毛亮 程俊 黃文俊 譚曉秋 黨喜同 曾曉榮 楊艷

(西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)電生理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州 646000)

論 著

可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的細(xì)胞系構(gòu)建及蛋白質(zhì)純化*

毛亮 程俊 黃文俊 譚曉秋 黨喜同 曾曉榮 楊艷△

(西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)電生理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州 646000)

目的：旨在構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)的穩(wěn)定細(xì)胞系并對(duì)重組蛋白分離純化。方法：利用基因工程技術(shù)將人腸系膜動(dòng)脈平滑肌BKCa編碼基因克隆到表達(dá)載體pcDNA5/FRT/TO/FLAG，并轉(zhuǎn)染Flp-InTMT-RExTM-293宿主細(xì)胞，用潮霉素B篩選建立穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞系。BKCa-pcDNA5-293細(xì)胞系經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)后，用anti-FLAG抗體對(duì)表達(dá)的BKCa蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。用western blot檢測(cè)BKCa通道蛋白質(zhì)的表達(dá)，用單通道膜片鉗檢測(cè)通道的電生理特性。結(jié)果：BKCa-pcDNA5-293細(xì)胞系經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)后表達(dá)了高水平的BKCa-FLAG融合蛋白，BKCa通道電導(dǎo)值為213.39±9.52 pS(n=15，cell-attached)和225.72±10.61 pS(n=13，inside-out)，BKCa通道具有典型的大電導(dǎo)特性、電壓依賴性、Ca2+依賴性及IbTX敏感性，與在體的人腸系膜動(dòng)脈平滑肌BKCa通道具有相同的特征。純化后的BKCa蛋白質(zhì)條帶單一，純度約為89%。結(jié)論：成功構(gòu)建BKCa-pcDNA5-293細(xì)胞系并獲得純化的BKCa蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步深入研究通道功能及藥物篩選奠定了重要的基礎(chǔ)。

穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系；BKCa重組蛋白質(zhì)；膜片鉗

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(Large conductance potassium channels，BKCa)廣泛分布于血管平滑肌、心肌、腦、氣道平滑肌等組織，在調(diào)節(jié)平滑肌張力、神經(jīng)遞質(zhì)釋放和神經(jīng)元興奮[1]及保護(hù)心肌[2]等方面發(fā)揮了重要作用。研究表明，多種藥物及化合物都通過(guò)激活BKCa通道發(fā)揮作用，BKCa通道已成為高血壓[3-7]、癲癇[8-10]、腦卒中[11, 12]、耳鳴[13]、哮喘[14]、膀胱活動(dòng)過(guò)度癥[15, 16]等多種疾病治療及藥物篩選的重要靶點(diǎn)。體外重建BKCa通道是研究其作用機(jī)制及藥物篩選的重要手段。本文旨在用基因工程技術(shù)克隆人腸系膜動(dòng)脈BKCa通道基因，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的HEK293單克隆細(xì)胞系，并純化BKCa通道蛋白質(zhì)，為BKCa通道的功能研究及其在人工脂質(zhì)膜上的體外重建準(zhǔn)備條件。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人腸系膜動(dòng)脈血管取自西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)廢棄的組織。表達(dá)載體pcDNA5/FRT/TO/FLAG、POG44及Flp-InTMT-RExTM-293細(xì)胞為西南醫(yī)科大學(xué)傅俊江教授贈(zèng)送。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA聚合酶、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒、DMEM高糖培養(yǎng)基、FBS、Hygromycin B購(gòu)自Thermo公司，BamHI、KpnI內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)自New England Biolabs 公司，ANTI-FLAG M2 Affinity Gel 購(gòu)自Sigma公司，anti-BKCa抗體購(gòu)自 Alomone Labs，貨號(hào)APC-107， HRP偶聯(lián)的山羊抗兔二抗購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，貨號(hào)D110058， ECL發(fā)光試劑購(gòu)自北京英格恩生物技術(shù)有限公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 基因克隆

用Trizol法提取人腸系膜動(dòng)脈RNA，取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取1 μL cDNA，用BKCa基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中上游引物包含了KpnI酶切位點(diǎn)，上游引物序列：5′-TCGGTACCAAGATGGATGCGCTCATCA-3′，下游引物包含了BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物序列：5′-AAGGATCCAAGCCGCTCTTCCTGCACGTA-3′。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

