn)業(yè)的專著：《低碳經(jīng)濟(jì)下中國天然氣產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略》… ……………… 周 鵬（6．封三）

細(xì)胞增殖抑制率=(1-試驗(yàn)組A570/正常對(duì)照A570)×100%。

1.2.3 細(xì)胞集落形成能力檢測(cè) 按1.2.2培養(yǎng)和收集細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)12 h后，根據(jù)MTT檢測(cè)結(jié)果，選擇作用較為明顯的濃度，加入α-CBD，設(shè)空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，采用0.25% 胰酶消化并將細(xì)胞稀釋至100～1000細(xì)胞/mL，接種于培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)2周，吸除培養(yǎng)基，經(jīng)PBS漂洗2遍后，加入10 mL無水甲醇固定10 min，經(jīng)PBS漂洗2遍后，加入10 mL 0.01 mg/L吉姆薩染液染色，拍照并統(tǒng)計(jì)集落形成數(shù)[14]。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 按上述方法培養(yǎng)和收集細(xì)胞，將HepG2細(xì)胞按5×104個(gè)/孔的濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，加入上述培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HepG2細(xì)胞到達(dá)對(duì)數(shù)期后，用含有不同質(zhì)量濃度的α-CBD培養(yǎng)基進(jìn)行全換液處理，同種條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，經(jīng)吉姆薩染色，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察HepG2細(xì)胞的形態(tài)改變[15]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 α-CBD的結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)核磁共振波譜鑒定（圖1），HR-ESI-MSm/z：329.2460 [M+Na]+，分子式為C20H34O3。1H NMR(400 MHz, measured in CDCl3)：δH 1.72 (1H, m, H-1)，5.36 (1H, dd,J= 8.6, 15.7 Hz, H-2), 5.37 (1H, m, H-3), 2.00 (1H, m, H-5α), 2.01 (1H, m, H-5β), 4.49 (1H, m, H-6), 5.36 (1H, d,J= 8.8 Hz H-7), 1.51 (1H, m, H-9α), 1.99 (1H, m, H-9β), 2.02 (2H, m, H-10), 5.04 (1H, m, H-11), 2.13 (2H, m, H-13), 1.68 (2H, m, H-14), 1.54 (1H, m, H-15), 0.83 (3H, d,J=5.8 Hz, H-16), 0.86 (3H, d,J= 5.8 Hz, H-17), 1.36 (3H, s, H-18), 1.71 (3H, s, H-19), 1.56 (3H, s, H-20);13C NMR (100 MHz, measured in CDCl3)：δC46.43 (C-1, CH), 127.83 (C-2, CH), 137.58 (C-3, CH), 72.46 (C-4, C), 52.19 (C-5, CH2), 66.38 (C-6, CH), 130.61 (C-7, CH), 136.90 (C-8, C), 38.88 (C-9, CH2), 23.34 (C-10, CH2), 124.43 (C-11, CH), 133.43 (C-12, C), 36.82 (C-13, CH2), 27.97 (C-14, CH2), 33.02 (C-15, CH), 19.35 (C-16, CH3), 20.66 (C-17, CH3), 30.15 (C-18, CH3), 16.08 (C-19, CH3), 15.01 (C-20, CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，故鑒定化合物為α-CBD。

圖1 α-CBD結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of α-CBD

2.2 α-CBD對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制的影響

MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示（表1），α-CBD在體外對(duì)HepG2細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用。α-CBD處理24 h后，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制較弱；處理48 h 和72 h后，對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制較強(qiáng)，而質(zhì)量濃度大于60 mg/L時(shí)，抑制率變化不明顯。作用48 h、72 h時(shí)，α-CBD對(duì)HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（IC50）分別為26.97、22.82 mg/L。

2.3 α-CBD對(duì)HepG2細(xì)胞集落形成能力的影響

與HepG2細(xì)胞對(duì)照組形成的克隆相比（圖2），處理組HepG2細(xì)胞形成的克隆數(shù)隨α-CBD濃度的增加而減少，20、40、60、80 mg/L濃度下的細(xì)胞克隆形成率分別為66.37%、55.16%、28.39%、0.00%。

表1 α-CBD作用于HepG2細(xì)胞的增殖抑制率比較（n=3）Table 1 Comparison of prolifetation inhibition effects of HepG2 cells after α-CBD treatment

2.4 α-CBD對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果顯示（圖3），對(duì)照組細(xì)胞呈梭形、不規(guī)則多邊形，細(xì)胞貼壁，生長均勻飽滿；試驗(yàn)組HepG2細(xì)胞經(jīng)質(zhì)量濃度為20、40、60 mg/L的α-CBD處理，吉姆薩染色后，細(xì)胞皺縮、變圓、體積縮小，從皿壁脫落，懸浮于培養(yǎng)基中，呈現(xiàn)凋亡形態(tài)。

圖2 α-CBD對(duì)HepG2細(xì)胞克隆形成能力的影響Fig. 2 Effects of α-CBD on colony formation of HepG2 cells

圖3 α-CBD處理48 h對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)變化的影響Fig. 3 Cell morphology changes of HepG2 cells after α-CBD treatment

