陳洽銘 韋金星 李曉輝*

基因NEK9在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)效應(yīng)及其臨床意義

陳洽銘1韋金星2李曉輝1*

目的研究基因NEK9在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)效應(yīng)，并探討其表達(dá)量與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法收集從2010～2011年我院60例原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者肝癌組織及其配對(duì)癌旁組織，并統(tǒng)計(jì)分析其臨床病理資料；同時(shí)采用熒光定量PCR、免疫組化方法檢測肝癌組織和癌旁組織中NEK9基因和蛋白的表達(dá)水平，分析NEK9的表達(dá)量與其相對(duì)應(yīng)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果相對(duì)于癌旁組織，肝細(xì)胞癌組織中基因NEK9的表達(dá)量在mRNA水平顯著高表達(dá)（25/30）（P＜0.05），在蛋白質(zhì)水平亦呈顯著高表達(dá)（65%及21.7%）（P＜0.05）；癌組織中NEK9的表達(dá)水平與TNM分期、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等臨床病理參數(shù)有相關(guān)性（P＜0.05）；癌組織中NEK9高表達(dá)組患者的術(shù)后無瘤生存時(shí)間較低表達(dá)組明顯縮短（P＜0.05）。結(jié)論原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中NEK9的高表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，并有可能成為預(yù)測肝癌患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。

原發(fā)性肝細(xì)胞癌；NEK9；腫瘤轉(zhuǎn)移；復(fù)發(fā)

肝細(xì)胞癌（HCC）是世界上高發(fā)惡性腫瘤之一，尤其在中國，其發(fā)病率、死亡率嚴(yán)重影響國民的健康狀況［1，2］。盡管目前肝細(xì)胞癌的診療有很大進(jìn)步，包括手術(shù)、化療、放療等，但由于高復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等特性，目前其預(yù)后仍不容樂觀。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步給腫瘤的診斷和治療提供了新思路，尋找肝細(xì)胞癌早期診斷、預(yù)后判斷、確定治療決策的分子標(biāo)志物及其作用機(jī)制仍是肝癌研究的重要內(nèi)容［3］。

Nek9，又稱NIMA相關(guān)蛋白激酶9，為Nek家族蛋白之一［4］。在很多惡性腫瘤中，Nek蛋白激酶均出現(xiàn)異常表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期的調(diào)控異常、非正常增殖，最終影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。其家族蛋白Nek2、Nek6、Nek7在乳腺癌、膽管癌、卵巢癌中都有高度表達(dá)現(xiàn)象［5-7］，然而Nek9蛋白在肝癌中的表達(dá)、臨床預(yù)后的關(guān)系及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展、生物學(xué)行為尚未見系統(tǒng)報(bào)道。

本研究應(yīng)用熒光定量PCR和免疫組化的方法分析原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中NEK9的表達(dá)情況及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，并探討其在肝癌復(fù)發(fā)、預(yù)后中可能存在的作用，為肝癌的診斷與治療提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本

組織標(biāo)本來自2010年到2011年期間在廣東普寧人民醫(yī)院普外科行肝細(xì)胞癌切除術(shù)患者，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞癌，共計(jì)60例，所取組織為距癌灶邊緣1 cm以內(nèi)且無壞死的癌組織，和距癌灶邊緣至少2 cm的癌旁組織，均有保存完好的新鮮冰凍組織和石蠟包埋組織。所有病例均有完整的臨床資料和隨訪資料（5年周期）。

1.2 主要試劑

RNAiso試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光染料試劑SYBR Green IMaster購自日本Takara公司；NEK9兔多克隆抗體購自美國ABclonal公司，通用型二步檢測法試劑盒（PV?3000）、二氡基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 熒光定量PCR檢測NEK9mRNA的表達(dá)

按照RNAiso RNA提取試劑盒說明書提取新鮮冰凍組織總RNA。以紫外分光光度計(jì)測總RNA純度及濃度。cDNA的合成按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進(jìn)行。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)所用引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，以GAPDH作為內(nèi)參。引物序列見表1。反應(yīng)體系的配制及反應(yīng)條件的設(shè)置均按照熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行。計(jì)算得到的mRNA相對(duì)表達(dá)量數(shù)值，以中位數(shù)為截?cái)嘀?，將NEK9mRNA的表達(dá)水平分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。

1.4 免疫組化檢測

NEK9蛋白質(zhì)的表達(dá)：石蠟標(biāo)本切成約4μm切片，經(jīng)常規(guī)烤片，脫蠟，水化，微波爐法抗原修復(fù)15min，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶15min，孵育一抗（1∶100）4℃過夜，次日二抗孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.5 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

