郭駿，陳玉媛，葉楓，李斌，徐傳瑞，

1華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院，武漢 4300302華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院兒科，武漢 430030

非諾貝特緩解非酒精性脂肪性肝病的體外機制研究

郭 駿1， 陳玉媛1， 葉 楓2△， 李 斌1， 徐傳瑞1，

1華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院，武漢 4300302華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院兒科，武漢 430030

目的 利用細胞模型研究非諾貝特在緩解非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中的作用及其分子機制。方法 首先以0～0.9 mmol/L梯度濃度的油酸處理正常肝細胞LO2 48 h建立脂肪肝細胞模型；同時，以非諾貝特處理正常細胞或模型組細胞48 h，然后用CCK-8試劑盒測定細胞活力，用油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂滴形成或抑制情況，利用試劑盒檢測細胞中的三酰甘油(TG)以及上清液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平，蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測細胞中蛋白激酶B(AKT)、p-AKT、FSAN及Nrf2蛋白水平，并使用2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)檢測細胞內(nèi)的活性氧自由基(ROS)含量。結(jié)果 油酸濃度超過0.5 mmol/L后細胞活力顯著降低，非諾貝特可抑制高濃度油酸對細胞的損傷。油酸處理后細胞中出現(xiàn)大量脂滴，細胞內(nèi)TG含量以及上清液中的ALT、AST水平顯著升高，給予非諾貝特處理后細胞中脂滴減少，TG、ALT和AST含量均顯著降低。油酸處理后細胞中AKT、p-AKT、FSAN和Nrf2蛋白水平升高，給予非諾貝特可抑制上述蛋白水平的升高。同時，非諾貝特逆轉(zhuǎn)了由油酸導致的細胞內(nèi)ROS累積。結(jié)論 非諾貝特可以抑制油酸引起的脂肪積累，并緩解脂肪累積導致的細胞損傷，其機制是通過下調(diào)AKT/FSAN信號通路，從而降低ROS水平，進而減少ROS導致的細胞損傷。

非酒精性脂肪性肝??； 非諾貝特； 蛋白激酶B(AKT)； 活性氧自由基

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一類與乙醇攝入以及丙型肝炎病毒等其它明確肝損傷因素無關(guān)的、以肝細胞脂肪變性及脂質(zhì)蓄積為特點的肝臟疾病[1]。隨著生活水平提高，世界范圍內(nèi)的肥胖人群越來越多[2]，歐洲地區(qū)有超過50%人群超重，23%的女性以及20%的男性為肥胖人群[3]。成年肥胖人群中NAFLD的發(fā)病率高達80%～90%[4]，其中40%～50%發(fā)展為肝纖維化[5]，NAFLD正嚴重威脅人類健康。雖然有大量研究聚焦于此，但是對于其發(fā)病機制以及過程所知有限[6]。非諾貝特已應用于臨床多年，具有良好的降低血脂功能。同時，研究發(fā)現(xiàn)非諾貝特可以抑制非酒精性脂肪肝發(fā)展并緩解非酒精性脂肪肝肝炎，但其作用機制還不清楚[7]。本研究中，我們建立了NAFLD的體外模型，并利用該模型研究了非諾貝特對NAFLD的保護作用及其分子機制。我們的結(jié)果顯示非諾貝特的降脂作用抑制了蛋白激酶B(AKT)信號通路，并降低了活性氧自由基(ROS)水平，進而減少了ROS導致的肝損傷。因此我們的研究在細胞水平上揭示了非諾貝特治療NAFLD的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人正常肝細胞LO2購自武漢大學細胞典藏中心；DMEM培養(yǎng)液以及胎牛血清均購自美國Gibco公司；三酰甘油(TG)測定試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒以及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；細胞活力測定試劑盒CCK-8、油紅O、油酸、DCFH-DA均購于美國Sigma公司；非諾貝特購自百靈威科技有限公司；AKT、p-AKT、FSAN、Nrf2以及β-actin蛋白抗體均購自美國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及NAFLD模型的建立 LO2細胞接種于含10%胎牛血清(FBS)以及100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2及飽和濕度環(huán)境下進行培養(yǎng)。待細胞匯合達75%后用含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)濃度為0.25%的胰酶進行消化后傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的LO2細胞進行鋪板，12孔板按5×104/孔接種細胞，待細胞生長24 h后，對細胞進行換液，同時按照油酸濃度為0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9 mmol/L的梯度進行給藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進行油紅O染色，觀察細胞內(nèi)脂滴的分布情況，當油酸濃度到達0.5 mmol/L時，與對照組相比，細胞內(nèi)脂滴明顯增多，差異顯著，由此確定LO2細胞NAFLD模型造模成功。

