王 瑜， 劉思逸， 程玉花， 張 莉， 江 磊， 呂金雷△， 陳欽開

1南昌大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，南昌 3300062江西九江學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，九江 332000

血管緊張素Ⅱ和高糖環(huán)境對大鼠腎小球系膜細胞Toll樣受體4信號通路及炎性因子表達的影響*

王 瑜1， 劉思逸1， 程玉花2， 張 莉1， 江 磊1， 呂金雷1△， 陳欽開1

1南昌大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，南昌 3300062江西九江學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，九江 332000

目的 探討高糖條件下腎小球系膜細胞Toll樣受體4(TLR4)及其信號通路中下游因子MyD88、核因子-κB(NF-κB)以及炎性因子的表達變化，論證高糖環(huán)境下血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)與TLR4的對話關(guān)系，以期闡明TLR4信號通路在糖尿病腎病(DN)發(fā)病機制中的作用。方法 設(shè)計3對針對大鼠TLR4基因的特異性siRNA片段以及帶有綠色熒光的陰性對照，篩選出轉(zhuǎn)染效率最高的siRNA，用于后續(xù)實驗。第1部分實驗在高糖的基礎(chǔ)上分別加入AngⅡ、TLR4 siRNA、血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(ARB)、陰性對照siRNA，探討高糖對各組細胞TLR4、MyD88及NF-κB表達的影響；第2部分實驗在AngⅡ的基礎(chǔ)上分別加入高糖、TLR4 siRNA、ARB、陰性對照siRNA，探討AngⅡ?qū)Ω鹘M細胞TLR4，MyD88及NF-κB表達的影響。采用熒光定量PCR檢測各組TLR4、MyD88 mRNA的表達，Western blot檢測TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表達水平的變化，ELISA法檢測細胞上清液中白細胞介素-6(IL-6)及單核細胞趨化因子-1(MCP-1)的表達情況。結(jié)果 高糖及AngⅡ都可以上調(diào)TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及TLR4、MyD88 mRNA的表達水平(均P<0.05)，也可上調(diào)IL-6及MCP-1的表達(均P<0.01)且二者協(xié)同刺激情況下上調(diào)更明顯。siRNA干擾及ARB可下調(diào)TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及TLR4、MyD88 mRNA的表達，下調(diào)IL-6及MCP-1的表達，與高糖及AngⅡ組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論 高糖環(huán)境和AngⅡ刺激系膜細胞TLR4/MyD88信號通路激活，特異性TLR4 siRNA基因可以部分阻斷由高糖及AngⅡ誘導(dǎo)的TLR4信號的激活，厄貝沙坦也可部分阻斷TLR4信號通路，高糖和AngⅡ共刺激增強由TLR4介導(dǎo)的天然免疫炎癥效應(yīng)，TLR4/MyD88信號通路在此效應(yīng)中扮演重要角色；TLR4 siRNA基因沉默技術(shù)為尋找DN的治療方法提供了新思路，也為臨床上使用ARB延緩DN進程提供了新的理論依據(jù)。

糖尿病腎??； 高糖； 血管緊張素Ⅱ； 系膜細胞； Toll樣受體4； 天然免疫應(yīng)答； 炎性因子

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)病涉及遺傳因素、代謝異常、血流動力學(xué)改變、細胞因子、氧化應(yīng)激等因素[1]。除此以外，近年來免疫炎癥機制備受關(guān)注，1997年P(guān)ickup等[2]首先提出糖尿病可能是一種體內(nèi)免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)的急性時相反應(yīng)。已有研究證明[3]，DN患者體內(nèi)的C-反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)、IL-6等炎癥因子的濃度較正常人明顯升高，提示在糖尿病腎病的發(fā)病過程中，免疫炎癥系統(tǒng)起著重要的作用，為DN發(fā)病機制的研究提供了新的思路[2]。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，可以識別胞外抗原，并向胞內(nèi)傳遞，進一步引發(fā)體內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)[4]。TLR4為TLRs家族成員，為Ⅰ型跨膜蛋白，與相應(yīng)配體結(jié)合后可激活核因子-κB(NF-κB)，誘導(dǎo)炎性因子釋放[5]。國外學(xué)者[6]及本課題前期研究結(jié)果顯示在高糖環(huán)境和糖尿病患者體內(nèi)腎小球系膜細胞及腎小管上皮細胞的TLR4信號通路以及下游的單核細胞趨化因子-1(MCP-1)、IL-1、IL-6等炎癥因子的表達升高，TLR4阻斷劑和血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(ARB)厄貝沙坦等可明顯阻斷該信號通路，上述因子表達明顯下降[7-8]。本研究探討高糖和血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)環(huán)境下HBZY-1細胞TLR4、髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)等的表達變化，同時采用小干擾RNA(siRNA)特異性地下調(diào)高糖環(huán)境中腎系膜細胞TLR4的表達，觀察TLR4、MyD88等的表達變化，為延緩DN的進展開辟新的治療途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

