武鴻儒，李 興，高曉芳，韓雪鴻，劉 晶

球形脂聯(lián)素對(duì)糖尿病心肌病大鼠心臟保護(hù)作用的研究

武鴻儒，李 興，高曉芳，韓雪鴻，劉 晶

目的 觀察球形脂聯(lián)素(gAd)對(duì)糖尿病心肌病(DCM)的影響，并探討其可能作用機(jī)制。方法 30只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠選取10只作為正常對(duì)照組(A組)，余20只建造糖尿病心肌病模型，造模成功后大鼠隨機(jī)分為陽(yáng)性對(duì)照組(B組)、球形脂聯(lián)素治療組(C組)。C組大鼠每日給予球形脂聯(lián)素治療。治療8周后，采用蘇木素伊紅(HE)染色法觀察大鼠心肌組織大體形態(tài)，免疫組化法檢測(cè)大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、Smad3、Smad7含量，原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。結(jié)果 HE染色示：B組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂；C組大鼠心肌細(xì)胞排列較B組整齊。免疫組化結(jié)果示：Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)較A組、C組增多(P<0.05)；Smad7蛋白表達(dá)較A組、C組減少(P<0.05)。TUNEL結(jié)果：B組凋亡細(xì)胞數(shù)較A組、C組增加(P<0.05)。結(jié)論 gAd可能通過(guò)降低心肌間質(zhì)纖維化和減少心肌細(xì)胞凋亡兩方面保護(hù)心肌組織。

糖尿病心肌病；球形脂聯(lián)素；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；纖維化；凋亡

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病的主要心血管并發(fā)癥之一，可增加糖尿病病人的死亡率。脂聯(lián)素(APN)是體內(nèi)一種調(diào)節(jié)能量代謝的胰島素敏感性激素，已發(fā)現(xiàn)在糖尿病、心血管病病人體內(nèi)脂聯(lián)素含量減少，現(xiàn)已提出低循環(huán)水平脂聯(lián)素為心血管疾病的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素對(duì)心臟具有保護(hù)作用，本研究旨在觀察球形脂連素(gAd)對(duì)糖尿病心肌病心肌組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)/Smads通路及細(xì)胞凋亡的影響，探討其對(duì)糖尿病大鼠心肌的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)sigma公司，gAd購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司，兔抗大鼠抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠30只，體重180 g～200 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。高糖高脂飼料由北京科澳協(xié)力有限公司提供，普通飼料由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 模型建立及分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(A組，n=10)與造模組(n=20)，分別給予普通飼料和高糖高脂料喂養(yǎng)。8周后，造模組給予空腹一次性腹腔內(nèi)推注1%STZ 30 mg/kg；A組經(jīng)腹腔內(nèi)推注等量檸檬酸-檸檬酸鈉鈉緩沖液。72 h后，尾靜脈測(cè)2次隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，且出現(xiàn)多飲、多食、多尿、精神萎靡等現(xiàn)象為造模成功[2]，期間死亡3只。繼續(xù)喂養(yǎng)12周[3]后，造模組隨機(jī)分為陽(yáng)性對(duì)照組(B組，n=8)、gAd治療組(C組，n=9)。C組給予10 μg/kg gAd每日腹腔注射，A組與B組每日腹腔注射同等劑量生理鹽水。8周后，取大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟 gAd干預(yù)8周后，空腹稱重，胸腹備皮后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，暴露腹腔，腹主動(dòng)脈取血后一部分立即檢測(cè)糖化血紅蛋白(HbA1c)，一部分離心后取上清-70 ℃冰箱保存。剖開(kāi)胸腔，取出心臟，沖洗后稱重，左心室同一部位取組織，放入保存液中，4 ℃過(guò)夜后制作石蠟切片。

1.5 生化指標(biāo)檢測(cè) 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖(FBG)和HbA1c。

1.6 心肌組織形態(tài)觀察 蠟塊切片，行HE染色，光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。

1.7 免疫組織化學(xué)分析 心肌組織Smad3、Smad7、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白免疫組織化學(xué)分析：蠟塊切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，3%H2O2阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，抗原修復(fù)，滴羊血清封閉液孵育30 min甩干，后滴加1∶50稀釋的兔抗大鼠Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、Smad3、Smad7抗體4 ℃冰箱過(guò)夜，再滴加二抗孵育30 min，洗片后，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液20 min，再洗片，加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染10 s，脫水、透明、封片。Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，測(cè)量灰度值。

1.8 TUNEL染色觀察凋亡 采用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)心肌組織切片進(jìn)行熒光染色，在熒光顯微鏡下細(xì)胞核顯示紅色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。TUNEL凋亡指數(shù)計(jì)算(AI)：AI=TUNEL標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。選擇細(xì)胞分布較均勻的高倍視野計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠一般情況比較 8周后，與A組相比，B組大鼠FBG和HbA1c升高，體重下降，心重指數(shù)(HW/BW)明顯增加，gAd干預(yù)后C組較B組大鼠FBG降低、體重增加，HW/BW減小。詳見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠一般情況比較(±s)

