葉 明，吳 輝

· 基礎醫(yī)學論著·

尼可地爾保護大鼠缺血再灌注心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激機制的研究

葉 明，吳 輝

目的 觀察尼可地爾對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應標志因子表達的影響。方法 48只SD大鼠隨機分為6組：平衡灌注(Bal)組、平衡灌注+尼可地爾預處理(Bal+Nic100)組、缺血再灌注(I/R Ctrl)組、缺血再灌注+尼可地爾30 μmol/L預處理(Nic 30)組、缺血再灌注+尼可地爾100 μmol/L預處理(Nic 100)組、缺血再灌注+尼可地爾300 μmol/L預處理(Nic 300)組。采用Langendorff 灌流裝置，建立離體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，分別給予不同劑量的尼可地爾預處理。采用多道生理信號采集系統(tǒng)記錄分析各項心功能參數(shù)：左心室收縮峰壓(LVPSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室等容期壓力最大變化速率(±dp/dt max)、心率(HR)等，并計算左室發(fā)展壓(LVDP=LVPSP-LVEDP)；采用LDH檢測試劑盒測定冠脈流出液中的乳酸脫氫酶(LDH)活性；氯化三苯基四氮唑(TTC)染色檢測心肌梗死面積；Real-Time PCR檢測心肌組織中GRP78及CHOP的mRNA表達水平；Western blot檢測心肌組織中GRP78、CHOP的蛋白表達水平。結(jié)果 與I/R Ctrl組比較，尼可地爾預處理可顯著改善大鼠離體缺血再灌注心臟的各項心功能指標。與平衡灌流期比較，I/R Ctrl組再灌注120 min后冠脈流出液中的LDH活性水平顯著上升，而尼可地爾預處理各組冠脈流出液LDH活性水平顯著低于I/R Ctrl 組。與I/R Ctrl組比較，尼可地爾預處理各組心肌梗死面積顯著縮小。與Bal 組比較，I/R Ctrl組心肌組織中的GRP78及CHOP mRNA及蛋白表達水平顯著上調(diào)，而與I/R Ctrl組比較，尼可地爾預處理可顯著降低GRP78及CHOP mRNA及蛋白表達水平，且尼可地爾作用均呈劑量依賴性。結(jié)論 在大鼠離體心肌缺血再灌注損傷模型中，尼可地爾預處理可呈劑量依賴性地減輕心肌細胞損傷，促進缺血再灌注后心臟功能的恢復，還可抑制心肌缺血再灌注誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。

缺血再灌注損傷；尼可地爾；心??；左心室舒張末壓；左心室等容期壓力最大變化速率；心率；乳酸脫氫酶；78 kPa糖調(diào)節(jié)蛋白；C/EP源蛋白

隨著經(jīng)皮冠狀動脈介入治療、冠脈旁路移植術等各種血運重建技術的不斷完善及多種新型抗血栓藥物的應用，增強冠心病病人的治療效果。恢復心肌血液再灌注過程中繼發(fā)的心肌損傷嚴重減弱血運重建治療效果，稱為心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)損傷。多種機制參與心肌I/R損傷的病理生理過程，包括氧化應激、細胞內(nèi)鈣超載、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放、炎癥反應等[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)及其介導的細胞凋亡在心肌I/R損傷的發(fā)生發(fā)展中具有關鍵作用[2]。尼可地爾是臨床常用的抗心絞痛藥物，基礎及臨床研究均已證實其可有效減輕急性心肌梗死后的心肌損傷。在動脈粥樣硬化小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，尼可地爾可顯著降低ERS反應標志因子78kDa糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose regulated protein 78kDa，GRP78)和C/EBP同源蛋白(C/EBP- homologous protein，CHOP)的表達水平[3]。尼可地爾是否影響心肌I/R誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其介導的心肌細胞損傷尚不清楚。鑒于此，本研究通過建立離體大鼠心肌I/R損傷模型，觀察尼可地爾預處理對缺血再灌注心肌的保護作用，及其對缺血再灌注誘發(fā)的心肌細胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性(Sprague-dawley SD)大鼠48只，8周齡，SPF級，體重250 g～280 g，分籠飼養(yǎng)于清潔、恒溫的實驗環(huán)境中，允許自由活動，自由取食飲水。將大鼠適應性喂養(yǎng)5 d后進行實驗。采用隨機數(shù)字表法將48只大鼠隨機分為6組(每組8只)：平衡灌注(Bal)組，平衡灌注+尼可地爾預處理(Bal+Nic100)組，缺血再灌注(I/R Ctrl)組，缺血再灌注+尼可地爾30 μmol/L預處理(Nic 30)組，缺血再灌注+尼可地爾100 μmol/L預處理(Nic 100)組，缺血再灌注+尼可地爾300 μmol/L預處理(Nic 300)組。

