周 興,周 青,何清湖*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

雄蠶益腎方對遲發(fā)性性腺功能低下癥大鼠睪丸組織病理變化與超微結(jié)構(gòu)的影響

周 興1,周 青1,何清湖2*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

目的 探討雄蠶益腎方對遲發(fā)性性腺功能低下癥（late-onset hypogonadism,LOH）大鼠睪丸組織病理變化和超微結(jié)構(gòu)的影響。方法 采用“退役種鼠（40周齡）+復(fù)合情志刺激+孤養(yǎng)”方法，建立LOH大鼠模型，隨機(jī)分為模型組、睪酮組、雄蠶益腎方組（雄蠶組），另設(shè)立正常對照組（8周齡），藥物干預(yù)4周，末次給藥后24 h處死動(dòng)物，檢測血清睪酮水平、睪丸指數(shù)，分別以光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察睪丸組織的病理變化與超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 模型組、睪酮組、雄蠶組之間睪丸指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），LOH大鼠睪丸組織出現(xiàn)曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)紊亂，精子大量減少，睪丸間質(zhì)變少等病理變化以及線粒體數(shù)量明顯減少，大量線粒體水腫等超微結(jié)構(gòu)改變，雄蠶組病理變化和超微結(jié)構(gòu)均得到改善。結(jié)論 LOH大鼠可出現(xiàn)睪丸組織器官水平和細(xì)胞水平的病理變化及超微結(jié)構(gòu)改變，雄蠶益腎方可能能通過改善其病理變化和睪丸間質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)而發(fā)揮作用。

雄蠶益腎方；遲發(fā)性性腺功能低下癥；病理變化；超微結(jié)構(gòu)

本文引用：周 興，周 青,何清湖.雄蠶益腎方對遲發(fā)性性腺功能低下癥大鼠睪丸組織病理變化與超微結(jié)構(gòu)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,37（6）：586-590.

遲發(fā)性性腺功能低下癥（late-o nset hypogo nadism,LOH）發(fā)病主要由于增齡導(dǎo)致的睪酮水平進(jìn)行性下降，睪酮補(bǔ)充替代治療 （testosterone supplementation therapy,TST）被視為LOH治療的金標(biāo)準(zhǔn)[1]，但臨床對TST療效、療程、安全性等問題仍存有爭議[2]。中醫(yī)通過辨證施治，可以綜合運(yùn)用補(bǔ)腎、疏肝、健脾、養(yǎng)心等多種治法，療效肯定，為臨床LOH治療提供了新的思路。我院長期應(yīng)用雄蠶益腎方治療LOH，為探索其機(jī)制，本研究觀察了該方對LOH大鼠睪丸組織病理變化和超微結(jié)構(gòu)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物

1.1.1 造模組大鼠 SPF級(jí)SD雄性大鼠 （退役種鼠），40 周齡，體質(zhì)量（400±50） g，40 只。 購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2 正常對照組（以下簡稱正常組）大鼠 SPF級(jí)SD雄性大鼠，8周齡，體質(zhì)量230～250 g，15只。 購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004。均飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，SPF級(jí)動(dòng)物專用飼料飼養(yǎng)，恒定溫度（21±3） ℃、濕度（75±5）%，光-暗周期、動(dòng)物攝食及飲水條件按造模需要設(shè)定。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 藥物及制備

雄蠶益腎方（雄蠶蛾30 g，淫羊藿15 g，熟地黃15 g，枸杞子 15 g，白芍 10 g，刺蒺藜 15 g），為科室協(xié)定方，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科購買并鑒定。雄蠶蛾提取工藝流程：參照劉軍等[3]提供的提取方法。乙醇提取雄蠶蛾?duì)I養(yǎng)活性成分的工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)45%，原料質(zhì)量濃度50 g/L，提取時(shí)間30 min，提取溫度70℃。將提取液濃縮至1 g/mL。乙醇提取后的雄蠶蛾殘?jiān)c淫羊藿、熟地黃、枸杞子、白芍、刺蒺藜合并，煎煮3次，水煎液濃縮制成含生藥濃度為1 g/mL的藥液，與乙醇提取后的雄蠶蛾液相混合，置4℃冰箱備用。

1.3 試劑及儀器

丙酸睪酮注射液：杭州動(dòng)物藥品廠，2 mL/瓶，批準(zhǔn)文號(hào)：獸藥字（2013）110201054。瑞典 LKB-III型超薄切片機(jī)，日立HT7700型透射電鏡。