1.2.2 CCK-8試劑盒檢測細胞活力 取匯合達75%生長良好的LO2細胞，利用胰酶消化后加入適量培養(yǎng)液調(diào)整細胞懸液濃度為5×104/mL，之后以100 mL/孔的量接種于96孔板中進行培養(yǎng)，預培養(yǎng)24 h待細胞完全貼壁生長后加入不同濃度的油酸或非諾貝特繼續(xù)培養(yǎng)48 h，之后加入CCK-8溶液使其終濃度為10 μg/mL，37℃孵育1.5 h，在450 nm波長下測定吸光度(A)值計算細胞活力。細胞活力(%)=(A給藥-A空白)/(A0給藥-A空白)×100%。其中，A給藥：具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A空白：具有培養(yǎng)液和CCK溶液而沒有細胞的孔的吸光度；A0給藥：具有細胞、CCK溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。

1.2.3 油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂滴 取匯合達75%生長良好的LO2細胞，利用胰酶消化后加入適量培養(yǎng)液調(diào)整細胞懸液濃度，按5×104/孔接種于12孔板中，預培養(yǎng)24 h待細胞完全貼壁生長后加入不同濃度的油酸或非諾貝特繼續(xù)培養(yǎng)48 h，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細胞2次后加入10%中性甲醛固定10 min，加入油紅O溶液避光孵育15 min，去除染液加入75%乙醇浸沒5 min，PBS沖洗2次后加入蘇木精染液復染1 min，雙蒸水漂洗2次后顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 TG、ALT、AST試劑盒檢測TG及培養(yǎng)上清ALT及AST水平 取匯合達75%生長良好的LO2細胞，利用胰酶消化后加入適量培養(yǎng)液調(diào)整細胞懸液濃度，按105/孔接種于6孔板中，預培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的油酸或非諾貝特繼續(xù)培養(yǎng)48 h，之后收集上清液利用試劑盒測定ALT及AST。PBS浸潤下將細胞刮下再利用超聲破碎細胞，利用試劑盒測定細胞中TG水平。

1.2.5 Western blot檢測細胞AKT、p-AKT、FSAN、Nrf2蛋白含量 如1.2.4項所述用油酸或非諾貝特處理細胞，之后加入含蛋白酶抑制劑(cocktail)的裂解液冰上裂解細胞，離心收取上清液后利用BCA試劑盒測定相應蛋白濃度，所有樣品根據(jù)蛋白定量結(jié)果上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上后，低脂牛奶孵育后分別進行一抗和二抗雜交。然后膠片曝光分析各個樣品中蛋白的相對含量并以蛋白β-actin作為內(nèi)參。即測量各條帶的吸光度，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin吸光度的比值來反映目的蛋白的相對表達量。

1.2.6 ROS試劑盒檢測細胞ROS含量 如1.2.4項所述用油酸或非諾貝特處理細胞，之后去除培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)液配制的終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA溶液，于37℃孵育20 min后，以無血清培養(yǎng)液洗滌3次，于熒光顯微鏡下觀察熒光的強弱并使用酶標儀測定吸光度值進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 非諾貝特抑制油酸導致的細胞損傷

首先建立了NAFLD細胞模型并檢測了高脂培養(yǎng)下的細胞活力。如圖1所示，當油酸濃度超過0.4 mmol/L后隨著油酸濃度升高LO2細胞活力迅速降低，當濃度達到0.9 mmol/L時LO2的細胞活力小于對照組的10%。結(jié)果表明，高濃度的油酸具有細胞毒性。油酸濃度為0.9 mmol/L時細胞活力值低于對照組的10%，不利于觀察非諾貝特的逆轉(zhuǎn)作用，0.6 mmol/L時細胞活力為對照組的40%，細胞本身就可恢復活力，不利于觀察非諾貝特的保護作用，而0.8 mmol/L時細胞活力約為對照組的25%，故選擇0.8 mmol/L的油酸濃度用于后續(xù)實驗。

非諾貝特處理對細胞活力的影響如圖1所示，0.8 mmol/L油酸可顯著抑制LO2的細胞活力，而給予非諾貝特進行干預可部分恢復LO2的細胞活力且呈現(xiàn)濃度依賴性，當非諾貝特濃度達到20 mmol/L時細胞活力可恢復至80%以上。該結(jié)果說明，在利用油酸制備的NAFLD細胞模型中，非諾貝特可以有效抑制細胞損傷。

與正常組比較，**P<0.01；n=3圖1 油酸及非諾貝特對LO2細胞活力的影響Fig.1 Effects of oleic acid and fenofibrate on cell viability of LO2