1.2 主要試劑及儀器 尼可地爾(sigma-aldrich公司)、GAPDH抗體(sigma-aldrich公司)、GADD153/CHOP抗體(Abcam公司)、GRP78抗體(Abcam公司)、HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)、picopure RNA提取試劑盒(Arcturus Bioscience)、Realtime PCR Master Mix(Toyobo公司)；GAPDH管家基因(Sangon公司)、PCR引物及寡核苷酸序列(Sangon公司)、凝膠成像系統(tǒng)(Biotop公司)、實時熒光定量PCR儀(Agilent公司)、PowerLab生理信號采集系統(tǒng)(AD Instruments公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型建立及實驗方案 1 000 IU/kg體重的肝素鈉經(jīng)腹腔注射，20 min后經(jīng)腹腔注射2%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉。將大鼠固定于仰臥位，開胸，剪開心包，迅速將心臟取出，置于4 ℃的改良K-H液中，擠壓心臟排出心腔殘余血液，將多余組織修剪掉，把充滿K-H液套管插進主動脈并固定好。快速連接套管至Langendorff離體灌注裝置上，使用改良K-H液進行灌流。采用恒流泵維持灌流系統(tǒng)的灌注壓在80 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)；恒溫系統(tǒng)保持灌流液的溫度為37 ℃。離體心臟平衡灌流20 min穩(wěn)定跳動后，于左心房壁上切開一個小孔，取小乳膠水囊通過二尖瓣插進左心室中，采用連接導管及三通管將其與壓力轉(zhuǎn)換器相連。壓力換能器信號經(jīng)橋式放大器，輸?shù)絇owerLab/8s多道生理信號采集分析系統(tǒng)，并采用Lab chart軟件采集處理各種信號。離體心臟再經(jīng)過25 min的平衡灌流后，給予持續(xù)30 min的全心缺血，即缺血(Ischemia)期，期間停止灌流，心臟浸泡在37 ℃的 K-H液中；之后恢復灌流，持續(xù)120 min，即再灌注(Reperfusion)期。尼可地爾組在缺血前分別給予不同濃度的尼可地爾(Nic 30 μmol/L，100 μmol/L，300 μmol/L)持續(xù)灌流5 min，之后以灌流液洗脫5 min，再進入缺血期及再灌注期。排除標準：平衡灌流20 min后，心率<170次/min，左心室最高收縮壓<70 mmHg，或室顫持續(xù)>5 min。

1.3.2 心臟功能相關指標 連續(xù)記錄整個實驗過程中的各項心功能參數(shù)：左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室收縮峰壓(left ventricular peak systolic pressure，LVPSP)，并計算左心室發(fā)展壓(left ventricular developing pressure，LVDP)，LVDP=LVPSP-LVEDP；左心室等容期壓力最大變化速率(the derivative of left ventricular pressure，±dP/dt max)、心率(heart rate，HR)。

1.3.3 冠脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)活性 各組于平衡灌流期及復灌120 min完成后各收集冠脈流出液2 mL。采用LDH試劑盒檢測LDH的活性，按試劑盒使用說明書操作。

