連 霞，李光來，李東芳，薛國芳，裴宇恒

多效生長因子在骨髓間充質干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化中的表達變化

連 霞，李光來，李東芳，薛國芳，裴宇恒

目的 探討多效生長因子(PTN)在體外誘導成人骨髓間充質干細胞(BMSCs)向神經(jīng)元樣細胞分化中過程不同時間的表達變化，了解多效生長因子是否參與BMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化的機制。方法 以密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法分離成人BMSCs，進行原代和傳代培養(yǎng)，以流式細胞儀鑒定純度。對照組和實驗組對傳代第6代的BMSCs進行誘導分化，誘導后30 min至3 d，觀察細胞形態(tài)并計數(shù)。將分化后細胞采用免疫細胞化學法測定神經(jīng)細胞特異性表面標志神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、微管相關蛋白-2(MAP-2)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達。對誘導前和誘導后3 h、6 h、12 h、24 h、3 d細胞以RT-PCR法測定PTN mRNA表達。結果 BMSCs在接種1 d后黏附貼壁，呈橢圓形或圓形，3 d～5 d后呈梭狀細胞成簇生長，7 d～12 d融合。傳代至第5代～6代可見較為均一的成纖維細胞樣形態(tài)。流式細胞儀檢測結果顯示：細胞表達CD44、CD105，不表達造血干細胞的特異標記CD45，證實其純度。誘導后細胞胞體開始向細胞胞核收縮，出現(xiàn)雙極或多極細胞。12 h變形細胞增多，細長突起相互連接。24 h后細胞變化不明顯。誘導后細胞經(jīng)免疫化學染色顯示：多數(shù)表達NSE(64.79±0.06)%、MAP-2(60.05±0.09)%，而未檢測到GFAP。實驗組誘導后細胞不同時間點PTN mRNA的表達不同(P<0.01)。 誘導后12 h～24 h PTN mRNA表達最高。結論 建立成人BMSCs培養(yǎng)增殖體系基礎上誘導BMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化，誘導過程細胞有外觀形態(tài)變化，同時表達神經(jīng)細胞特異性標志物NSE和MAP-2。誘導后BMSCs與形態(tài)改變相似，向神經(jīng)元樣細胞分化的不同時間點，有PTN mRNA表達變化，提示PTN可能參與BMSCs向神經(jīng)元樣細胞的分化。

多效生長因子；骨髓間充質干細胞；神經(jīng)元樣細胞；神經(jīng)元特異性烯醇化酶；微管相關蛋白-2；膠質纖維酸性蛋白

骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，BMSCs)是具有多向分化潛能的一類干細胞，在組織工程、細胞移植、基因治療等領域有廣闊的應用前景，其向神經(jīng)細胞的分化為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病帶來新思路，成為干細胞的研究熱點之一[1]。目前經(jīng)誘導分化后的細胞與正常神經(jīng)細胞功能有較大差別。目前對其向神經(jīng)細胞分化的機制仍不明確，故不能確立穩(wěn)定的誘導方法。本實驗研究BMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化中不同時間點多效生長因子(pleiotrophin，PTN)mRNA的表達變化，以了解其是否參與影響B(tài)MSCs向神經(jīng)元樣細胞的分化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 骨髓采集于健康成年志愿捐髓者；DMEM培養(yǎng)基(Gibicol公司)；胎牛血清(FBS)(杭州四季青公司)；BHA(中國藥物試劑公司)；BME、二甲基亞砜(DMSO)、胰酶(AMRESCO公司)；淋巴細胞分離液(上海試劑二廠)、兔抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、微管相關蛋白-2(MAP-2)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、羊抗兔二抗、鏈霉素和素-生物素復合物(SABC)試劑盒(博士德公司)；寡核苷酸引物序列(大連寶生物有限公司合成)；RNA PCR Kit(AMV)Ver.2.1(TKaRa公司)；CO2培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡、超靜工作臺、流式細胞儀(Kurtz公司)；Kodark凝膠數(shù)字掃描分析系統(tǒng)等；PTC-100型PCR儀。