細胞：大鼠腎小球系膜細胞(HBZY-1)(武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心)。目的基因：TLR4 siRNA，上海吉瑪公司設(shè)計并合成，合成基因序列見表1。試劑：DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶(美國HyClone公司)，RNA提取試劑盒、AngⅡ(美國Sigma公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑、PCR試劑及Anti-TLR4抗體、Anti-MyD88抗體(美國Abcam公司)，NF-κB p65抗體、β-actin抗體(ANBO公司)，大鼠IL-6、MCP-1 ELISA試劑盒(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)，山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗(中杉金橋公司)，厄貝沙坦(杭州賽諾菲公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

將生長情況良好的HBZY-1放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其長至70%～80%融合時進行凍存或傳代。細胞消化傳代后重懸、計數(shù)，均勻接種于6孔板，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。于細胞生長至40%～50%時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后PBS洗滌細胞2次，加入低糖培養(yǎng)液2 mL后繼續(xù)培養(yǎng)，分別在12、24、48 h時在熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效果，根據(jù)效果選擇合適的濃度以及時間進行后續(xù)實驗。設(shè)計3對針對大鼠TLR4基因的特異性siRNA(序列見表1)，按照摸索出的最佳轉(zhuǎn)染時間及濃度進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染完成后加入高糖培養(yǎng)液干預(yù)24 h，提取細胞總RNA，熒光定量PCR檢測各組TLR4、MyD88 mRNA的表達，選擇出沉默效果最佳的siRNA進行下一步分組實驗。

1.3 分組

根據(jù)前期實驗結(jié)果，將甘露醇濃度定為25 mmol/L、低糖濃度定為5.6 mmol/L、高糖濃度定為25 mmol/L，AngⅡ為10-7mmol/L，ARB采用厄貝沙坦10-5mmol/L。細胞轉(zhuǎn)染24 h后分以下兩部分干預(yù)，第1部分探討高糖對各組細胞TLR4、MyD88及NF-κB表達的影響，分6組：低糖組、高糖組、高糖+AngⅡ組、高糖+ ARB組、高糖+TLR4 siRNA組、高糖+ScsiRNA組；第2部分探討AngⅡ?qū)Ω鹘M細胞TLR4、MyD88及NF-κB表達的影響，分6組：低糖組、AngⅡ組、高糖+AngⅡ組、AngⅡ+ ARB組、AngⅡ+ TLR4 siRNA組、AngⅡ+ ScsiRNA組。

1.4 Western blot分析各組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的相對表達量

轉(zhuǎn)染后的細胞接種于6孔板并按上述分組干預(yù)12 h后，100 mL細胞裂解液提取總蛋白，再先后進行上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉和一、二抗孵育，洗膜，化學(xué)發(fā)光，顯影，定影。將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)Quantity One分析目標條帶的灰度值，蛋白相對表達量為各目標條帶灰度值/β-actin灰度值。