1.3.4 心肌梗死面積 采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色測定最終心肌梗死面積。用Image J圖像分析軟件，分析左室心肌片總面積及梗死區(qū)面積(TTC未染區(qū))；心肌梗死面積比=左室梗死區(qū)(未染區(qū))面積/心肌片總面積。

1.3.5 心肌組織中的GRP78、CHOP mRNA表達水平 采用Real-Time PCR檢測各組心肌組織中GRP78、CHOP mRNA表達水平。各目的基因引物均由上海生工合成(詳見表1)，采用GAPDH為管家基因。

表1 各基因PCR引物信息

1.3.6 心肌組織中各種因子的表達水平 采用Western blot法檢測各組心肌組織中的GRP78、CHOP的蛋白表達變化。應用Gel-Pro Analyzer 3.0軟件對各蛋白條帶進行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 尼可地爾對離體缺血再灌注心臟心功能的影響 與平衡灌流期比較，再灌注120 min后各處理組心臟的各項心功能指標：LVDP、LVEDP及± dp/dt max等明顯受損(P<0.05或P<0.01)。與I/R Ctrl組比較，尼可地爾預處理可顯著改善離體缺血再灌注心臟的LVDP、LVEDP、±dp/dt max、HR(P<0.05或P<0.01)。當尼可地爾劑量增加時，心功能各項指標恢復更加明顯(P<0.05或P<0.01)。詳見表2。

表2 尼可地爾對離體缺血再灌注心臟心功能指標的影響

2.2 尼可地爾對離體缺血再灌注心臟冠脈流出液中LDH活性水平的影響 各組大鼠離體灌流心臟平衡灌流期冠脈流出液中的LDH活性水平比較無顯著差異(P>0.05)。與平衡灌流期比較，各處理組再灌注120 min后冠脈流出液中的LDH活性水平顯著上升(P<0.01)；而尼可地爾預處理各組冠脈流出液中的LDH活性水平顯著低于I/R Ctrl組(P<0.05或P<0.01)，隨著尼可地爾劑量的增加，降低冠脈流出液中LDH活性水平的效果越明顯。詳見圖1。

注：與I/R Ctrl組比較，*P<0.05，**P<0.01；與Baseline期比較，#P<0.01，##P<0.01。

圖1 尼可地爾對離體缺血再灌注心臟冠脈流出液中LDH 活性水平的影響

2.3 尼可地爾對離體缺血再灌注心臟心肌梗死面積

的影響 采用TTC染色發(fā)現(xiàn)，I/R Ctrl組的心肌梗死面積為(48.4±6.7)%。與I/R Ctrl組比較，提示尼可地爾預處理可顯著縮小心肌梗死面積[Nic 30組(33.8±4.3)%，P<0.05；Nic 100組(25.2±3.8)%，P<0.01，Nic 300組(20.6±2.1)%，P<0.01]，隨著尼可地爾劑量增加，縮小心肌梗死面積的效果越明顯。詳見圖2。

注：與I/R Ctrl組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖2 尼可地爾對離體缺血再灌注心臟心肌梗死面積的影響

2.4 尼可地爾對離體缺血再灌注心肌GRP78及CHOP的 mRNA表達的影響 采用Real-Time PCR法分別檢測各組心肌組織中GRP78及CHOP 的mRNA表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，I/R Ctrl組、Nic 30組、Nic 100組、Nic 300組心肌組織中GRP78 mRNA的表達量分別是Bal 組的14.50倍、 11.92倍、6.84倍、2.25倍，CHOP mRNA的表達量分別是Bal 組的5.28倍、 3.32倍、2.15倍、2.33倍。與Bal 組比較，離體缺血再灌注心肌組織中GRP78及CHOP mRNA的表達顯著上調(diào)，而尼可地爾預處理可呈劑量依賴性降低GRP78及CHOP mRNA的表達(Nic 30組與I/R Ctrl組比較，P<0.05；Nic 100組及Nic 300組與I/R Ctrl組比較，P<0.01)。提示尼可地爾預處理不影響平衡灌流離體心臟心肌組織中GRP78及CHOP mRNA的表達。詳見圖3。