2.2 心肌組織形態(tài)學(xué)分析 光鏡下可見(jiàn)A組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，胞核排列整齊；B組大鼠細(xì)胞大小不一，形態(tài)紊亂，核呈多形性，細(xì)胞間質(zhì)增多，心肌細(xì)胞有斷裂現(xiàn)象；C組大鼠心肌細(xì)胞有病態(tài)改變，但較B組減輕。詳見(jiàn)圖1。

A組 B組 C組

圖1 心肌組織形態(tài)學(xué)分析(HE染色，×200)

2.3 3組大鼠心肌組織Smad3、Smad7、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白免疫組化分析比較 B組大鼠Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)較A組增多，Smad7蛋白表達(dá)較A組減少；gAd干預(yù)后C組Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)較B組減少，Smad7蛋白表達(dá)較B組增多。詳見(jiàn)表2、圖2～圖5。

表2 3組大鼠心肌組織Smad3、Smad7、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白免疫組化分析比較(±s)

A組 B組 C組

A組 B組 C組

A組 B組 C組

A組 B組 C組

2.4 3組大鼠心肌細(xì)胞凋亡表達(dá) B組大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)較A組增加，C組大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)較B組減少，A組AI為16.49±0.83，B組AI為43.88±3.27，C組AI為23.43±1.77。A組與B組、C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖6。

A組：細(xì)胞凋亡較少

B組：大量細(xì)胞凋亡

C組：細(xì)胞凋亡數(shù)量較B組減少

3 討 論

DCM是指發(fā)生于糖尿病病人除冠心病、原發(fā)性心肌病、心臟瓣膜病及高血壓性心臟病外，以心肌細(xì)胞肥大、心肌微血管病變、心肌代謝紊亂、心肌間質(zhì)增生及纖維化為主要病理變化，以早期心臟舒張、收縮功能障礙，晚期心力衰竭為其臨床癥狀的一種疾病[4]。糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，有研究認(rèn)為左室肥厚、心肌間質(zhì)纖維化、心肌細(xì)胞糖脂代謝紊亂、小血管病變、心臟自主神經(jīng)調(diào)節(jié)異常、胰島素抵抗、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、線粒體損傷、氧化應(yīng)激、細(xì)胞異常凋亡等是重要的促進(jìn)因子，參與其發(fā)生和發(fā)展[5]。

TGF-β1是最有力和普遍存在的促纖維化細(xì)胞因子，Smad3和Smad7是其下游兩個(gè)重要介質(zhì)[6]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，作為T(mén)GF-β1的下游信號(hào)分子，Smads蛋白在多種心臟病理生理狀態(tài)下均可出現(xiàn)活化和表達(dá)增加[7]。TGF-β1活化后，TGF-β1受體I(TβRI)磷酸化Smad2和Smad3，促進(jìn)纖維化的發(fā)生和發(fā)展；而Smad7可結(jié)合TβRI并抑制Smad2/3磷酸化阻斷TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)阻止TGF-β1/Smad2/3信號(hào)[8]。Goyall等[9]發(fā)現(xiàn)慢性餐后高血糖癥，高胰島素血癥和胰島素抵抗等代謝異?？烧T導(dǎo)TGF-β1的過(guò)表達(dá)，TGF-β1通過(guò)與Ⅱ型受體結(jié)合上調(diào)組織中膠原蛋白的表達(dá)，在心肌主要是Ⅰ型膠原蛋白，這個(gè)過(guò)程參與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展。有研究認(rèn)為高血糖促進(jìn)心肌中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的形成，導(dǎo)致間質(zhì)纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致左室舒張功能障礙[10]。心肌中Ⅰ型膠原以粗纖維形式存在，決定心肌的抗張力能力[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B組大鼠心肌中Ⅰ型膠原蛋白含量多于A組大鼠，也證實(shí)上述說(shuō)法。本實(shí)驗(yàn)B組大鼠心重指數(shù)增大，TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、Smad3表達(dá)增加，Smad7表達(dá)減少，提示TGF-β1/Smads信號(hào)通路活化可促進(jìn)糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展。

脂聯(lián)素(adiponectin，APN)又稱Acrp30，是一種主要由脂肪細(xì)胞合成和分泌的脂肪細(xì)胞因子。有研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、骨骼肌成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞等均可分泌脂聯(lián)素[12]。目前發(fā)現(xiàn)其具有改善胰島素抵抗、抗炎、抗纖維化、抗凋亡、抗動(dòng)脈粥樣硬化等生物學(xué)效應(yīng)[13]。在人類血漿中存在兩種APN活性形式分別為球形結(jié)構(gòu)域(gAd)和全長(zhǎng)型結(jié)構(gòu)域(fAd)。gAd可由fAd經(jīng)彈性蛋白酶裂解而產(chǎn)生，gAd是APN實(shí)現(xiàn)生物學(xué)效應(yīng)的主要區(qū)域[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中，外源性gAd干預(yù)后C組大鼠心重指數(shù)下降，Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、Smad3表達(dá)較B組減少，Smad7表達(dá)增加，提示gAd可通過(guò)上調(diào)Smad7表達(dá)，減少Smad3表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號(hào)通路，減輕心肌纖維化來(lái)改善糖尿病心肌病。此結(jié)果與前期離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[16]。