將BKCaPCR產(chǎn)物及pcDNA5/FRT/TO/FLAG質(zhì)粒分別經(jīng)KpnI、BamHI雙酶切，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，取20 μg pcDNA5/FRT/TO/FLAG線性質(zhì)粒和60 μg BKCaDNA，用T4連接酶室溫連接2 h，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。

1.4 細(xì)胞系建立

Flp-InTMT-RExTM-293 細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在6孔板中接種0.8×106個(gè)細(xì)胞，24 h后加入BKCa-pcDNA5/FRT/TO/FLAG和pOG44 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，將pcDNA5/FRT/TO/FLAG空載體和pOG44 共轉(zhuǎn)染作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞中加入200 μg·ml-1的潮霉素B篩選，并挑選單克隆細(xì)胞。

1.5 Western blot檢測(cè)

BKCa-pcDNA5-293單克隆細(xì)胞中加入0.1 μg·ml-1四環(huán)素(Tetracycline，TET)，誘導(dǎo)24 h后收取細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解(碧云天)，取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳(分離膠10%，濃縮膠5%)，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1h，加入anti-BKCa抗體(1:1000)或anti-FLAG 抗體(1:5000)4℃孵育過(guò)夜，0.1% TBST清洗3次，加入HRP偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(1:3000)室溫孵育1 h，0.1% TBST清洗3次，用ECL發(fā)光試劑顯影。

1.6 膜片鉗檢測(cè)

BKCa-pcDNA5-293單克隆細(xì)胞接種在蓋玻片上，培養(yǎng)基中加入0.1 μg·ml-1TET，誘導(dǎo)24 h后進(jìn)行單通道膜片鉗檢測(cè)。室溫下(20℃～25℃)，將蓋玻片放入盛有1 ml浴液浴槽中。微管玻璃內(nèi)注入電極液(尖端阻抗10 MΩ)并置于放大器探頭上，操作微電極操縱器使微管電極浸入浴液，并與細(xì)胞表面接觸，施負(fù)壓形成高阻封接(阻抗≥10 GΩ)，形成細(xì)胞貼附式模式(Cell-attached patch)。高阻封接形成后，將電極尖端輕輕地提出液面，空氣中暴露約3 s后放入浴槽中，即可形成內(nèi)面向外式(Inside-out patch)模式。形成細(xì)胞貼附式膜片模式后，短促負(fù)壓抽吸形成全細(xì)胞(Whole-cell)模式。Outside-out模式需要在whole-cell模式形成后拖動(dòng)玻璃微電極形成。

本實(shí)驗(yàn)中主要使用了單通道膜片鉗技術(shù)的cell-attached、inside-out patch和outside-out模式記錄BKCa-pcDNA5-293單克隆細(xì)胞的BKCa單通道電活動(dòng)情況。EPC-10膜片鉗放大器和 Pulse software(Heka elektronik, Lambrecht, Germany)放大采集和分析電流信號(hào)。

Cell-attached和inside-out模式實(shí)驗(yàn)中浴液成分(mmol·L-1)：KCl 40，K-aspartate 100，EGTA 1，HEPES 10(pH 7.40)，CaCl2根據(jù)Ca2+終濃度需要加入[17]；電極液成分(mmol·L-1)：KCl 100，K-aspartate 40，HEPES 10，EGTA 2(pH 7.20)。全細(xì)胞模式浴液成分(mmol·L-1)：NaCl 134，CaCl21.8，MgCl21，KCl 6，Glucose 10，HEPES 10(pH 7.40)；電極液成分(mmol·L-1)：K-aspartate 110，KCl 30，NaCl 10，MgCl21，EGTA 0.05，HEPES 10；(pH 7.20)。全細(xì)胞模式形成后即可形成outside-out模式再進(jìn)行IbTX實(shí)驗(yàn)。

