王濟舟，曾 宇，宋 燁，漆松濤

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515

基礎(chǔ)研究

傳代次數(shù)對人膠質(zhì)瘤U87細胞系生物學(xué)特性的影響

王濟舟，曾 宇，宋 燁，漆松濤

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515

目的探索不同傳代次數(shù)對人膠質(zhì)瘤U87細胞系生物學(xué)特性的影響及其分子機制。方法以兩種不同傳代次數(shù)的U87（I）、U87（II）為研究對象，使用MTT細胞增殖實驗、Transwell小室遷移實驗及Boyden小室侵襲實驗分別檢測U87細胞的增殖、遷移和侵襲能力；使用Western Blot技術(shù)檢測U87（Ⅰ）及U87（Ⅱ）的CTHRC1, FOXM1, PLOD2, MMP9, TGF-β, E-cadherin,Slug, Snail, Vimentin, PI3K, p-PI3K, Akt, p-Akt的表達量差異。結(jié)果U87（Ⅰ）較U87（Ⅱ）更容易形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有更強的侵襲能力，但在增殖和遷移能力上二者無明顯差異。在EMT相關(guān)蛋白表達水平上，U87（Ⅰ）中的Snail、Vimentin的表達量較U87（Ⅱ）的高，而E-Cadherin、Slug則較低；在PI3K/Akt通路蛋白表達水平上，U87（Ⅰ）的p-Akt，Akt的表達量均低于U87（II），而p-PI3K的表達量卻高于U87（II），兩者在PI3K的表達量上無明顯差異；除此之外，U87（I）中PLOD2、CTHRC1及MMP9的表達量也明顯高于U87（II），而TGF-β的表達量則低于后者。結(jié)論隨著傳代次數(shù)的增加，U87細胞在侵襲能力以及多個促癌基因表達上發(fā)生了變化，這可能造成分子機制研究的前后結(jié)果不一致，降低結(jié)果的可信程度，因此研究人員在進行細胞系實驗時，應(yīng)盡可能在短時間內(nèi)，使用同一批次細胞完成生物學(xué)特性、分子機制研究，以減少傳代次數(shù)對腫瘤細胞系生物學(xué)特性以及基因表達的影響。

膠質(zhì)瘤；U87；傳代次數(shù)；侵襲能力

穩(wěn)定的腫瘤細胞系是如今科學(xué)研究人員進行腫瘤研究的重要工具[1-5]，細胞系的永生特性使得研究者可以不斷的深入探索該細胞系所代表的腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機制，從而為腫瘤的診斷、治療及預(yù)后找到新的突破口。然而實驗者在操作細胞時極為容易將細胞弄混，許多研究者便因混淆細胞系而遭遇撤稿[6-7]。此外，Lin等[8]研究發(fā)現(xiàn)，不同代數(shù)的前列腺癌細胞之間存在異質(zhì)性，說明在不斷的傳代過程中，細胞的生物學(xué)特性及基因表達都有可能出現(xiàn)變化。人膠質(zhì)瘤U87細胞系建立于1966年，是由瑞典烏普薩拉大學(xué)的研究人員利用一位44歲的膠質(zhì)母細胞瘤女患者的組織進行培養(yǎng)得到的，現(xiàn)已是全球各地研究人員研究膠質(zhì)瘤的最常用的細胞系之一[9]。這個細胞系的廣泛使用為廣大研究人員提供了便利，但現(xiàn)有研究中卻鮮有研究者研究不同傳代次數(shù)的U87細胞的異同，以及明確述及他們的實驗是否是在相同傳代次數(shù)的U87細胞中進行，故而這些實驗結(jié)果可靠性都是值得推敲的。本實驗旨在探索不同傳代次數(shù)U87細胞的分子表型及生物學(xué)功能差異，以明確在相同傳代次數(shù)的U87細胞中進行分子生物學(xué)實驗的必要性。

1 方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人膠質(zhì)瘤U87細胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫。U87細胞采用10%胎牛血清（Gemini）的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng)，待細胞生長狀態(tài)良好時用于實驗。