1.2 BMSCs分離培養(yǎng) 以髂后上棘行骨髓穿刺術抽取4 mL肝素化骨髓，加胎牛血清制成懸液，離心棄上清去除脂肪，以1.073×103g/mL淋巴細胞分離液梯度分離，吸取單個核細胞層，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次～3次后接種于25 mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為加20%胎牛血清的DMEM，含有100 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、2 mmol/L L-谷胺酰胺。接種細密度為5×106/L；溫度37 ℃、飽和濕度為5%CO2。接種后3 d～4 d第一次換培養(yǎng)液，之后每3 d～4 d換液1次。應用倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長。

1.3 BMSCs的傳代培養(yǎng) 細胞生長至90%以上融合后棄區(qū)上清液，以無鈣鎂的PBS液洗滌2次～3次，加入1 mL～2 mL消化液[0.25%胰酶/0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)]，37 ℃溫度下消化3 min～5 min，以吸管緩慢捶打至細胞完全脫落，離心棄去上清液后用培養(yǎng)液重懸細胞，捶打均勻，按1∶3比例分瓶進行培養(yǎng)。繼續(xù)觀察細胞形態(tài)和其生長的速度。

1.4 流式細胞儀檢測BMSCs純度 選取第5代細胞進行純度鑒定，棄培養(yǎng)液，以PBS液洗滌1次～2次，加入37 ℃溫度的消化液1 mL～2 mL 1 min～2 min，加入完全培養(yǎng)基終止消化，用吸管捶打成單細胞懸液，棄上清液后將細胞沉淀用PBS液再洗滌一遍后，制成單細胞PBS懸液300 μL。將細胞懸液平均分至5支Ep管中，每支標本計數(shù)10×105個細胞，取四管分別加入CD44、CD45、CD105，一管為空白對照。給予4 ℃，避光培育30 min后以PBS沖洗1次，置入冰盒，進行流式細胞儀檢測，測試3次，結果取平均值。打印結果。

1.5 BMSCs體外誘導分化 取第6代細胞以4×105/mL的密度接種于放置消毒蓋玻片的6孔板內(nèi)培養(yǎng)成單層細胞。實驗組用完全DMEM(含1 mmo lBME)預誘導24 h[2]，對照組為無誘導劑的完全DMEM。1 d后去除培養(yǎng)液，PBS洗滌2次～3次。實驗組以含200 μmol/L BHA+2%DMSO的無血清DMEM作為培養(yǎng)液進行誘導，對照組不加誘導劑。誘導后30 min至4 d，觀察細胞的形態(tài)變化并計數(shù)目。分組詳見表1。

表1 BMSCs誘導分組及誘導劑

1.6 誘導后神經(jīng)元樣細胞的鑒定

1.6.1 免疫細胞化學法鑒定及分化細胞計數(shù) 誘導后12 h，以4%的多聚甲醛固定附著于蓋玻片上細胞，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，正常羊血清封閉，之后分組加入抗NSE、MAP-2和GFAP抗體(1∶200)，4 ℃過夜。以PBS洗滌后加入生物素化羊抗兔二抗，室溫20 min后加SABC，室溫下20 min后以新配制的3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)液反應5 min～30 min，顯微鏡下觀測細胞的顏色。以5個方位分別取2個不重復的視野計算總細胞數(shù)及抗原表達率(NSE或MAP-2染色陽性細胞率)。

1.6.2 RT-PCR法檢測PTN mRNA的表達 分別在誘導前和誘導后3 h、6 h、12 h、24 h、3 d檢測PTN mRNA的表達。提取總RNA，以甲醛變性凝膠電泳，純度檢測后進行RT-PCR檢測，按試劑盒說明進行，內(nèi)參照為GADPH，總體積50 μL，反轉錄之后進行PTN的擴增，擴增片段長238 bp，擴增條件：94 ℃變性2 min，94 ℃ 30 s，57.5 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)。擴增好的產(chǎn)物進行電泳，最后分析結果。