NEK9蛋白質(zhì)的表達(dá)部位為細(xì)胞質(zhì)，我們定義細(xì)胞質(zhì)被染色為淺棕色至深褐色的肝細(xì)胞為陽性細(xì)胞，先按著色強(qiáng)度，對(duì)癌組織進(jìn)行評(píng)分：無著色記為0分，輕度著色記為1分，深度著色記為2分。然后評(píng)估陽性細(xì)胞占總體細(xì)胞的比例，記為1%～25%記為1分，26%～50%記為2分，＞50%記為3分。最后，取著色強(qiáng)度以及陽性細(xì)胞分布得分的乘積為肝細(xì)胞組織NEK9蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。根據(jù)免疫組化評(píng)分中位數(shù)，將肝癌組織NEK9蛋白質(zhì)的表達(dá)水平分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。

1.6 病例隨訪

所有病例術(shù)后經(jīng)門診和電話隨訪，隨訪時(shí)間自患者手術(shù)日起至2015年12月。3次經(jīng)上述方式無法聯(lián)系的患者，定為失訪病例。至隨訪截止日期，失訪2例，以最后一次聯(lián)系時(shí)間為隨訪終點(diǎn)。復(fù)發(fā)的確診根據(jù)CT、MRI、AFP升高水平、肝動(dòng)脈造影和（或）組織病理學(xué)結(jié)果綜合評(píng)價(jià)而定。轉(zhuǎn)移的定義為：術(shù)前發(fā)生癌栓（包括門靜脈、膽管、動(dòng)脈癌栓）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝外轉(zhuǎn)移。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行處理，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。NEK9 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)分類與臨床病理參數(shù)分類之間的比較采用卡方檢驗(yàn)。癌組織中NEK9不同表達(dá)強(qiáng)度的復(fù)發(fā)情況的比較采用Kaplan?Meier生存分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NEK9mRNA在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

熒光定量PCR結(jié)果顯示：在30例肝癌患者組織中，肝癌組織的NEK9mRNA表達(dá)水平高于其配對(duì)的癌旁組織（如圖1）。

圖1 NEK 9m RNA在肝癌組織中的表達(dá)情況

2.2 NEK9蛋白質(zhì)在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

在60例肝癌患者中，39例患者的NEK9蛋白質(zhì)表達(dá)為陽性（圖2A、B、C），癌組織中的陽性率為65%；在60例肝癌患者的癌旁組織中，13例患者的NEK9蛋白質(zhì)表達(dá)為陽性，癌旁組織中的陽性率為21.7%（表2）。說明無論是在mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平，NEK9在癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（P＜0.05）。

2.3 NEK9的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

癌組織中NEK9蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與甲胎蛋白含量、腫瘤大小、TNM分期、是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)（P＜0.05），與性別、年齡、腫瘤數(shù)量等相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

圖2 NEK 9蛋白質(zhì)在肝癌組織中的表達(dá)情況

表2 肝癌患者癌組織與癌旁組織中NEK 9蛋白質(zhì)表達(dá)水平（n）

2.4 NEK9的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

在術(shù)后無瘤生存時(shí)間上NEK9蛋白質(zhì)陽性組較陰性組的無瘤生存時(shí)間顯著縮短（P＜0.05，圖3）。癌組織中NEK9高表達(dá)提示預(yù)后不良。

圖3 NEK 9在肝癌組織中的表達(dá)與患者術(shù)后無瘤生存曲線情況

表3 肝癌患者癌組織中NEK 9蛋白質(zhì)表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（n）

3 討論

原發(fā)性肝癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，由于缺乏有效的治療手段，其干預(yù)依舊是巨大的挑戰(zhàn)［8］。目前肝癌的治療手段包括：手術(shù)切除、TACE、射頻消融、無水酒精注射、冷凍技術(shù)、肝移植、口服靶向藥物索拉非尼及放化療，其中手術(shù)切除及肝移植手術(shù)是目前效果比較確切、首先的治療方案。但由于肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率均相對(duì)較高，其5年總生存率僅達(dá)17%到53%，確診后的平均生存時(shí)間為6到20個(gè)月［9，10］。腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移是多因素、長期累積突變的過程，其發(fā)生機(jī)制可能為腫瘤的治療帶來新的希望。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步，尋找肝細(xì)胞癌新靶標(biāo)成為了可能，其發(fā)現(xiàn)可為臨床決策提供關(guān)鍵性指導(dǎo)作用［11，12］。