2.2 非諾貝特抑制胞內(nèi)脂滴累積

在給予油酸處理LO2細胞48 h后進行油紅O染色以觀察細胞內(nèi)脂滴的累積情況。如圖2所示，對照組細胞形態(tài)規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)無明顯紅色或僅為淡紅色；而油酸處理后的細胞可觀察到隨油酸濃度的升高細胞內(nèi)紅色加深，范圍擴大。0.8 mmol/L油酸誘導的同時給予非諾貝特進行干預，可見細胞內(nèi)的紅色變淡，范圍變小。這些結(jié)果表明高濃度油酸可以導致脂肪在細胞內(nèi)大量累積，而非諾貝特可以抑制脂肪在細胞內(nèi)的累積。

A：0 mmol/L油酸；B：0.2 mmol/L油酸；C：0.4 mmol/L油酸；D：0.8 mmol/L油酸；E：0.8 mmol/L油酸+20 mmol/L非諾貝特圖2 油紅O染色觀察LO2細胞內(nèi)脂滴(×200)Fig.2 LO2 cells are stained with oil red O and observed by microscope(×200)

2.3 非諾貝特顯著降低細胞中TG含量

如圖3所示，油酸可誘導細胞內(nèi)TG的大量積累，且細胞內(nèi)TG含量隨油酸濃度升高而升高，呈現(xiàn)濃度依賴性。在給予非諾貝特干預后細胞中的TG含量有一定的下降，且非諾貝特濃度為20 mmol/L時，TG含量下降最明顯。該結(jié)果說明非諾貝特抑制了細胞內(nèi)TG的合成。

與正常組比較，*P<0.05 **P<0.01，與0.8 mmol/L油酸組比較，##P<0.01；n=3圖3 油酸及非諾貝特對LO2細胞中TG含量影響Fig.3 Effects of oleic acid and fenofibrate on TG level in LO2 cells

2.4 細胞培養(yǎng)上清液中ALT及AST含量變化

如圖4所示，給予油酸處理48 h后，上清液中ALT及AST變化趨勢一致，隨油酸濃度的升高而升高。在給予非諾貝特干預后，ALT及AST變化趨勢依然保持一致，與0.8 mmol/L油酸組相比，加入非諾貝特干預后上清液中的ALT及AST含量顯著降低，接近正常組含量。這說明非諾貝特確實抑制了高脂導致的細胞損傷。

2.5 非諾貝特降低細胞AKT、p-AKT、FASN及Nrf2含量

在油酸處理以及非諾貝特干預后利用Western blot檢測了細胞中AKT、p-AKT、FASN及Nrf2蛋白含量變化。結(jié)果如圖5所示，油酸處理后細胞中與脂質(zhì)合成和代謝相關(guān)的信號通路蛋白AKT、p-AKT以及FASN酶均顯著升高，而在給予非諾貝特干預后與單獨油酸處理組相比，細胞中的AKT、p-AKT及FASN的蛋白含量均明顯下降。油酸處理后細胞中促進氧化應激的蛋白Nrf2上調(diào)，而加入非諾貝特后Nrf2顯著降低。這些結(jié)果說明非諾貝特抑制了脂肪合成后，下調(diào)了AKT相關(guān)通路以及與氧化應激相關(guān)的Nrf2因子水平。

2.6 非諾貝特降低細胞內(nèi)ROS含量

給予油酸及非諾貝特處理48 h后通過DCFH-DA染色后在熒光顯微鏡下觀察，同時使用酶標儀定量分析比較油酸以及非諾貝特對LO2細胞內(nèi)ROS含量的影響。結(jié)果如圖6所示，給予0.8 mmol/L油酸處理后細胞內(nèi)ROS水平顯著上升，而在非諾貝特的干預后ROS降低至接近正常細胞水平。

與正常組比較，*P<0.05 **P<0.01；與0.8 mmol/L油酸組比較，#P<0.05 ##P<0.01；n=3圖4 油酸及非諾貝特作用下上清液中ALT、AST含量變化Fig.4 Effect of oleic acid and fenofibrate on ALT and AST levels in supernatant

圖5 LO2細胞中AKT、p-AKT、FASN、Nrf2蛋白含量Fig.5 Protein expression levels of AKT，p-AKT，F(xiàn)ASN and Nrf2 in LO2 cells

3 討論

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是目前研究最熱門的疾病之一，也是我國愈來愈常見的慢性肝病，發(fā)病率高達20%～27%[8]。NAFLD是一種以TG為主的脂類物質(zhì)在肝臟中蓄積導致病理改變的肝臟疾病[9]，臨床上還伴有血清中ALT及AST升高，并將此作為診療依據(jù)之一[10-12]。

A：顯微鏡下觀察細胞熒光(×200)；B：酶標儀定量檢測熒光強度；與正常組比較，**P<0.01；與0.8 mmol/L油酸組比較，##P<0.01；n=6圖6 DCFH-DA染色檢測細胞內(nèi)ROS水平Fig.6 ROS level in LO2 cells detected by DCFH-DA staining