1.2 Western blot

Western blot的操作流程及具體方法[10], 本實驗中使用的抗體包括anti-CTHRC1, FOXM1, PLOD2,MMP9, TGF-β, E-cadherin, Slug, Snail, Vimentin,PI3K, p-PI3K, Akt, p-Akt, β-actin, GAPDH。具體的抗體見補充表格。所有圖片均為Bio-Rad公司的化學(xué)發(fā)光儀拍攝獲得，并使用Image-Pro Plus 6.0測量所獲條帶灰度值。

1.3 MTT細胞增殖實驗

本實驗使用MTT實驗檢測細胞增殖能力[11]。將U87細胞鋪于96孔板的孔中（1000個/孔，200 μL/孔），每種細胞均設(shè)5個復(fù)孔。細胞貼壁后加入20 μL MTT（5 mg/mL稀釋于PBS中, Sigma, St Louis, MO），4 h后吸出培養(yǎng)基，使用150 μLDMSO（Sigma, St Louis,MO）溶解甲瓚結(jié)晶，并用酶標(biāo)儀測量490 nm的吸光度。此后每天同一時間加入MTT及測量吸光度，共觀察7 d。

1.4 細胞遷移和侵襲實驗

細胞遷移及侵襲實驗方法同我們此前發(fā)表文章中所述[12]。對于細胞遷移實驗，我們將1×105細胞用100 μL無血清培養(yǎng)基重懸，鋪入小室中，2 h 30 min后使用甲醇固定，并用Giemsa染色液染色。對于細胞侵襲實驗，我們首先在小室中鋪入100 μL的基質(zhì)膠（康寧）（250 μg/mL），在37 ℃、5% CO2孵箱中靜置4 h后再鋪入細胞，具體步驟同細胞遷移實驗。統(tǒng)計時選取200 x視野，在四個視野中計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)并取平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。細胞遷移、侵襲實驗以及Western灰度值結(jié)果均采用非配對樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 傳代次數(shù)不同的細胞的形態(tài)及生長特性不同

U87（Ⅰ）及U87（Ⅱ）為不同傳代次數(shù)的兩批細胞，其中U87（Ⅱ）的傳代次數(shù)較多，二者的傳代次數(shù)差異＞100代。將相同數(shù)量的U87（Ⅰ）及U87（Ⅱ）鋪入10 cm的培養(yǎng)皿中，7 h后于鏡下觀察二者的形態(tài)及密度，兩種細胞的密度無明顯差異，但U87（Ⅰ）的外觀較U87（Ⅱ）更加飽滿，體積稍大。4 d后再次觀察兩種細胞，外觀出現(xiàn)了明顯的差異。U87（Ⅰ）形成了明顯的較為規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀空隙較大，空隙中無貼壁細胞，U87（Ⅱ）雖然也形成了一定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但細胞的排列較為散亂，所形成的網(wǎng)狀空隙較?。▓D1）。

2.2 傳代次數(shù)不同的細胞的侵襲能力不同

圖1 U87（Ⅰ）與U87（Ⅱ）在鏡下的形態(tài)差異

為探究U87（Ⅰ）及U87（Ⅱ）的生物學(xué)特性的差異，我們進行了MTT實驗、Transwell小室遷移實驗及Boyden小室侵襲實驗分別檢測兩者的增殖、遷移、侵襲能力，3種實驗均獨立重復(fù)了3次，Transwell小室遷移實驗及Boyden小室侵襲實驗的結(jié)果為4個不同視野的平均值。MTT實驗顯示，兩種細胞在增殖能力上無明顯差異（圖2）。Transwell實驗顯示，U87（Ⅰ）的遷移能力較U87（Ⅱ）稍強，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.1169）。而Boyden實驗顯示U87（Ⅰ）較U87（Ⅱ）的侵襲能力更強，有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.0403, 圖3）。