NIMA蛋白激酶，又稱Nek家族蛋白，是1975年Morris發(fā)現(xiàn)并以構(gòu)巢曲霉菌蛋白激酶命名的一種激酶，參與廣泛的有絲分裂進(jìn)程［13］。哺乳動(dòng)物的NIMA基因編碼11種NIMA激酶，作為有絲分裂進(jìn)展中的關(guān)鍵分子，參與了許多重要的有絲分裂過程，如有絲分裂前期中的中心體分離，染色體濃縮，前中期中的核膜破裂和紡錘體組裝，以及有絲分裂周期的退出和細(xì)胞骨架分離［14］。由于腫瘤細(xì)胞是一種以細(xì)胞增殖、分化以及凋亡異常為特征的疾病，其主要特點(diǎn)是細(xì)胞的無限增殖能力和細(xì)胞周期的異常調(diào)控。近年來，腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控，尤其是中心體以及其相關(guān)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的作用，逐漸受到關(guān)注［15］。由于NIM家族蛋白在細(xì)胞分裂中紡錘體形成、中心體形成等過程起著重要的作用，其功能亦收到廣泛關(guān)注。文獻(xiàn)表明Nek2、Nek6、Nek7等家族蛋白在乳腺癌、膽管癌、卵巢癌等多種腫瘤都有高表達(dá)現(xiàn)象［5-7］。然而Nek9蛋白在肝癌中的表達(dá)、臨床預(yù)后的關(guān)系及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展、生物學(xué)行為尚未見系統(tǒng)報(bào)道。

本研究首次發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌組織中NEK9的表達(dá)明顯升高，且NEK9的表達(dá)水平與腫瘤大小、TNM分期、是否發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)高度相關(guān)。此外癌組織中NEK9高表達(dá)組患者，其術(shù)后無瘤生存時(shí)間相比NEK9低表達(dá)組明顯縮短。因此，我們推測Nek9的高表達(dá)可能影響肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，可提示患者的預(yù)后不良。

Nek9屬于NIMA蛋白激酶家族，是一分子量107kD的多肽，它的氨基催化末端連接有一段與RCC1同源的序列，后者是小G蛋白R(shí)an的交換因子。在細(xì)胞分裂間期，Nek9的RCC1區(qū)域可以直接與激酶的活性部位結(jié)合起自身抑制作用。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Nek9與γ-tubulin蛋白共沉淀，并且激活的Nek9多肽在早期細(xì)胞分裂過程中定位于中心體和紡錘體極上［16，17］。文獻(xiàn)表明，Nek9在食管癌［18］、頭頸部腫瘤［19］等部位有異常表達(dá)現(xiàn)象，而在p53敲低的SW480腸癌細(xì)胞株［18］、胃癌細(xì)胞株［20］中，扮演著調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖的重要作用，這提示Nek9與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。而我們研究發(fā)現(xiàn)Nek9的高表達(dá)與肝癌病灶的大小、復(fù)發(fā)具有高度相關(guān)性，這提示Nek9在原發(fā)性肝癌中起著促癌的作用，另外，由于NEK9蛋白激酶的表達(dá)或功能異常與肝癌的發(fā)生、發(fā)展具有高度相關(guān)性，這亦為肝癌的腫瘤的發(fā)病機(jī)制及新型治療策略提供了進(jìn)一步研究的新方向。

綜合上述，原發(fā)性肝細(xì)胞癌NEK9的表達(dá)量，在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均有高陽性率現(xiàn)象，其表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)等臨床病理參數(shù)高度有關(guān)，生存分析亦提示NEK9高表達(dá)組患者的預(yù)后較差。因此，我們認(rèn)為NEK9是一個(gè)具有提示肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移潛在價(jià)值的新型腫瘤標(biāo)志物，有助于肝癌的早期診斷、早期治療以及預(yù)后判斷，但NEK9在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］Cha C，F(xiàn)ong Y，Jarnagin WR，et al.Predictors and patterns of recurrence after resection of hepatocellular carcinoma［J］.J Am Coll Surg，2003，197（5）：753-758.

［2］Chen W，Zheng R，Zeng H，et al.Annual report on status of cancer in China，2011［J］.Chin JCancer Res，2015，27（1）：2-12.

［3］Waidely E，Al?Yuobi AR，Bashammakh AS，et al.Serum pro?tein biomarkers relevant to hepatocellular carcinoma and their detection［J］.Analyst，2016，141（1）：36-44.

［4］夏云飛，顧志峰，李立人，等.Nek家族的研究進(jìn)展及其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2010，（14）：2131-2134.

［5］Hayward DG，Clarke RB，F(xiàn)aragher AJ，et al.The centrosomal kinase Nek2 displays elevated levels of protein expression in human breast cancer［J］.Cancer Res，2004，64（20）：7370-7376.