TUNEL細(xì)胞凋亡染色結(jié)果可見(jiàn)B組大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加，外源性gAd干預(yù)后凋亡細(xì)胞減少，提示gAd可通過(guò)抗心肌細(xì)胞凋亡對(duì)糖尿病心肌病變起到保護(hù)作用?？赡艿淖饔脵C(jī)制為：①細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-9，從而激活caspase-3效應(yīng)物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，抗凋亡因子B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2可干擾細(xì)胞色素C釋放和抑制凋亡進(jìn)展。作為對(duì)凋亡刺激的回應(yīng)，促凋亡因子Bcl同源相關(guān)蛋白(Bax)通過(guò)過(guò)表達(dá)與構(gòu)象變化對(duì)抗Bcl-2的激活，刺激細(xì)胞色素C釋放和其他凋亡蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，最終引發(fā)凋亡。gAd可誘導(dǎo)腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)表達(dá)，激活其磷酸化，上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax，進(jìn)而起到抗凋亡作用[17]。②gAd可通過(guò)激活神經(jīng)酰胺酶，降低胞內(nèi)神經(jīng)酰胺含量，抑制蛋白激酶C(PKC)和蛋白磷酸酶2(PP2A)活化，從而激活蛋白激酶B(Akt/PKB)通路，進(jìn)而減少心肌細(xì)胞凋亡；gAd還可能通過(guò)激活神經(jīng)酰胺酶促進(jìn)抗凋亡代謝產(chǎn)物磷酸鞘氨醇(S1P)合成而抑制心肌細(xì)胞凋亡[18]。③gAd通過(guò)Akt依賴信號(hào)通路抑制非正常壓力反應(yīng)引起的細(xì)胞凋亡，且gAd可通過(guò)抑制腫瘤壞死因子(TNF)α在心肌細(xì)胞中的表達(dá)減少凋亡[19]。

綜上所述，gAd可能通過(guò)抗心肌間質(zhì)纖維化和抗心肌細(xì)胞凋亡兩方面減輕糖尿病心肌病變，對(duì)糖尿病心肌病具有一定的保護(hù)作用。

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(本文編輯薛妮)

The Cardioprotection of Globular Adiponectin on Diabetic Cardiomyopathy in Rats

Wu Hongru，Li Xing，Gao Xiaofang，Han Xuehong，Liu Jing

The Second Hospital，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Liu Jing

Objective To observe the effect of globular adiponectin (gAd) on diabetic cardiomyopathy (DCM) and to explore its possible mechanism.Methods Thirty male Sprague-Dawley (SD) rats were divided into normal control group (group A)，and 20 rats were treated with diabetic cardiomyopathy model，the rats were randomly divided into positive control group (group B) and spherical adiponectin group (group C).Rats in group C were given globular adiponectin daily.After 8 weeks of treatment，the morphology of myocardium was observed by hematoxylin-eosin (HE) staining.The expression of type Ⅰ collagen，transforming growth factor-β1 (TGF-β1)，Smad 3 and Smad 7 in myocardium of rats were detected by immunohistochemistry.The apoptosis of myocardium was detected by TUNEL.Results HE staining showed that the arrangement of myocardial cells in group B was disturbed，and the arrangement of cardiomyocytes in group C was more neat than group B.The expressions of type Ⅰ collagen，TGF-β1 and Smad 3 protein in group B was higher than that in group A and group C (P<0.05).The expression of Smad 7 protein in group B was lower than that of group A and group C (P<0.05).TUNEL results showed that the number of apoptotic cells in group B was higher than that of group A and group C (P<0.05).Conclusion Globular adiponectin may protect cardiomyocytes by alleviating myocardial interstitial fibrosis and cardiomyocyte apoptosis.

diabetic cardiomyopathy；globular adiponectin；transforming growth factor-β1；fibrosis；apoptosis

山西省衛(wèi)生計(jì)生委科研項(xiàng)目(No.2014040)；山西省國(guó)際科技合作項(xiàng)目(No.2015081031)

山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院(太原 030001)

劉晶，E-mail：40574592@qq.com

信息：武鴻儒，李興，高曉芳，等.冬蟲(chóng)夏草對(duì)腦缺血防治作用的研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(11)：1319-1327.

R587.1 R255.4

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.11.009

1672-1349(2017)11-1319-06

2016-12-25)