表1 siRNA序列

1.5 熒光定量PCR檢測各組TLR4、MyD88 mRNA的表達

轉(zhuǎn)染后的細胞接種于6孔板并按上述分組干預(yù)12 h后，Trizol法提取細胞總RNA，Real-time PCR所需引物序列：TLR4上游5′-TCGGTGGTCAGTGTGCTTGTG-3′，下游5′-AAAGCTGAAAGC-GGGGCACTCC-3′，MyD88上游5′-TCAACAA-GCGAGCGCACCGT-3′，下游5′-TGAGCGCGACCAACGGTAGA-3′，β-actin上游5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游5′-AAAGA-AAGGGTGTAAAACGCA-3′。以β-actin為內(nèi)參，cDNA反應(yīng)條件：42℃孵育30 min，85℃加熱5 min，16℃終止反應(yīng)。擴增反應(yīng)條件為94℃ 30 s，94℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)，相對表達量由SDS軟件分析，由ABI 7500實時定量PCR儀得出相對表達量RQ值(RQ值=2-ΔΔCt)。

1.6 ELISA檢測細胞上清液IL-6、MCP-1水平

收集處理24 h后上述各組細胞上清液，按ELISA試劑盒說明書操作，相同標本設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次，在酶標儀450 nm測定吸光度(A)值，根據(jù)標準曲線及A值計算各樣本的相應(yīng)濃度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染時間、濃度摸索及最佳siRNA選擇結(jié)果

熒光顯微鏡下帶有綠色熒光的陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h及48 h時轉(zhuǎn)染效率無顯著差異，但轉(zhuǎn)染48 h時可見細胞死亡率明顯增多，故以下實驗采用的轉(zhuǎn)染時間為24 h。且本實驗轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L時轉(zhuǎn)染效果最佳，見圖1。與陰性對照siRNA比較，siRNA3的TLR4及MyD88 mRNA表達可見明顯下降(P<0.01)，說明siRNA3沉默TLR4信號通路的效果佳，故以siRNA3用于后續(xù)實驗。

熒光顯微鏡下觀察陰性對照siRNA在轉(zhuǎn)染前(A)及轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L、轉(zhuǎn)染時間為24 h的轉(zhuǎn)染效果(B)比較圖1 轉(zhuǎn)染效果對比圖(×200)Fig.1 Comparison of the effect of transfection(×200)

2.2 高糖干預(yù)下的實驗結(jié)果

2.2.1 Western blot檢測各組細胞TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表達 與低糖組相比，高糖及高糖+AngⅡ組的TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表達顯著增加(均P<0.05)；與高糖組及高糖+AngⅡ組相比，高糖+TLR4 siRNA組及高糖+ARB組上述蛋白表達下調(diào)(均P<0.05)，高糖+ScsiRNA組無明顯下降，可排除轉(zhuǎn)染過程的影響，見圖2。

2.2.2 熒光定量PCR檢測各組細胞TLR4、MyD88 mRNA相對表達量 與低糖組相比，高糖及高糖+AngⅡ組的MyD88、TLR4 mRNA的表達顯著增加(均P<0.05)，與高糖組及高糖+AngⅡ組相比，高糖+TLR4 siRNA組及高糖+ARB組上述mRNA表達下調(diào)(均P<0.05)，見圖3。

1：低糖組；2：高糖組；3：高糖+AngⅡ組；4：高糖+ARB組；5：高糖+TLR4 siRNA組；6：高糖+ScsiRNA組；與1組比較，*P<0.05 **P<0.01；與2組比較，#P<0.05 ##P<0.01；與3組比較，△△P<0.01 圖3 熒光定量PCR檢測高糖對MyD88、TLR4 mRNA表達的影響Fig.3 Effect of high glucose on mRNA expression of MyD88 and TLR4(Real-time PCR)

2.3 AngⅡ干預(yù)下的實驗結(jié)果

2.3.1 Western blot檢測各組細胞TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表達 與低糖組相比，AngⅡ組及高糖+Ang Ⅱ組的TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表達顯著增加(均P<0.05)，與AngⅡ組及高糖+AngⅡ組相比，AngⅡ組+TLR4 siRNA組及AngⅡ+ARB組上述蛋白表達下調(diào)(均P<0.05)，見圖4。

1：低糖組；2：AngⅡ組；3：高糖+AngⅡ組；4：AngⅡ+ARB組；5：AngⅡ+TLR4 siRNA組，6：AngⅡ+ScsiRNA組；與1組比較，*P<0.05 **P<0.01；與2組比較，#P<0.05 ##P<0.01；與3組比較，△P<0.05 △△P<0.01圖4 Western blot檢測AngⅡ?qū)LR4、MyD88、NF-κB蛋白表達的影響Fig.4 Effect of AngⅡ on protein expression of MyD88 and TLR4 NF-κB(Western blotting)