［6］O′Regan L，F(xiàn)ry AM.The Nek6 and Nek7 protein kinases are required for robust mitotic spindle formation and cytokinesis［J］.Mol Cell Biol，2009，29（14）：3975-3990.

［7］He Y，Zeng MY，Yang D，et al.NEK7 is an essentialmedia?tor of NLRP3 activation downstream of potassium efflux［J］. Nature，2016，530（7590）：354-357.

［8］Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer JClin，2015，65（2）：87-108.

［9］Cariani E，PilliM，Zerbini A，et al.Immunological andmolec?ular correlates of disease recurrence after liver resection for he?patocellular carcinoma［J］.PLoSOne，2012，7（3）：e32493.

［10］Helal TA，Radwan NA，Shaker M.Extrahepatic metastases as initialmanifestations of hepatocellular carcinoma：an Egyptian experience［J］.Diagn Pathol，2015，10：82.

［11］Liu X，Huang Y，Yang D，etal.Overexpression of TRIM24 is associated with the onset and progress of human hepatocellular carcinoma［J］.PLoSOne，2014，9（1）：e85462.

［12］Ma L，Ji L，Yu Y，et al.Novelmolecular targets for diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma［J］.Discov Med，2015，19（102）：7-14.

［13］Morris NR.Mitotic mutants of Aspergillus nidulans［J］.Genet Res，1975，26（3）：237-254.

［14］Takatani S，Otani K，Kanazawa M，et al.Structure，function，and evolution of plant NIMA?related kinases：implication for phosphorylation?dependentmicrotubule regulation［J］.JPlant Res，2015，128（6）：875-891.

［15］Hsu PK，Chen HY，Yeh YC，et al.TPX2 expression is associ? ated with cell proliferation and patient outcome in esophageal squamous cell carcinoma［J］.JGastroenterol，2014，49（8）：1231-1240.

［16］Gunawardane RN，Lizarraga SB，Wiese C，et al.gamma?Tubu?lin complexes and their role in microtubule nucleation［J］. Curr Top Dev Biol，2000，49：55-73.

［17］Yang SW，Gao C，Chen L，et al.Nek9 regulates spindle orga?nization and cell cycle progression duringmouse oocytemeiosis and its location in early embryomitosis［J］.Cell Cycle，2012，11（23）：4366-4377.

［18］Kurioka D，Takeshita F，Tsuta K，et al.NEK9?dependent pro?liferation of cancer cells lacking functional p53［J］.Sci Rep，2014，4：6111.

［19］Wu Z，Doondeea JB，Gholami AM，et al.Quantitative chemi?cal proteomics reveals new potential drug targets in head and neck cancer［J］.Mol Cell Proteomics，2011，10（12）：M111-M11635.

［20］李進(jìn)晶，胡思雋，趙曉迪，等.Robo1與Nek9相互作用并影響胃癌細(xì)胞遷移［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，（18）：3409-3412.

The expression of gene NEK 9 and its concerned clinical significance in HC C

CHEN Qiaming1，CHEN Chunna2，Wei Jinxing2，LIXiaohui1.1Department ofSurgery，Puning People′s Hospital，Puning，Guangdong 515300，China；2Department ofHepatobiliary Surgery，Sun Yat?sen Memorial Hospital，Sun Yat?sen University，Guangzhou 510120，China.Corresponding author：LIXiaohui，342152819@qq.com

Objective To investigate the expression of NEK9 in hepatocellular carcinoma（HCC）tissues and its correlation with clinical pathological parameters.M ethods Sixty cases of primary HCC tissues，paired normal tissues and their clinical data were collected in our hospital during 2010 to 2011.The mRNA level expression of NEK9 was determined by qRT?PCR.The protein expression of NEK9 was detected by immunohistochemical staining.Then the relationship of NEK9 expression and clinical pathological parameters were analyzed.Results Compared to the paired normal tissues，the expression of NEK9wasexplored to bemuch higher in primary HCC tissues，both atmRNA level（25/30）（P＜0.05），and at protein level（65%and 21.7%）（P＜0.05）.The expression of NEK9 was found to be correlated with tumor size，TNM stagemetastasis and recurrence and tumor?free survival time（P＜0.05）. Conclusion Theover?expression ofNEK9 isconcernedwith tumorsize，TNM stage，metastasis，recurrence and tumor?free survival time，andmaybe a potentialmarker for early diagnosis and prognosis of HCC.

hepatocellular carcinoma；NEK9；metastasis；recurrence

R735.7

A

10.3969/j.issn.1009?976X.2017.03.003

2017-03-28）

1515300廣東揭陽普寧人民醫(yī)院普通外科；2510120廣州中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院肝膽外科

*通訊作者：李曉輝，Email：342152819@qq.com