2 結 果

2.1 BMSCs的分離和原代培養(yǎng) 細胞接種1 d后開始少量黏附貼壁，呈圓或橢圓形，折光性好。3 d后開始出現(xiàn)變形細胞，呈多邊形或梭形，并向不同方向伸出突起。之后貼壁細胞呈集落樣生長增殖，類似成纖維細胞，突起粗細不等、長短不一。8 d～10 d細胞呈集簇狀，中心放射狀融合，周邊細胞相對分散，輪廓清晰，形態(tài)不完全一致。至15 d～20 d可鋪滿瓶底，集落中心細胞增殖明顯，周圍細胞完全融合，輪廓不清，似毛玻璃樣。詳見圖1。

圖1 第16天原代培養(yǎng)(200×)

2.2 BMSCs的擴增培養(yǎng) 傳代中，消化細胞1 min后近一半細胞變圓，待80%變形時終止消化。傳代后第2天細胞逐漸恢復生長，潛伏期縮短，貼壁生長速度增快，給予換液去除懸浮死亡的細胞。第4天～第6天再次長滿瓶底，分布較原代均勻，仍呈集落狀生長，大小形態(tài)同原代細胞一致(詳見圖1)。1代、2代時可見少量圓形細胞，至4代～6代細胞純化度高，形態(tài)比較均一，融合后細胞折光均勻，高倍鏡下可見胞體內(nèi)微小顆粒。傳至15代以上，細胞生長速度減慢，呈逐漸衰老狀態(tài)，胞體大，不透亮。高倍鏡下可見胞體顆粒增多，空泡出現(xiàn)至懸浮死亡。詳見圖2。

圖2 第5天BMSCs原代培養(yǎng)(200×)

2.3 流式細胞儀鑒定結果 經(jīng)流式細胞儀檢測，骨髓間充質干細胞表面標記結果為CD44(+)、CD105(+)、CD45(-)，表明BMSCs的純度相對較高。詳見圖3。

BMSCs CD44(+) BMSCs CD45(-) BMSCs CD105(+)

2.4 BMSCs誘導分化后的形態(tài)變化 誘導后的細胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變，胞體開始向細胞核收縮；誘導3 h后細胞胞體成圓形，出現(xiàn)雙極或多極細胞，折光性增強。12 h后變形細胞增多，細胞突起增長，細胞間細長突起可相互交織，形成網(wǎng)絡。誘導后1 d，部分細胞呈現(xiàn)似神經(jīng)元的細胞形態(tài)，之后變形趨勢逐漸緩慢，至誘導后3 d懸浮死亡細胞開始增多。對照組仍為呈纖維樣細胞形態(tài)，未見細胞形態(tài)改變。詳見圖4、圖5。

圖4 實驗組誘導12 h BMSCs(300×)

圖5 實驗組誘導24 h BMSCs(600×)

2.5 兩組BMSCs誘導后12 h神經(jīng)細胞特異性抗原表達率 顯微鏡下觀察兩組NSE、MAP-2及GFAP染色陽性細胞數(shù)，實驗組誘導后12 h細胞免疫化學染色顯示，大部分絕大多數(shù)形態(tài)改變的細胞均表達神經(jīng)元特異性標志NSE、MAP-2，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而未檢測到GFAP表達，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義。詳見表2、圖6、圖7。

表2 兩組BMSCs誘導后12 h神經(jīng)細胞特異性抗原表達率比較(±s) %

圖7 實驗組誘導12 h免疫細胞化學檢測MMP-2表達

2.6 兩組BMSCs誘導后不同時間點PTN mRNA表達比較 實驗組PTN和GADPH mRNA RT-PCR產(chǎn)物電泳結果，詳見圖8、圖9。實驗組PTN mRNA的表達與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。實驗組BMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化過程中的不同時點PTN mRNA的表達不同，誘導后12 h表達基本達高峰，持續(xù)至24 h表達仍較強。至誘導后3 d表達下降。詳見表3。PTN mRNA的表達變化與細胞形態(tài)的改變是一致的。