注：圖A為各組GRP78 mRNA的相對表達量比較；圖B為各組CHOP mRNA的相對表達量比較。與I/R Ctrl組比較，*P<0.05，**P<0.01；與Bal組比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖3 尼可地爾對離體缺血再灌注心肌GRP78及CHOP mRNA表達的影響

2.5 尼可地爾離體缺血再灌注心肌CHOP及GRP78蛋白表達的影響 采用Western blot法檢測ERS標志因子GRP78及促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP的蛋白表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Bal組比較，缺血再灌注后心肌組織中的GRP78及CHOP蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.01)；與I/R Ctrl組比較，尼可地爾預處理各組心肌組織中的CHOP及GRP78蛋白表達水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。而尼可地爾預處理不影響平衡灌流離體心臟心肌組織中GRP78及CHOP的蛋白表達。詳見圖4。

注：與I/R Ctrl組比較，*P<0.05，**P<0.01；與Bal組比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖4 尼可地爾對缺血再灌注心肌CHOP及GRP78蛋白表達的影響

3 討 論

Langendorff離體心臟灌流模型可較好地排除其他器官、體液環(huán)境及神經(jīng)系統(tǒng)信號等因素對心臟功能的影響，揭示某種藥物對不同心臟參數(shù)的潛在作用，還可精確控制給藥濃度，準確判斷藥物的量效關系，因此研究藥物對心臟的直接作用明顯。目前廣泛用于心血管病及藥理學研究，從單一基因改變對心臟生理學的影響，到各種心肌保護措施的機制研究，均可采用這一實驗模型[4-6]。本研究采用Langendorff灌流裝置，建立離體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，分別給予不同劑量尼可地爾預處理，驗證尼可地爾對缺血再灌注心肌的保護作用、及其對缺血再灌注誘發(fā)的心肌損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的影響。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大鼠離體心肌缺血再灌注損傷模型中，尼可地爾預處理可呈劑量依賴性地促進缺血再灌注后心臟功能的恢復，減輕心肌組織損傷，縮小

心肌梗死面積，證實尼可地爾預處理可減輕心肌缺血再灌注損傷，與文獻報道一致[7-9]。Horn等[10]在大鼠離體缺血再灌注模型中研究發(fā)現(xiàn)，尼可地爾可通過激活鉀通道及促進一氧化氮釋放而發(fā)揮心肌保護作用。在兔離體心臟模型中研究發(fā)現(xiàn)，尼可地爾在缺血之前不能改變激活恢復時間間隔(activation recovery interval，ARI)；但在缺血開始后，它能縮短ARI，并縮小心肌梗死面積達90%。線粒體KATP通道阻滯劑5-羥基奎酸鹽(5-HD)可取消尼可地爾的保護效應，而不影響ARI[11]。Lu等[12]在離體大鼠心肌I/R損傷模型中研究發(fā)現(xiàn)，尼可地爾預處理(缺血前10 min給藥)可保護心臟I/R后的左心室功能，其機制可能與開放線粒體KATP通道，減少活性氧(reactive oxygen species，ROS)自由基，增加冠脈血流有關。上述研究證實，尼可地爾的心肌保護作用可能通過激活線粒體KATP通道而實現(xiàn)，其機制是否涉及對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的影響未見文獻報道。

有研究報道顯示，尼可地爾可顯著減少動脈粥樣硬化斑塊中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應標志物CHOP和GRP78的表達水平[3]。而本研究發(fā)現(xiàn)，尼可地爾可抑制心肌缺血再灌注誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應標志因子GRP78及CHOP的表達。近年來，多項研究證實缺血或再灌注可激活心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應[13]。體外培養(yǎng)的心肌細胞模擬缺血時可誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78及CHOP的表達增高。采用小分子干擾核糖核酸(SiRNA)抑制CHOP的表達，可減輕缺血導致的心肌細胞凋亡。這些實驗結(jié)果表明ERS在缺血相關的心肌細胞損傷中具有重要作用[14]。在體外Langendorff灌流的小鼠心肌I/R損傷模型中發(fā)現(xiàn)，GRP78和GRP94的表達上調(diào)[15]。Zhang等[16]采用Langendorff離體大鼠心臟I/R模型研究發(fā)現(xiàn)，提前給予Ghrelin腹腔注射可減低心肌CHOP和caspase-12蛋白的表達水平，減輕心肌損傷和細胞凋亡，并顯著改善I/R導致的心臟功能損傷；進一步在體外實驗中證實，Ghrelin能直接抑制衣霉素和二硫蘇糖醇誘導的培養(yǎng)心肌細胞的ERS反應。因此認為Ghrelin能通過抑制ERS介導的凋亡途徑減輕心肌I/R損傷。可見，多種心肌保護措施可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應而對缺血再灌注心肌發(fā)揮保護作用。