圖2 U87（Ⅰ）和U87（Ⅱ）之間增殖能力的差異

2.3 傳代次數(shù)不同的細胞的蛋白表達量存在差異

為進一步研究U87（Ⅰ）及U87（Ⅱ）出現(xiàn)侵襲能力差異的分子機制，本研究使用Western blot分析兩種細胞中EMT相關(guān)蛋白、PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白及部分促癌基因的蛋白的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)，在EMT相關(guān)的蛋白表達量上，E-ca及Slug在U87（Ⅰ）中表達量較低，而Snail、Vimentin在U87（Ⅰ）中表達量較高；在PI3K/Akt通路上，Akt及p-Akt在87（Ⅰ）的表達量均低于U87（Ⅱ），但p-PI3K的表達量卻高于后者，而PI3K的表達量在兩個細胞系之間無明顯差異。此外，U87（Ⅰ）的MMP9、CTHRC1、PLOD2表達量明顯高于U87（Ⅱ），而TGF-β的表達量則較U87（Ⅱ）的低，F(xiàn)OXM1的表達量無明顯差異（圖4）。

3 討論

U87是目前膠質(zhì)瘤研究常用的穩(wěn)定細胞系，然而本研究團隊在培養(yǎng)U87細胞的過程中發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)及生長特性隨傳代次數(shù)的增加發(fā)生了變化，傳代次數(shù)較少的U87比較飽滿，細胞較大，易于結(jié)網(wǎng)，在傳代3～4 d后出現(xiàn)明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細胞會在網(wǎng)狀的骨架中增殖，而不會向骨架中的空隙中生長，而連續(xù)傳代半年后的U87細胞體積相對較小，不易結(jié)網(wǎng)。既往的研究表明，惡性程度高的膠質(zhì)瘤細胞系如U251、U87容易形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，F(xiàn)rancescone等[13]認為這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是膠質(zhì)瘤細胞血管生成擬態(tài)的微觀表現(xiàn)，是其高度惡性的表現(xiàn)之一。在此基礎(chǔ)上，本研究深入探究了形態(tài)相異的同種細胞系、不同傳代次數(shù)的細胞之間的生物學(xué)特性及蛋白表達差異。結(jié)果顯示，二者的生長和遷移能力無明顯差別，但傳代次數(shù)較少的U87的侵襲能力要強于傳代次數(shù)多的U87。而WB的結(jié)果則反映出二者在數(shù)個與腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)的基因在蛋白水平的表達量存在明顯的不同。本研究在前期研究中發(fā)現(xiàn)PLOD2及CTHRC1高表達可以促進U87細胞的遷移和侵襲能力，并且PLOD2在缺氧狀態(tài)下可促進U87的生存。此外，MMP9為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的成員之一，許多研究證實MMP9可以促進膠質(zhì)瘤的遷移、侵襲能力[14-15]。本實驗發(fā)現(xiàn)，傳代次數(shù)少的U87的PLOD2、CTHRC1及MMP9表達明顯高于傳代次數(shù)多的U87，這可能可以解釋為何前者較后者擁有更強的侵襲能力。

圖3 U87（Ⅰ）和U87（Ⅱ）之間遷移、侵襲能力的差異

圖4 U87（Ⅰ）和U87（Ⅱ）之間多種促癌基因表達量在蛋白水平上的差異

細胞系在傳代過程中可能出現(xiàn)不同細胞系交叉污染或者標(biāo)記錯誤的情況，許多研究者因發(fā)現(xiàn)前期實驗使用了錯誤的細胞系而遭遇撤稿[6-7]。2016年Allen等[16]報道稱他們通過DNA指紋技術(shù)發(fā)現(xiàn)ATCC細胞庫所使用的U87與50年前建立的原始腫瘤樣本并不匹配。本實驗僅使用了U87及U251兩種細胞系，從細胞形態(tài)可看出，U87（Ⅰ）與U87（Ⅱ）形態(tài)相近，且與U251形態(tài)明顯不同。為排除U87被U251污染的情況，研究對比了U251與U87（Ⅰ）之間部分蛋白表達量的差異。在PLOD2及CTHRC1的表達含量上，二者無顯著差異，故而可以推測，U87（Ⅰ）與U87（Ⅱ）所出現(xiàn)的蛋白表達含量差異并不是U251污染所致，而更可能是傳代過程中出現(xiàn)的基因突變、表觀遺傳學(xué)修飾等因素所致。