2.3.2 熒光定量PCR檢測TLR4、MyD88 mRNA相對表達量 與低糖組相比，AngⅡ組及高糖+AngⅡ組的TLR4、MyD88 mRNA的表達顯著增加(均P<0.01)，與AngⅡ組及高糖+AngⅡ組相比，AngⅡ+TLR4 siRNA組及AngⅡ+ARB組蛋白表達下調(diào)(均P<0.01)，見圖5。

1：低糖組；2：AngⅡ組；3：高糖+AngⅡ組；4：AngⅡ+ARB組；5：AngⅡ+TLR4 siRNA組，6：AngⅡ+ScsiRNA組；與1組比較，**P<0.01；與2組比較，#P<0.05 ##P<0.01；與3組比較，△P<0.05 △△P<0.01 圖5 熒光定量PCR檢測AngⅡ處理組TLR4、MyD88 mRNA的表達Fig.5 Effect of AngⅡ on expression of MyD88 and TLR4 mRNA(Real-time PCR)

2.4 各組細胞上清IL-6、MCP-1水平變化

與低糖組相比，高糖組、AngⅡ組IL-6、MCP-1表達顯著升高，高糖及AngⅡ二者聯(lián)合刺激時上調(diào)更為明顯。與高糖或AngⅡ單獨刺激比較，二者聯(lián)合刺激時表達有顯著性差異。與高糖及AngⅡ組比較，AngⅡ+ARB組及AngⅡ+TLR4 siRNA組IL-6、MCP-1的表達顯著下調(diào)。見表2。

分組IL-6(pg/mL)MCP-1(ng/mL)低糖組18.383±0.6551.150±0.055高糖組46.138±1.592**2.749±0.156**AngⅡ組52.311±1.259**##3.104±0.080**##高糖+AngⅡ組65.511±1.242**##△△3.773±0.140**##△△AngⅡ+ARB組35.242±1.011*##△△1.753±0.124*##△△AngⅡ+TLR4siRNA23.261±1.299*##△△1.417±0.128*##△△AngⅡ+ScsiRNA47.637±1.167**△2.567±0.141**△

與低糖組比較，*P<0.05**P<0.01；與高糖組比較，##P<0.01；與AngⅡ組比較，△P<0.05△△P<0.01

3 討論

糖尿病腎病(DN)是糖尿病患者的主要死因，嚴重威脅人類的健康和生命[9]。DN會引起全身大血管、微血管以及多系統(tǒng)病變，導(dǎo)致體內(nèi)出現(xiàn)復(fù)雜的代謝紊亂，因此當(dāng)疾病進展到終末階段的時候，治療會較其他原發(fā)病導(dǎo)致的腎臟損害棘手[10]。DN的發(fā)病機制復(fù)雜，遺傳因素、糖、脂代謝紊亂、血流動力學(xué)改變、細胞因子等均參與其中[11]。1991年Hasegawa等[12]首次提出炎癥因子可能參與DN的發(fā)病及進展，此后炎癥學(xué)說成為研究熱點。有研究證實DN患者血漿中MCP-1、CRP、TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥反應(yīng)標志物濃度明顯增高[13-14]。DN患者體內(nèi)眾多的免疫炎癥因子以及趨化因子通過級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腎小球系膜細胞增殖、基質(zhì)增生，最終導(dǎo)致腎臟纖維化，促進了DN的進展[15]。1998年P(guān)ickup等[16]進一步提出天然免疫反應(yīng)參與了DN的發(fā)生與發(fā)展。