1.7 蛋白質(zhì)純化

pcDNA5/FRT/TO/FLAG質(zhì)粒經(jīng)過(guò)改造，加入了FLAG標(biāo)簽，可用anti-FLAG antibody純化目的蛋白。BKCa-pcDNA5-293細(xì)胞經(jīng)0.1 μg·ml-1TET誘導(dǎo)24 h 后用裂解液(50 mmol·L-1Tris HCl，pH 7.4，150 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，1% Triton X-100，蛋白酶抑制劑)進(jìn)行裂解。取1 mg總蛋白加入到40 μl Anti-flag M2 affinity gel beads，4℃溫和旋轉(zhuǎn)混合過(guò)夜，以8200 g的轉(zhuǎn)速4℃離心1 min，棄上清，沉淀用PBS洗滌3次，沉淀中加入100 μl 3×FLAG peptide(150 ng·ml-1)，4℃溫和旋轉(zhuǎn)混勻30 min，以8200 g的轉(zhuǎn)速 4℃離心1 min，轉(zhuǎn)移上清，上清液中即為純化的BKCa重組蛋白，用Western blot進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS19.0和Origin8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BKCa-pcDNA5/FRT/TO/FLAG質(zhì)粒構(gòu)建

BKCa-pcDNA5/FRT/TO/FLAG質(zhì)粒經(jīng)KpnI和BamHI雙酶切后呈現(xiàn)兩條帶，見(jiàn)圖1，一條為pcDNA5/FRT/TO/FLAG線狀載體，長(zhǎng)度約6 kb，另一條為BKCa插入片段，長(zhǎng)度約3.4 kb，與插入的BKCaPCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度一致，經(jīng)DNA測(cè)序鑒定，BKCaDNA成功插入到pcDNA5/FRT/TO/FLAG質(zhì)粒的KpnI和BamHI兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，F(xiàn)LAG標(biāo)簽編碼基因融合在BKCaDNA 3′末端，閱讀框正確。

2.2 可誘導(dǎo)的BKCa-pcDNA5-293單克隆細(xì)胞系構(gòu)建

將BKCa-pcDNA5/FRT/TO/FLAG和pOG44 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Flp-InTMT-RExTM-293 細(xì)胞，用潮霉素篩選建立單克隆細(xì)胞系。用FLAG抗體進(jìn)行western blot檢測(cè)，見(jiàn)圖2，經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)的BKCa-pcDNA5-293細(xì)胞裂解液呈現(xiàn)清晰的BKCa-FLAG蛋白條帶，分子量約120 kDa，與理論結(jié)果一致，經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)的pcDNA5-293細(xì)胞裂解液在120 kDa處無(wú)蛋白條帶出現(xiàn)，表明BKCa基因成功轉(zhuǎn)入到293細(xì)胞，并正常翻譯成BKCa-FLAG融合蛋白質(zhì)。在未經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)的BKCa-pcDNA5-293細(xì)胞中未檢測(cè)到BKCa-FLAG蛋白條帶，表明四環(huán)素是BKCa基因表達(dá)的必須條件，可利用四環(huán)素這個(gè)分子開(kāi)關(guān)準(zhǔn)確的控制BKCa基因的表達(dá)。

圖1 BKCa-pcDNA5/FRT/TO/FLAG質(zhì)粒雙酶切鑒定注：Marker表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1表示BKCa-pcDNA5質(zhì)粒條帶，2表示BKCa-pcDNA5質(zhì)粒經(jīng)KpnI和BamHI雙酶切后出現(xiàn)2條帶，3表示BKCa PCR產(chǎn)物條帶。

圖2 四環(huán)素誘導(dǎo)BKCa-pcDNA5-293穩(wěn)定細(xì)胞系的BKCa蛋白質(zhì)表達(dá)注：Marker表示標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)，(+)表示細(xì)胞經(jīng)TET誘導(dǎo)，(-)表示細(xì)胞無(wú)TET誘導(dǎo)。

2.3 BKCa通道的基本特性

為驗(yàn)證BKCa蛋白質(zhì)是否具有正常的通道功能，本研究通過(guò)單通道膜片鉗實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，BKCa通道具有典型的電壓依賴性及大電導(dǎo)特性，具有明顯的Ca2+依賴性及IbTX敏感性。