綜上所述，本研究證實大鼠離體心肌I/R模型中，尼可地爾可呈劑量依賴性地減輕心肌缺血再灌注損傷，其機制可能與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應信號通路相關因子的表達有關。

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(本文編輯薛妮)

Nicorandil Protect the Myocardium from Ischemia Reperfusion Injury through Inhibiting Endoplasmic Reticulum Stress in Rats

Ye Ming，Wu Hui

The First College of Clinical Medical Sciences，China Three Gorges University，Yichang 443003，Hubei，China；Corresponding Author：Wu Hui，Yichang Central People’s Hospital，Yichang，Hubei，China

Objective To observe the effect of nicorandil preconditioning on rat in vitro myocardial ischemia reperfusion(I/R)injury and the expression of the key factors in endoplasmic reticulum stress signal pathway.Methods Forty-eight Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into six groups：balance group，balance+100 μmol/L nicorandil preconditioning group，I/R control group，30 μmol/L nicorandil preconditioning group，100 μmol/L nicorandil preconditioning group and 300 μmol/L nicorandil preconditioning group.Hearts from each group were excised and subjected to 30 min global ischemia followed by 120 min reperfusion in a Langendorff apparatus.Homodynamic parameters of left ventricular (LV) were recorded and evaluated with Powerlab system，including LV developed pressure (LVDP)，LV end-diastolic pressure (LVEDP)，and the derivative of left ventricular(+dP/dtmax and -dP/dtmax).Cell death was reflected by lactate dehydrogenase (LDH) activity assay in coronary effluent.Cardiac infarct size was also measured after nicorandil treatment by Triphenyl Tetrazolium Chloride (TTC) staining.The mRNA levels of ER stress markers，including glucose-regulated protein (GRP) 78 and C/-EBP homologous protein (CHOP) were examined by real time-PCR.The protein expressions of GRP78 and CHOP were detected by western blot.Results Nicorandil preconditioning improved post-ischemic cardiac function of isolated rat heart in a concentration dependent manner，and reduced LDH activity in coronary effluent.Consistent with the above observation，nicorandil preconditioning significantly reduced the infarct size after ischemia reperfusion.The mRNA level and protein expression of GRP78 and CHOP were upregulated in I/R heart.When the I/R hearts were treated with nicorandil，both CHOP and GRP78 levels were significantly attenuated，which emerged in an dose-dependent way.Conclusion Nicorandil preconditioning could alleviate myocardial I/R injury，ameliorate post-ischemic contractile function recovery，and inhibit endoplasmic reticulum stress induced by myocardial I/R in a dose-dependent manner in vivo.

ischemia reperfusion injury；nicorandil；myocardium； left ventricular developed pressure； left ventricular end-diastolic pressure； the derivative of left ventricular；heart rate；lactate dehydrogenase； glucose-regulated protein 78； C/-EBP homologous protein

湖北省自然科學基金項目(No.2015CFB286)

三峽大學第一臨床醫(yī)學院/湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院(湖北宜昌 443003)

吳輝，E-mail：cardiology_wh@126.com

信息：葉明，吳輝.尼可地爾保護大鼠缺血再灌注心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激機制的研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(11)：1310-1314.

R542.2 R256

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.11.007

1672-1349(2017)11-1310-05

2017-01-25)