非諾貝特是一種氯貝丁酸衍生物類血脂調(diào)節(jié)藥，通過抑制極低密度脂蛋白和TG的生成并同時促進其分解代謝，進而降低血低密度脂蛋白、膽固醇和TG水平。在近些年的一些研究中，逐漸發(fā)現(xiàn)非諾貝特對NAFLD有一定的治療作用[7，13]。這說明非諾貝特可以抑制脂肪在肝臟中的積累，并抑制脂肪肝導致的損傷，但其作用機制還不甚清楚。

本研究中，我們利用NAFLD細胞模型，首先觀察了非諾貝特對高脂LO2細胞活力的影響。我們發(fā)現(xiàn)油酸對LO2具有顯著的細胞毒性，而非諾貝特處理后細胞活力得到恢復，這與其對NAFLD的治療特性一致[14-15]。這個結(jié)果也說明利用細胞模型研究非諾貝特對NAFLD的保護機制是可行的。

我們進一步研究了非諾貝特對脂肪肝脂肪積累的影響以及抑制肝損傷的作用。通過油紅O染色觀察到油酸誘導LO2細胞中的脂滴大量累積，同時測得TG、ALT、AST含量升高，所有結(jié)果均表明本研究中建立的體外模型與臨床實際表現(xiàn)一致。在給予非諾貝特干預后細胞內(nèi)脂滴減少、TG、ALT、AST含量降低，這些結(jié)果表明非諾貝特抑制脂肪積累后降低了脂肪積累導致的肝臟損傷。

大量研究表明NAFLD的發(fā)生發(fā)展與PI3K/AKT信號通路激活[16-17]以及氧化應激[18-19]密切相關(guān)，且脂肪酸合成酶作為脂肪酸合成代謝的限速酶在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要角色[20-21]，通過檢測油酸以及非諾貝特處理后細胞中的AKT、p-AKT、FASN等脂肪合成相關(guān)蛋白，證實了非諾貝特可以逆轉(zhuǎn)由油酸誘導的AKT信號通路的活化。

另外，大量文獻報道脂肪合成過多會導致胞內(nèi)ROS水平上升，從而導致肝臟損傷[18-19]。我們的研究也顯示非諾貝特處理后，細胞內(nèi)的ROS水平顯著下降，同時ROS相關(guān)細胞因子Nrf2水平也顯著降低，這些結(jié)果表明非諾貝特對脂肪性肝炎的保護作用與下調(diào)ROS水平、抑制氧化應激導致的細胞損傷有關(guān)。

綜上所述，本研究通過油酸誘導LO2細胞建立了NAFLD的體外模型，并利用該模型研究非諾貝特對脂肪性肝炎的保護作用機制。我們的結(jié)果在細胞水平證實了非諾貝特通過下調(diào)AKT/FSAN信號通路和降低ROS積累，達到降低脂肪積累和減輕細胞損傷的作用。

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(2017-02-20 收稿)

Therapeutic Effects of Fenofibrate on Nonalcoholic Fatty Liver Diseaseinvitroand Related Mechanism

Guo Jun1，Chen Yuyuan1，Ye Feng2△etal

1DepartmentofPharmacyTongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China2DepartmentofPediatrics，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

Objective To investigate the role of fenofibrate in treating non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)in cellular model and the related mechanism.Methods NAFLD cell model was established by treating LO2 cells with oleic acid (from 0 to 0.9 mmol/L).The cells were treated with fenofibrate (from 0 to 20 mmol/L)for 48 h.CCK-8 kit was used to determine the LO2 cell viability with or without treatment.Oil Red O staining was used to observe lipid droplets in LO2 cells microscopically.Lab-used experiment kits were used to assess TG level in cells and ALT，AST levels in cell supernatants.Protein levels of AKT，p-AKT，F(xiàn)SAN and Nrf2 were detected using Western blotting.DCFH-DA was used to detect reactive oxygen species(ROS)in cells.Results Oleic acid with concentration over 0.5 mmol/L significantly inhibited cell viability.Fenofibrate significantly reversed cytotoxicity induced by high concentration of oleic acid.Lipid droplets and TG within LO2 cells，and ALT/AST in cell supernatant were increased by treatment with oleic acid.Fenofibrate reversed the increase of lipid drops，TG，ALT and AST induced by oleic acid.Oleic acid up-regulated the levels of AKT，p-AKT，F(xiàn)SAN and Nrf2，while fenofibrate reversed the up-regulation of those proteins.Fenofibrate reduced the oleic acid-induced accumlation of ROS in cells.Conclusion Fenofibrate can inhibit lipid accumulation and alleviate cell damage induced by oleic acid through inhibiting AKT/FSAN pathways and reducing ROS levels.

non-alcoholic fatty liver disease； fenofibrate； AKT； reactive oxygen species

R575.5

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.005

郭 駿，男，1993年生，碩士研究生，E-mail：1270079810@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：doctoryf@126.com