TLR4是天然免疫炎性反應(yīng)中的一個關(guān)鍵因素，在體內(nèi)的先天性免疫和獲得性免疫之間起著連接和橋梁的作用[17]。在腎臟系統(tǒng)中，上皮細胞、系膜細胞、足細胞等膜表面均有TLR4的分布，主要介導(dǎo)細胞內(nèi)內(nèi)毒素反應(yīng)，其作用主要為通過下游的結(jié)合蛋白最終激活NF-κB途徑并引起炎性介質(zhì)的釋放而加劇DN的進展[18]。TLR4的傳導(dǎo)途徑主要包括兩類：MyD88依賴性及非依賴性途徑[19]。體外實驗表明胰島素抵抗模型大鼠中腎小球系膜細胞的TLR4表達明顯升高，同時伴隨NF-κB的活化及炎癥因子(IL-6、MCP-1)的釋放增加[20]。本研究發(fā)現(xiàn)高糖刺激下腎系膜細胞TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及TLR4、MyD88 mRNA的表達明顯上調(diào)，說明高糖環(huán)境下可能通過激活TLR4/MyD88信號通路對腎系膜細胞炎性反應(yīng)的激活起重要的作用。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS系統(tǒng))的激活是DN病情進展的另一個重要因素，AngⅡ是RAS系統(tǒng)的主要活性物質(zhì)，在腎臟固有細胞中有廣泛的分布[21]。研究表明AngⅡ一方面可引起腎小球血流動力學(xué)紊亂，其高濾過和高內(nèi)壓狀態(tài)會導(dǎo)致基底膜增厚、系膜基質(zhì)擴張，最終加速腎小球局灶性硬化[22]；另一方面Tsan等[23]發(fā)現(xiàn)AngⅡ可以通過AT1R激活NF-κB，導(dǎo)致細胞因子釋放，Singh等[24]發(fā)現(xiàn)AngⅡ刺激腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞、足細胞TLR4、NF-κB的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，在AngⅡ刺激下TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及TLR4、MyD88 mRNA的表達明顯上調(diào)(均P<0.05)，應(yīng)用ARB類藥物厄貝沙坦干預(yù)后，上述指標表達明顯下調(diào)(均P<0.05)，由此可見，腎臟局部RAS系統(tǒng)的激活尤其是AngⅡ可能直接通過刺激TLR4/MyD88信號通路發(fā)揮其非血流動力學(xué)效應(yīng)而上調(diào)炎癥因子表達，參與DN發(fā)病過程。

RNA干擾技術(shù)作為沉默特定基因功能的新技術(shù)，為基因功能研究提供了一個高效、簡便的方法。有研究證明，RNA干擾可下調(diào)高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞的TLR4及其下游炎癥因子的表達[25]，對2型糖尿病模型腎臟有直接保護作用[26-27]。關(guān)于TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染腎小球系膜細胞，減少系膜細胞增生，基質(zhì)增生，炎性因子分泌的研究則較少。我們的研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素受體拮抗劑(ARB)可以顯著降低腎系膜細胞TLR4的表達而調(diào)節(jié)細胞免疫反應(yīng)，為了排除血管緊張素受體的影響，我們設(shè)計了針對TLR4的特異性siRNA，可有效地轉(zhuǎn)染大鼠腎系膜細胞，在高糖和高AngⅡ環(huán)境下仍然有效地下調(diào)TLR4及其下游因子的表達，進一步說明高糖可能刺激TLR4識別內(nèi)源性分子并激活其下游信號通路，產(chǎn)生相應(yīng)的生物效應(yīng)如激活炎癥介質(zhì)。

綜上所述，高糖及AngⅡ可明顯上調(diào)TLR4信號及炎性因子表達；siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)可有效抑制TLR4信號通路及相關(guān)因子表達，厄貝沙坦可部分阻斷TLR4信號通路，高糖和AngⅡ共刺激增強由TLR4介導(dǎo)的天然免疫炎癥效應(yīng)，TLR4/MyD88信號通路是此效應(yīng)的中心環(huán)節(jié)；TLR4 siRNA基因沉默技術(shù)為尋找DN的治療方法提供了新思路，也為臨床上使用ARB延緩DN進程提供了新的理論依據(jù)。

[1] Festa A，D’Agostino R Jr，Tracy R P，et al.Elevated levels of acute-phase proteins and plasminogen activator inhibitor-1 predict the development of type 2 diabetes：the insulin resistance atherosclerosis study[J].Diabetes，2002，51(4)：1131-1137.