注：1為誘導前；2為誘導后3 h；3為誘導后6 h；4為誘導后12 h；5為誘導后24 h；6為誘導后3 d。

圖8 實驗組PTN RT-PCR電泳圖

圖9 實驗組GADPH RT-PCR電泳圖

表3 兩組BMSCs誘導后不同時間點PTN mRNA表達比較(±s)

3 討 論

BMSCs的多向分化潛能使其在組織工程、細胞移植、基因治療等領域有較為廣闊的應用前景。Woodbury[2]在一定條件下將BMSCs誘導為神經(jīng)元樣細胞，之后嘗試不同的誘導方法，但至今誘導分化后的細胞在功能上與正常神經(jīng)細胞有較大差距，對其分化機制未充分了解，故而不能建立明確穩(wěn)定的誘導方法。

目前認為BMSCs的跨系分化基礎有可能為轉分化[3]現(xiàn)象，在分子水平上，表現(xiàn)為關鍵發(fā)育基因表達的改變。因此確定其轉分化的關鍵基因至關重要。Jori等[4]發(fā)現(xiàn)RB和RB2/P130基因對BMSCs向神經(jīng)系細胞分化中起一定作用。RB2/P130影響細胞的一般特性，而RB則促進BMSCs向膽堿能神經(jīng)元分化。Woodbury等[5]研究發(fā)現(xiàn)BMSCs分化為的神經(jīng)元樣細胞可以表達TOAD-64、觸突素，微管蛋白(β-tubulinIII)，一種微管相關蛋白(tau)，神經(jīng)絲-M(neurofilament-M)等基因[5]。有研究也發(fā)現(xiàn)，在成人BMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化中有褪黑素受體MT1亞型的表達[6]。

1990年Li等[7]從牛子宮分離出一種肝素結合蛋白，有促進成纖維細胞有絲分裂的作用。 這種蛋白以前稱為肝素結合樣生長因子-8，因其具有多種功能而被重新命名為多效生長因子 。研究認為PTN屬高度保守的基因家族，其表達產(chǎn)物 PTN可啟動培養(yǎng)的胎鼠腦細胞軸突生長發(fā)育，在神經(jīng)組織的發(fā)育和/或維持中起一定作用[8]。 研究顯示PTN在癲癇發(fā)作、腦損傷、腦退行性變?nèi)缗两鹕?、亨廷頓病、多發(fā)性硬化和中風表達均有增高，有神經(jīng)保護作用[9-10]。在神經(jīng)發(fā)育中，PTN表現(xiàn)為時空分布的表達并與神經(jīng)上皮源性的神經(jīng)元和膠質祖細胞的發(fā)育遷移相關聯(lián)，在胚胎時期表達開始增高，直至在腦架構形成時即出生時達到高峰，此后便逐漸下降，直到成體時僅能在海馬、嗅球、垂體和參與皮質之間連接的新皮質以及Schwann細胞中發(fā)現(xiàn)[11]。PTN在發(fā)育過程中的這種表達模式反映它對生長發(fā)育和分化的重要作用。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，PTN可促進胚胎神經(jīng)元的分化和神經(jīng)突的生長，并可促進成纖維細胞的分裂增殖[8]。Li等[12]研究認為PTN基因在腦中和間充質來源的組織中是高表達，并是受發(fā)育調(diào)控的。它和MK及RI-HB基因基本類似，這兩種基因也是發(fā)育調(diào)節(jié)的并能被維A酸(RA)所誘導。Raulais等[13]以RA作用P19細胞后，發(fā)現(xiàn)PTN表達明顯增高。而Li等[12]以血小板衍生生長因子(PDGF)刺激NIH3T3細胞后PTN mRNA表達比以RA刺激后增高更為明顯，以此認為PTN是PDGF誘導的細胞因子家族的新成員。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，PTN可促進胚胎神經(jīng)元的分化和神經(jīng)突的生長[14]。故PTN也被稱為軸突生長刺激因子(neurite outgrowth- promoting factor)。