2.3.1 BKCa的電壓依賴性及電導(dǎo)值

本實(shí)驗(yàn)記錄BKCa在cell-attached和inside-out模式下的單通道活動(dòng)，電極液和浴液含140 mM [K+]，浴液中游離Ca2+([Ca2+]free)為0.1 μM時(shí)，分別給予細(xì)胞不同的電壓刺激并記錄電流信號(hào)。圖3A和3B分別顯示了不同鉗制電壓下cell-attached patch 和inside-out模式下BKCa通道典型的電流圖。結(jié)果顯示在去極化狀態(tài)下，BKCa通道表現(xiàn)為隨機(jī)開(kāi)放的外向電流活動(dòng)，隨去極化電壓的升高，通道的電流幅度值和開(kāi)放概率逐步增加。根據(jù)不同鉗制電壓下的通道電流幅度值和相應(yīng)刺激電壓構(gòu)建電流-電壓關(guān)系曲線(I-V曲線)見(jiàn)圖1C，用軟件Origin 8.0軟件對(duì)I-V曲線進(jìn)行回歸，表明電流電壓呈線性關(guān)系，反轉(zhuǎn)電位接近0 mV，其斜率即為BKCa的電導(dǎo)值，分別為213.39 ± 9.52 pS(n=15，cell-attached)和225.72 ± 10.61 pS(n=13，inside-out)。表明此通道具電壓依賴性及大電導(dǎo)特性。

圖3 BKCa單通道電流的電壓依賴性注：cell-attached (A)和inside-out (B) 模式下在0-60 mV電壓下記錄到代表性的BKCa電流，箭頭指示基線。C. BKCa通道的電流-電壓關(guān)系曲線。

2.3.2 BKCa通道Ca2+依賴性

在inside-out模式下，當(dāng)浴液中[Ca2+]free=0 μM時(shí)，無(wú)論超極化或去極化狀態(tài)下均較少見(jiàn)到BKCa的通道活動(dòng)，但當(dāng)浴液中[Ca2+]free增高時(shí)，則通道活動(dòng)明顯增加。圖4A顯示了膜電位為+40 mV時(shí)，當(dāng)[Ca2+]由0 μM增加到1.0 μM時(shí)通道開(kāi)放情況，表明該BKCa通道具有明顯的Ca2+依賴性。

圖4 BKCa通道的Ca2+敏感性注：溶液和電極液中[ K+]均為140 mM([K+]0:[ K+]i = 140:140 mM)，Vm=+40 mV，箭頭指示基線。

2.3.3 BKCa通道的IbTX敏感性

在outside-out模式下，BKCa-pcDNA5-293單克隆細(xì)胞的BKCa通道對(duì)其特異性阻斷劑iberiotoxin(IbTX)敏感。圖5為典型電流記錄圖，表明200 nM IbTX明顯抑制通道活動(dòng)。

圖5 BKCa通道的IbTX敏感性注：200 nM IbTX基本阻斷通道活動(dòng)，Vm= +40 mV，箭頭指示基線。

2.4 BKCa融合蛋白純化

純化的BKCa-FLAG融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，圖6A顯示，在120 kDa處呈現(xiàn)明顯的蛋白條帶，經(jīng)灰度掃描計(jì)算，純度約89%。隨后，用BKCa特異性一抗進(jìn)行western blot檢測(cè)，圖6B結(jié)果顯示BKCa-FLAG融合蛋白能夠與BKCa抗體特異性結(jié)合，表明蛋白質(zhì)純化成功，純度較高。

圖6 BKCa-FLAG蛋白質(zhì)純化注：A圖為BKCa-FLAG蛋白質(zhì)SDS-PAGE 電泳結(jié)果，B圖為BKCa-FLAG蛋白質(zhì)western blot 結(jié)果，Marker表示蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

BKCa通道對(duì)調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程發(fā)揮重要的作用，應(yīng)用異源表達(dá)技術(shù)在工具細(xì)胞中重建BKCa通道是深入研究通道結(jié)構(gòu)功能的重要方法。本研究在HEK293細(xì)胞中建立的BKCa通道具有典型的大電導(dǎo)特征、電壓依賴性、鈣離子依賴性及IbTX敏感性，與在體的人腸系膜動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中記錄到的BKCa通道電生理特性一致[18, 19]，表明BKCa通道重建成功，可作為后續(xù)功能研究的理想工具。為保證細(xì)胞系的穩(wěn)定性，本研究采用了誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，可利用四環(huán)素作為分子開(kāi)關(guān)嚴(yán)格控制BKCa基因的表達(dá)。將能夠有效的避免BKCa基因持續(xù)表達(dá)可能對(duì)宿主細(xì)胞造成的損傷，有利于保證BKCa通道表達(dá)的穩(wěn)定性。