2 方法

2.1 模型制備

結(jié)合課題組前期研究基礎(chǔ)[4]，參考金光亮[5-6]、周力[7]、于琦[8]等的復(fù)合情志刺激造模法。選擇造模用雄性SD退役種鼠（40周齡）40只，并每籠1只孤養(yǎng)，每日隨機(jī)給予以下不良刺激中的一種：（1）禁水（24 h）；（2）晝夜顛倒（8：00-18：00 將動(dòng)物房門關(guān)上、拉下窗簾，置于黑暗環(huán)境；18：00-8：00 打開日光燈，并使房間內(nèi)照度保持在 300 Lux）；（3）禁食（24 h）；（4）夾尾 （用25 mm長尾票夾在距尾端1 cm處夾住鼠尾，30 min）；（5）噪音（70 分貝，持續(xù) 2 h）。 每日 1種，每種刺激不連續(xù)使用，每周隨機(jī)休息2 d，連續(xù)4周。正常組大鼠正常條件飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。

2.2 動(dòng)物分組與給藥

造模完成后，斷尾采血 0.8～1.2 mL，離心管分裝，3 000 r/min，離心 10 min，分離出血清，－80 ℃冰箱冷凍保藏，ELISA法檢測血清睪酮濃度。參照參考何清湖[9]、周興[10]等的方法，統(tǒng)計(jì)得出15只8周齡SD雄性大鼠血清睪酮10%位數(shù)為1.91 ng/mL，以此為切點(diǎn)值，凡是經(jīng)復(fù)合情志刺激造模后，大鼠血清睪酮水平均低于該切點(diǎn)值的作為LOH大鼠模型，共有34只大鼠符合納入標(biāo)準(zhǔn)。按隨機(jī)分組原則，設(shè)為模型組6只，丙酸睪酮組（以下簡稱睪酮組）6只，雄蠶益腎疏肝組（以下簡稱雄蠶組）6只；從15只正常組大鼠中隨機(jī)選取6只作為正常組。將各組大鼠分別編號(hào)標(biāo)記，分籠飼養(yǎng)。

連續(xù)灌胃 4 周，1 次/d，上午 8：00-9：00。動(dòng)物給藥劑量按動(dòng)物每公斤體質(zhì)量占人體表面積的比值計(jì)算，各治療組均按臨床等效劑量給藥。雄蠶組灌胃劑量為每次10 mL/kg；睪酮組每于大鼠股部肌肉注射丙酸睪酮，用量標(biāo)準(zhǔn)為7 mg/kg，每周注射3次，注射部位左右交替，共4周；模型組及正常組每次均以3 mL生理鹽水灌胃并大鼠股部肌肉注射生理鹽水，劑量按7 mg/kg。末次給藥后24 h處死所有動(dòng)物，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

2.3 樣本采集與指標(biāo)檢測

烏拉坦腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置并離心后取上清液分裝，－80℃凍存待檢。取一部分睪丸組織置4%多聚甲醛固定，另取適量睪丸組織置2.5%戊二酸PE管內(nèi)固定。

2.3.1 睪丸指數(shù)測定 取雙側(cè)睪丸置于電子天平稱質(zhì)量，計(jì)算出睪丸指數(shù)。公式為：睪丸指數(shù)=雙側(cè)睪丸質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

2.3.2 睪丸組織病理變化 采用HE染色，光鏡下觀察各睪丸組織形態(tài)學(xué)改變。在湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室完成。

2.3.3 睪丸組織超微結(jié)構(gòu) 用透射電子顯微鏡觀察睪丸間質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院電鏡室完成。

2.3.4 血清睪酮測定 采用ELISA法，根據(jù)睪酮ELISA試劑全說明書操作，在湖南師范大學(xué)生命科學(xué)院完成。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況比較

模型組、睪酮組、雄蠶組實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性；以上各組試驗(yàn)后體質(zhì)量比較、以及各組實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明針對LOH大鼠的藥物干預(yù)，并不能影響其體質(zhì)量。

模型組、睪酮組、雄蠶組各組睪丸指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示LOH大鼠的睪丸指數(shù)明顯低于正常組大鼠，但藥物干預(yù)并不能影響睪丸指數(shù)。見表1。

表1 4組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體重變化及睪丸指數(shù) （±s）

表1 4組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體重變化及睪丸指數(shù) （±s）

注：與本組治療前比較※P＜0.05；與正常組比較葒P＜0.01。

組別 n體質(zhì)量（g）實(shí)驗(yàn)前 實(shí)驗(yàn)后 睪丸指數(shù)（%）正常組模型組睪酮組雄蠶組66 66 FP 217.03±18.68 605.15±92.27 601.37±69.33 607.70±62.67 51.26 0.00 295.63±23.07※598.55±88.94 632.83±77.33 637.70±79.34 31.39 0.00 1.15±0.10 0.55±0.06葒葒0.53±0.07葒葒0.56±0.08葒葒90.07 0.00

3.2 各組大鼠血清總睪酮水平比較

模型組、睪酮組、雄蠶組實(shí)驗(yàn)前各組大鼠血清總睪酮水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性；以上各組與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