[2] Pickup J C，Mattock M B，Chusney G D，et al.NIDDM as a disease of the innate immune system：association of acute-phase reactants and interleukin-6 with metabolic syndrome X[J].Diabetologia，1997，40(11)：1286-1292.

[3] Pickup J C.Inflammation and activated innate immunity in the pathogenesis of type 2 diabetes[J].Diabetes Care，2004，27(3)：813-823.

[4] Medzhitov R，Janeway C A Jr.Innate immunity：the virtues of a nonclonal system of recognition[J].Cell，1997，91(3)：295-298.

[5] Zhang B，Ramesh G，Uematsu S，et a1.TLR4 signalingmediates inflammation and tissue injury in nephrotoxicity[J].J Am SocNephrol，2008，19(5)：923-932.

[6] Kaur H，Chien A，Jialal I.Hyperglycemia induced Toll like receptor 4 expression and activity in mesangial cell：relevance to diabetic nephropathy[J].Am J Physiol Renal Physiol，2012，303(8)：F1145-F1150.

[7] 呂金雷，賈汝漢，丁國華，等.AngⅡ通過TLR4/MyD88途徑誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細胞炎性因子釋放[J].中華腎臟病雜志，2010，26(10)：780-785.

[8] 王瑜，呂金雷.TLR4在糖尿病腎病大鼠腎組織中的表達[J].南昌大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2013，53(12)：11-15.

[9] Raij L.Recommendations for the management of special populations：renal disease in diabetes[J].Am J Hypertens，2003，16(11 Pt 2)：46S-49S.

[10] 林善錟.糖尿病腎病發(fā)病機制的研究進展[J].中華內(nèi)科雜志，2001，40(11)：782-783.

[11] Lee H B，Ha H，Kim S I，et al.Diabetic kidney disease research：where do we stand at the turn of the century?[J].Kidney Int Suppl，2000，77：S1-2.

[12] Hasegawa G，Nakano K，Sawada M，et al.，Possible role of tumor necrosis factor and interleukin-1 in the development of diabetic nephropathy[J].Kidney Int，1991，40(6)：1007-1012.

[13] Ozinsky A，Underhill D M，F(xiàn)ontenot J D，et al.The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97(25)：13766-13771.

[14] Fukami K，Yamagishi S，Ueda S，et al.Role of AGEs in diabetic nephropathy[J].Curr Pharm Des，2008，14(10)：946-952.

[15] 張曉東，耿文佳，魏日胞.炎癥信號通路在糖尿病腎病中的研究進展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2011，12(2)：177-179.

[16] Pickup J C，Crook M A.Is type Ⅱ diabetes mellitus a disease of the innate immune system?[J].Diabetologia，1998，41(10)：1241-1248.

[17] Lee S H，Lee T W，Ihm C G，et al.Genetics of diabetic nephropathy in type 2 DM：candidate gene analysis for the pathogenic role of inflammation[J].Nephrology(Carlton)，2005，10(Suppl)：S32-S36.

[18] Ayo S H，Radnik R A，Garoni J A，et al.High glucose causes an increase in extracellular matrix proteins in cultured mesangial cells[J].Am J Pathol，1990，136(6)：1339-1348.

[19] Guo J，F(xiàn)riedman S L.Toll-like receptor 4 signaling in liver injury and hepatic fibrogenesis[J].Fibrogenesis Tissue Repair，2010，10(21)：3-21.

[20] Shi H，Kokoeva M V，Inouye K，et al.TLR4 links innate immunity and fatty acid-induced insulin resistance[J].J Clin Invest，2006，116(11)：3015-3025.

[21] Griendling K K，Murphy T J，Alexander R W.Molecular biology of the renin-angiotensin system[J].Circulation，1993，87(6)：1816-1828.

[22] 林善琰.糖尿病腎病[M]//王海燕，李曉玫，趙明輝，等.腎臟病學(xué)，3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：1414-1434.

[23] Tsan M F，Gao B.Endogenous ligands of Toll-like receptors[J].J Leukoc Biol，2004，76(3)：514-519.

[24] Singh R，Leehey D J.Effect of ACE inhibitors on angiotensin Ⅱ in rat mesangial cells cultured in high glucose[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，357(4)：1040-1045.