不同傳代次數(shù)影響細胞的遷移、侵襲能力，同時改變了癌基因或抑癌基因的表達，這可能有兩方面原因，一方面細胞本身存在異質(zhì)性，通過優(yōu)勝劣汰逐漸改變細胞的整體特性，另一方面，在培養(yǎng)過程中，不斷有外界的刺激或者干擾，如支原體污染，更換血清品牌，消化傳代等物理、化學(xué)因素，而對細胞的基因表達產(chǎn)生影響，繼而出現(xiàn)突變。在實驗操作中，采用液氮凍存的方法保種，在培養(yǎng)細胞出現(xiàn)污染、凋亡或者用盡后，往往采取復(fù)蘇細胞，重復(fù)進行實驗，而這樣的操作可能因不同批次的細胞之間的差異，造成前后實驗結(jié)果不相符，增加數(shù)據(jù)分析的復(fù)雜性。因此，研究人員在使用腫瘤細胞系進行實驗的過程中，應(yīng)該盡量保證使用同一批細胞，并且在短時間內(nèi)完成分子機制、功能的相關(guān)研究，減少因傳代次數(shù)造成的細胞異質(zhì)性所帶來的影響。

此外，隨著傳代次數(shù)的增加及體外培養(yǎng)條件的改變，腫瘤細胞系的分子特性與其最初在體內(nèi)時有所差別，目前主流研究多用原位成瘤實驗或者皮下成瘤實驗?zāi)M腫瘤在體內(nèi)的生物學(xué)過程[17-18]，但如果實驗時腫瘤細胞系的分子特性已經(jīng)出現(xiàn)改變，成瘤實驗并不能確切地反映出腫瘤在病人體內(nèi)發(fā)生發(fā)展的真實情況。故而腫瘤研究應(yīng)不僅僅使用穩(wěn)定的細胞系，也應(yīng)重視原代細胞培養(yǎng)與使用。當(dāng)原代細胞能夠相對穩(wěn)定的傳代后，通過培養(yǎng)單克隆的原代細胞，建立新的傳代次數(shù)較少的細胞系，然后在該細胞系中驗證分子機制，這樣可以盡可能地模擬腫瘤在病人體內(nèi)時的生物學(xué)特性，增加實驗結(jié)果的可信程度。

[1]Barretina J, Caponigro G, Stransky N, et al. The cancer cell line encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity[J]. Nature, 2012, 483(7391)： 603-7.

[2]Haverty PM, Lin E, Tan J, et al. Reproducible pharmacogenomic profiling of cancer cell line panels[J]. Nature, 2016, 533(763)： 333-7.

[3]Cancer cell line encyclopedia consortium, genomics of drug sensitivity in cancer consortium. pharmacogenomic agreement between two cancer cell line data sets[J]. Nature, 2015, 528(7580)：84-7.

[4]Whitington T, Gao P, Song W, et al. Gene regulatory mechanisms underpinning prostate cancer susceptibility[J]. Nat Genet, 2016,48(4)： 387-97.

[5]Que T, Song Y, Liu Z, et al. Decreased miRNA-637 is an unfavorable prognosis marker and promotes glioma cell growth,migration and invasion via direct targeting Akt1[J]. Oncogene,2015, 34(38)： 4952-63.

[6]He YC, Chen FC, Cai Y. Retracted： knockdown of tumor protein D52-like 2 induces cell growth inhibition and apoptosis in oral squamous cell carcinoma[J]. Cell Biol Int, 2016, 40(3)： 361-4.

[7]Zhang P, Yang Y, Zweidler-Mckay P, et al. Retraction： critical role of notch signaling in osteosarcoma invasion and metastasis[J]. Clin Cancer Res, 2013, 19(18)： 5256-7.

[8]Lin HK, Hu YC, Yang L, et al. Suppression versus induction of androgen receptor functions by the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in prostate cancer LNCaP cells with different passage numbers[J]. J Biol Chem, 2003, 278(51)： 50902-7.