3 討 論

大多數(shù)抗腫瘤藥物都能夠抑制敏感腫瘤細(xì)胞的增殖，并且其抗腫瘤效果與細(xì)胞在藥物誘導(dǎo)下發(fā)生增殖抑制的活性有關(guān)[17]。因此，細(xì)胞增殖抑制測(cè)定通常作為體外抗腫瘤藥物和臨床腫瘤敏感試驗(yàn)的第一步。MTT比色法、集落形成試驗(yàn)分別從細(xì)胞活力、克隆抑制能力兩方面測(cè)定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制活性。在本試驗(yàn)的MTT比色法中，用IC50值作為衡量藥物的增殖抑制能力的指標(biāo)，數(shù)值越低，表明細(xì)胞對(duì)藥物處理越敏感，而藥物的增殖抑制能力越強(qiáng)。結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度（2.5、5、10、20、40、60、80 mg/L）的α-CBD均對(duì)HepG2細(xì)胞增殖具有抑制作用，相比于24 h，作用48 h、72 h后，增殖抑制效果更為顯著。而α-CBD的IC50值相較紫杉醇等抗腫瘤藥物相比仍然較高[18]，說明抑制效果不如紫杉醇，但仍有進(jìn)一步研究價(jià)值。

通過MTT比色試驗(yàn)，證明α-CBD能夠使細(xì)胞活力降低，進(jìn)一步通過集落形成試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力。費(fèi)洪榮等[19]通過此試驗(yàn)方法測(cè)定了40 μmol/L告達(dá)庭和100 μg/L TRAIL聯(lián)合應(yīng)用能夠明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖，史江穎等[20]證明了谷糠內(nèi)、外殼結(jié)合態(tài)多酚均對(duì)HepG2細(xì)胞有明顯的抑制效果，孫建超等[21]試驗(yàn)結(jié)果表明，5、25、50 μmol/L吳茱萸堿處理HepG2細(xì)胞，集落數(shù)明顯少于對(duì)照組。在本試驗(yàn)中，隨著α-CBD濃度的增加，HepG2細(xì)胞的克隆形成率逐漸降低，說明α-CBD能夠抑制HepG2細(xì)胞的克隆形成能力，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。

惡性腫瘤形成的病理學(xué)基礎(chǔ)是腫瘤細(xì)胞異常增殖、凋亡嚴(yán)重減退而造成的。就細(xì)胞調(diào)控機(jī)制而言，既需拮抗、抑制腫瘤細(xì)胞增殖，又需誘導(dǎo)促使細(xì)胞凋亡[22]。目前，許多抗腫瘤藥物的主要作用機(jī)制之一就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[23]。細(xì)胞凋亡主要的表現(xiàn)之一就是形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察是判斷細(xì)胞凋亡的最基本、最可靠方法[24]。胡琦等[25]用臭牡丹總黃酮、劉麗璇等[26]用丹參酮IIA、劉媛等[27]用海灣扇貝多肽混合物作用HepG2細(xì)胞，形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞皺縮、變圓、體積縮小等凋亡特征。在本試驗(yàn)中，經(jīng)α-CBD作用后，HepG2細(xì)胞發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化與上述文獻(xiàn)中的凋亡形態(tài)一致，表明α-CBD誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生了凋亡。

α-CBD是煙草腺毛分泌物的主要化學(xué)成分，在煙草中含量豐富，具有豐富的原料資源。本研究表明，α-CBD培養(yǎng)基對(duì)HepG2細(xì)胞生長具有較好的抑制作用，具有作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行抗腫瘤藥物創(chuàng)制的潛力，下一步還需應(yīng)用化學(xué)或生物手段通過結(jié)構(gòu)修飾進(jìn)一步增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性并明確其構(gòu)效關(guān)系，為新型抗腫瘤藥物的篩選提供研究基礎(chǔ)，也為煙草活性成分的深度開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

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Isolation and Anti-HepG2 Activity Study of α-cembratriene -diol from Tobacco

MAO Xinxin1,2, HOU Xiaodong1, DU Yongmei1, YUAN Xiaolong1, YAN Peizhen1, DONG Weijie1,2, ZHANG Jixu1,3, WANG Honggang1,3, ZHANG Zhongfeng1*
(1. Tobacco Research Institute of CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China; 3. Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

To investigate the anti-tumour activities of α-2,7,11- cembratriene-4,6 -diol (α-CBD) from tobacco, we isolated α-CBD from tobacco flowers. HepG2 cells were incubated with different concentrations of α-CBDin vitro. The inhibition rate on cell proliferation was determined with methylthiazolyldiphenyl -tetrazolium bromide (MTT) assay and colony formation assay. The change of morphology was observed with inverted microscope after Giemsa’s staining. The results indicated that, α-CBD from tobacco exhibited obvious inhibitive effects on the growth and colony forming rate of HepG2 cells. Typical morphology changes of apoptosis were observed. In summary, α-CBD from tobacco showed anti-tumor effects on HepG2 cells, which would have high value of further development and utilization.

tobacco; α-cembratriene-diol; isolation ; anti-HepG2 activity

TS41+3

1007-5119（2017）03-0080-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.03.014

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)煙草研究所青年科學(xué)基金“煙草西松烷二萜體外抗腫瘤作用研究”（2015B04）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC05）

毛新新（1992-），女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锕δ艹煞?。E-mail：mxxcaas@163.com。*通信作者，E-mail：zhangzhongfeng@caas.cn

2016-09-22

2017-02-04