[25] Mohan R D，Andrea C R，Ishwarlal J.Candesartan inhibits Toll-like receptor expression and activity bothinvitroandinvivo[J].Atherosclerosis，2009，202(1)：76-83.

[26] Cha J J，Hyun Y Y，Lee M H，et al.Renal protective effects of toll-like receptor 4 signaling blockade in type 2 diabetic mice[J].Endocrinology，2013，154(6)：2144-2155.

[27] Lin M，Yiu W H，Wu H J，et al.Toll-like receptor 4 promotes tubular inflammation in diabetic nephropathy[J].J Am Soc Nephrol，2012，23(1)：86-102.

(2016-12-09 收稿)

Effects of Angiotensin Ⅱ(AngⅡ)and High Glucose on Toll-like Receptor 4(TLR4) Signaling Pathway and Inflammatory Factors in Rat Glomerular Mesangial Cells

Wang Yu1，Liu Siyi1，Cheng Yuhua2etal

1DepartmentofNephrology，TheFirstAffilliatedHospitalofNanchangUniversity，Nanchang330006，China2DepartmentofNephrology，JiujiangUniversityHospital，Jiujiang332000，China

Objective To observe the changes of Toll-like receptor 4(TLR4)/myeloid differentiation88(MyD88)signaling pathway as well as inflammatory factors in rat mesangial cells under angiotensinⅡ(AngⅡ)and high glucose conditions，and by applying the small RNA interference or AngⅡ receptor blocker to interfere the rat mesangial cells，to further explore the novel mechanism of AngⅡ’s non-hemodynamic effects under high sugar environment and to clarify the pivital role of TLR4/MyD88 pathway in the pathogenesis of diabetic nephropathy(DN).Methods Three rat TLR4-siRNA sequences were designed.The most effective siRNA was screened for following experiments.The cells in the experiment of the first part were divided into six groups [low-glucose，high-glucose，high-glucose+AngⅡ，high-glucose+angiotensin Ⅱ receptor blocker(ARB)，high-glucose+TLR4 siRNA，high-glucose+ScsiRNA group]，to study effect of high glucose on expression of TLR4，MyD88 and NF-κB.The cells in the experiment of the second part were also divided into six groups(low-glucose，AngⅡ，high-glucose+AngⅡ，AngⅡ+ARB，AngⅡ+TLR4 siRNA，AngⅡ+ScsiRNA group)，to investigate the effect of AngⅡ on the expression of TLR4，MyD88 and NF-κB.TLR4 and MyD88 mRNA expression was detected by realtime fluorescence quantitative PCR.TLR4，MyD88 and NF-κB protein expression was detected by Western blotting.ELISA was used to detect expression of IL-6 and MCP-1 in supernatant.Results Compared with low-glucose groups，AngⅡ and high glucose significantly upregulated the expression of TLR4/Myd88 mRNA and protein，and NF-κB protein(P<0.05)respectively.The expression levels of IL-6 and MCP-1 in cell supernatant were also increased significantly in AngⅡ group and high-glucose group(P<0.01)，and the synergistic effect of AngⅡ and high glucose was more significant.The RNA interference and ARB could effectively down-regulate the expression of TLR4/Myd88 mRNA and protein，NF-κB protein，and IL-6 and MCP-1，as compared with high-glucose group and AngⅡ group(P<0.05).Conclusion TLR4/Myd88 signaling pathway can be activated by AngⅡ or high-glucose in rat mesangial cells.These effects can be partly blocked by specific TLR4 siRNA gene and AngⅡ receptor blocker.Irbesartan can partly block TLR4 signaling pathway.High glucose and AngⅡ enhance TLR4-mediated innate immune inflammation，in which TLR4/MyD88 signaling pathway plays a pivital role.TLR4 siRNA gene silencing technology provides a new strategy for the treatment of DN.

diabetic nephropathy； high-glucose； AngiotensinⅡ； mesangial cell； Toll-like receptor 4； innate immune response； inflammatory factors

*國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81060063，No.81660129)

R587.24

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.003

王 瑜，女，1979年生，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師，E-mail：smilife@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：lvjinlei97@163.com