[9]Dolgin E. Venerable brain-cancer cell line faces identity crisis[J].Nature, 2016, 537(7619)： 149-50.

[10]Song Y, Luo Q, Long H, et al. Alpha-enolase as a potential cancer prognostic marker promotes cell growth, migration, and invasion in glioma[J]. Mol Cancer, 2014, 13(5)： 65-7.

[11]Song Y, Hu Z, Long H, et al. A complex mechanism for HDGF-mediated cell growth, migration, invasion, and TMZ chemosensitivity in glioma[J]. J Neurooncol, 2014, 119(2)：285-95.

[12]Qi S, Song Y, Peng Y, et al. ZEB2 mediates multiple pathways regulating cell proliferation, migration, invasion, and apoptosis in glioma[J]. PLoS One, 2012, 7(6)： e38842-4.

[13]Francescone R, Scully S, Bentley B, et al. Glioblastoma-derived tumor cells induce vasculogenic mimicry through Flk-1 protein activation[J]. J Biol Chem, 2012, 287(29)： 24821-31.

[14]Joseph JV, van Roosmalen IA, Busschers E, et al. Serum-Induced differentiation of glioblastoma neurospheres leads to enhanced migration/invasion capacity that is associated with increased MMP9[J]. PLoS One, 2015, 10(12)： e0145393-5.

[15]Wang F, Xiao W, Sun J, et al. MiRNA-181c inhibits EGFR-signaling-dependent MMP9 activation via suppressing Akt phosphorylation in glioblastoma[J]. Tumour Biol, 2014, 35(9)：8653-8.

[16]Allen M, Bjerke M, Edlund H, et al. Origin of the U87MG glioma cell line： Good news and bad news[J]. Sci Transl Med, 2016,8(354)： 354re3-5.

[17]Depner C, Zum BH, B??ürcü N, et al. EphrinB2 repression through ZEB2 mediates tumour invasion and anti-angiogenic resistance[J].Nat Commun, 2016, 7(4)： 12329-33.

[18]Kim D, Fiske BP, Birsoy K, et al. SHMT2 drives glioma cell survival in ischaemia but imposes a dependence on glycine clearance[J]. Nature, 2015, 520(7547)： 363-7.

Effect of different passage number on the biological characteristics of U87 glioblastoma cell line

WANG Jizhou, ZENG Yu, SONG Ye, QI Songtao
Department of Neurosurgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

ObjectiveTo unravel the differences of biological characteristics and the uderlying molecular mechanisms between different passages of U87 glioblastoma cell line.MethodsU87 (I) and U87 (II), with less or more passage number respectively,were established examined separately by MTT assay, transwell chamber assay, boyden chamber assay. Western blot was used to analyze the expression of CTHRC1, FOXM1, PLOD2, MMP9, TGF-β, E-cadherin, Slug, Snail, Vimentin, PI3K, p-PI3K, Akt and p-Akt separately in these two types of cells.ResultsCompared to U87 (II), U87 (I) was more prone to form tubules and showed more invasiveness, while there were no differences between U87 (I) and U87 (II) in proliferation and migration. The expression of markers of EMT varies in these two types of cells, with more expression of E-cadherin and Slug and less expression of Vimentin and Snail in U87 (II). Moreover, U87 (II) was found to have greater amount of Akt and p-Akt, but have smaller amount of p-PI3k. No significant difference was found on the expression of PI3K between these cells. Additionally, the expression of PLO2, CTHRC1 and MMP9 were higher in U87 (I) than that in U87 (II), while the expression of TGF-β in U87 (I)was lower than that in the latter one.ConclusionAs the passage number increased, U87 cell lines exhibited changes in invasiveness as well as some oncogenic genes’ expressions. It may lead to the different results during different periods, making the results inconvincible. Together, our results showed that, to lessen the influence of passage numbers on cells’ biological characteristics, scientists should use cells with same passage numbers and finish the experiments as quickly as they can.

glioma; U87; passage number; invasiveness

2017-02-06

國家自然科學(xué)基金（81502178）

王濟舟，博士研究生，E-mail： spiderpy@163.com；

漆松濤，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： qisongtaonfyy@126.com