近年來(lái)，BKCa通道的調(diào)控位點(diǎn)、藥物作用靶點(diǎn)的研究備受關(guān)注，本實(shí)驗(yàn)室在前期工作基礎(chǔ)上，一直在探索將BKCa蛋白純化后在人工平面脂質(zhì)膜上重建BKCa通道，將能可控性的排除其他蛋白質(zhì)及胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)通道的影響，可以更加精確的研究通道動(dòng)力學(xué)特征，藥物作用靶點(diǎn)及各個(gè)亞基間的相互作用。本研究構(gòu)建的細(xì)胞系為BKCa蛋白質(zhì)純化提供了有利的條件，表達(dá)載體pcDNA5/FRT/TO/FLAG經(jīng)改造后，在多克隆位點(diǎn)的3′端插入了2×FLAG編碼基因，因此BKCa-pcDNA5-293細(xì)胞表達(dá)的BKCa蛋白質(zhì)的胞內(nèi)C末端融合了2×FLAG短肽，而且2×FLAG并沒(méi)有影響B(tài)KCa通道典型的電生理特征。插入FLAG 的好處在于針對(duì)標(biāo)簽的抗體特異性和親和力要比針對(duì)通道本身的抗體高很多，為BKCa通道蛋白純化提供了新的思路。ANTI-FLAG M2 Affinity Gel beads是偶聯(lián)有FLAG抗體的商業(yè)化的瓊脂糖凝膠，可與BKCa-FLAG蛋白質(zhì)中的FLAG肽特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)BKCa蛋白質(zhì)的富集，再用商業(yè)化的FLAG肽進(jìn)行洗脫，即可實(shí)現(xiàn)BKCa蛋白質(zhì)純化，為BKCa通道的人工脂質(zhì)膜重建準(zhǔn)備了必需的條件。

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Establishment of inducible BKCacell line and purification of the recombinant protein*

Mao Liang, Cheng Jun, Huang Wen-jun, Tan Xiao-qiu,Dang Xi-tong,Zeng Xiao-rong, Yang Yan△

(Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education, Institute of Cardiovascular Research,Southwest Medical University, Sichuan Luzhou 646000)

Objective：To construct an inducible BKCa-pcDNA5-293 stable cell line and purify the BKCa-Flag fusion protein. Methods: The BKCaORF amplified from human mesenteric vascular smooth muscle cells was cloned into pcDNA5/FRT/TO/FLAG expression vector, which was transiently transfected intoFlp-InTMT-RExTM-293 cells and positive clones were selected using hygromycin B. The recombinant protein was induced by tetracycline and purified using anti-Flag affinity chromatography. The authenticity of the recombinant BKCachannel was confirmed by Western blot and its electrophysiological features were characterized by single channel patch clamp. Results: The BKCa-pcDNA5-293cell line expressed abundant BKCa-Flag fusion protein after induction with tetracycline. The conductance values of single BKCachannel current were 213.39 ± 9.52 pS (n=15, cell-attached) and 225.72 ± 10.61 pS (n=13, inside-out), which are typical features of BKCachannels observed in human mesenteric artery smooth muscle cells, such as large conductance, voltage dependence, calcium sensitivity and IbTX sensitivity. The recombinant BKCawas also extracted and purified to about 89%.Conclusion: A tetracycline-inducibleBKCa-pcDNA5-293stable cell line was successfully established, and the recombinant BKCachannels were functional. The stable cell line can be used for further characterizing the functions of BKCachannels and lead drug screening.

Stable cell line; Recombinant BKCaprotein; Patch clamp

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81173661)，四川省教育廳項(xiàng)目(編號(hào)：11ZB224)，四川省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)(編號(hào)：130277)，瀘州市科技局項(xiàng)目(編號(hào)：2014-S-44 (6/8))，瀘州醫(yī)學(xué)院院級(jí)課題資助。

毛亮，男，助理研究員，主要從事心血管分子生物學(xué)研究，Email：maoliang@scmu.edu.cn。

△通訊作者：楊艷，女，教授，主要從事心血管藥理學(xué)研究，Email：wyangyan@scmu.edu.cn。

2017-2-24)