Furuta等[15]檢測神經(jīng)干細胞表達PTN及其受體N-syndecan、PTP和ALK的mRNA，表明在神經(jīng)干細胞上存在PTN信號傳導系統(tǒng)，并對神經(jīng)干細胞的分化有重要作用。那么作為間充質細胞的MSCs，在其向神經(jīng)系細胞分化中是否有PTN表達和PTN信號傳導的發(fā)生。

因此本課題在Woodbury體外誘導體系的基礎上，觀察BMSCs向神經(jīng)元樣細胞誘導分化過程中不同時間點PTN mRNA的表達變化，結果顯示其與細胞形態(tài)的變化相呼應，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。誘導后12 h PTN mRNA表達已達峰值并持續(xù)至24 h，均高于其他組，但差異無統(tǒng)計學意義。而細胞形態(tài)的改變也是在12 h～24 h最明顯，故BMSCs在其向神經(jīng)系細胞分化中PTN可能參與調(diào)控細胞分化，對細胞變形，突起延伸及特異性酶的表達有一定作用。為進一步了解BMSCs分化的具體機制，分析BMSCs分化過程中的主要調(diào)控基因和信號傳導通路，特別是不同發(fā)育階段決定BMSCs分化方向的關鍵基因提供一些線索。若分化過程中PTN確實有表達的變化，那么其上下游的信號傳遞又是怎樣的，通過調(diào)控其表達量是否能促進BMSCs向神經(jīng)系細胞的分化則是需要進一步研究。

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(本文編輯薛妮)

The Expression of Pleiotrophin in the Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Neuron-like Cells in Vitro

Lian Xia，Li Guanglai，Li Dongfang，Xue Guofang，Pei Yuheng

The Second Hospital，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Objective To study the expression of pleiotrophin (PTN) mRNA in the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) into neuron-like cells in vitro，and investigate the mechanism.Methods Human BMSCs were isolated primarily from bone marrow of adult volunteers’ iliac and purified sterilely with gradient centrifugation.The low-density cells including BMSCs were cultivated and purified by passage control.We observed the growth status of BMSCs，and identity the immunological characteristic phenotype of CD45，CD44 and CD105 by using FACS.The 6th passage of BMSCs were planted into plastic culture flask and induced.The control group did not receive any induced treatment.We observed the morphology change of BMSCs，after the induction 6 hours，neuron-specific enolase (NSE)，microtubule-associated protein-2(MAP-2) and glial fibrillary acidic protein (GFAP)，which were neuron marker were detected by using immunocytochemistry method.The express of PTN mRNA was detected by RT-PCR before induction and at 3 h，6 h，12 h，24 h，3 d after induction.Results The BMSCs were cultivated primarily and following passaged successfully.The living behavior of BMSCs from passage four to passage six were stable.Flow cytometry analysis showed that the cells were positive for CD44 and CD105 receptor，in contrast，negative for CD45 receptor，which demonstrated the purity of BMSCs.The treatment protocols induced BMSCs to differentiate into neuron-like cells，Which expressed NSE and MAP-2 (the express rate were 64.79%±0.06% and 60.05%±0.09%)，but did not express GFAP.PTN mRNA was detected to expresse after induction，and from 12 to 24 hours after induction，the expression were highest.After three days，the expression was difficult to be detected.Conclusion The marrow mesenchymal stem cells could be obtained and purified in vitro，and the amplification was stable in our experimental conditions.After being induced，BMSCs could differentiate into neural like cells with the transformation of morphology and the expression of NSE and MAP-2，the same characters which the true neuron cells have.The expression of PTN mRNA had the same change with morphology after the induction，which indicated PTN maybe take a part of the induction.

pleiotrophin； bone marrow mesenchymal stem cells；neuron-like cells； neuron-specific enolase；microtubule-associated protein-2；glial fibrillary acidic protein

山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院(太原 030001)，E-mail：alianxia@126.com

信息：連霞，李光來，李東芳，等.多效生長因子在骨髓間充質干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化中的表達變化[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(11)：1325-1329.

R329.2 R289.9

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.11.010

1672-1349(2017)11-1325-05

2016-08-01)