試驗(yàn)后，睪酮組與模型組、雄蠶組、正常組比較，大鼠血清總睪酮水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；雄蠶組與模型組、正常組比較大鼠血清總睪酮水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 4組大鼠實(shí)驗(yàn)前后血清睪酮變化情況 （±s）

表2 4組大鼠實(shí)驗(yàn)前后血清睪酮變化情況 （±s）

注：實(shí)驗(yàn)前血清總睪酮滿足正態(tài)分布，但方差不齊（P=0.002），采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。與試驗(yàn)后睪酮組比較**P＜0.01；與試驗(yàn)后模型組比較▲▲P＜0.01。

組別 n 血清總睪酮（ng/mL）實(shí)驗(yàn)前 實(shí)驗(yàn)后正常組模型組睪酮組雄蠶組6 6 6 6 FP 3.48±1.42 1.29±0.45 1.31±0.39 1.32±0.27 11.62 0.00 4.41±0.94※※1.35±0.29※※11.77±0.86▲▲2.74±1.27※※▲▲155.99 0.00

3.3 各組大鼠睪丸組織病理變化比較

正常組：各級(jí)生精細(xì)胞發(fā)育正常、層次清晰，睪丸間質(zhì)正常。模型組：曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)紊亂，初級(jí)精母細(xì)胞數(shù)量減少，精子細(xì)胞壞死紊亂，大量吞噬細(xì)胞產(chǎn)生，精子大量減少，睪丸間質(zhì)變少，細(xì)胞與細(xì)胞間分界不清。睪酮組：初級(jí)精母細(xì)胞體積變大、水腫，細(xì)胞核顏色變淺，分界不清，睪丸間質(zhì)萎縮變少。雄蠶組：少量生精細(xì)胞脫落，曲細(xì)精管無萎縮，睪丸間質(zhì)無水腫。見圖1。

3.4 各組大鼠睪丸組織超微結(jié)構(gòu)改變比較

正常組：線粒體數(shù)量多，線粒體聚集，形成線粒體鞘，線粒體體積大，線粒體嵴清晰，線粒體無水腫。模型組：線粒體數(shù)量明顯減少，大量線粒體水腫，線粒體體積小，線粒體嵴不清晰，嵴水腫、擴(kuò)張，出現(xiàn)空泡樣變。睪酮組：與雄蠶組、正常組比較，線粒體數(shù)量減少，部分線粒體水腫，線粒體體積小，部分線粒體嵴清晰。雄蠶組：線粒體數(shù)量多，部分可看到線粒體鞘形成，線粒體體積較大，線粒體嵴尚清晰，線粒體水腫不明顯。見圖2。

圖1 HE染色觀察睪丸組織形態(tài)光鏡圖

圖2睪丸組織超微結(jié)構(gòu)改變電鏡圖

4 討論

LOH的發(fā)病主要與年齡相關(guān)的睪酮水平下降有關(guān)，作為睪酮合成的最關(guān)鍵細(xì)胞——睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cell），其合成功能隨增齡衰退的調(diào)控是目前LOH研究重要方向之一。增齡影響的具體機(jī)制可能有[11]：（1）膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白減少，主要有類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）、外周型苯二氮卓受體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TSPO），進(jìn)而影響游離膽固醇經(jīng)線粒體外膜向線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)；（2）睪酮合成酶活性下降，包括位于線粒體內(nèi)膜的細(xì)胞色素膽固醇側(cè)鏈裂解酶（P450scc）和位于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的3β-羥甾脫氫酶（3β-HSD）。也有證據(jù)表明，Leydig細(xì)胞睪酮合成功能衰退可能與增齡相關(guān)的超微結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。如李維仁等[12]證實(shí)，老年人睪丸間質(zhì)細(xì)胞胞漿中，細(xì)胞器較少，可見大量腫脹線粒體，線粒體嵴消失，少見有脂滴；邵迎紅等[13]研究證實(shí)，24月齡SD大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，線粒體腫脹，板狀嵴模糊、消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，有不同程度的局灶性到彌漫性囊泡變性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)廣泛擴(kuò)張的細(xì)胞呈篩狀。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠Leydig細(xì)胞線粒體數(shù)量明顯減少、大量線粒體水腫等改變，與上述結(jié)果一致。睪酮合成過程中，Leydig細(xì)胞線粒體是最關(guān)鍵細(xì)胞器之一，因?yàn)殛P(guān)鍵限速酶StAR、P450scc，都存在于Leydig細(xì)胞線粒體內(nèi)膜。線粒體水腫等上述改變是否與睪酮合成酶活性下降相關(guān)？又是哪些因素導(dǎo)致了Leydig細(xì)胞線粒體水腫的發(fā)生呢？

進(jìn)一步文獻(xiàn)研究，我們認(rèn)為：一方面，Leydig細(xì)胞線粒體腫脹等超微結(jié)構(gòu)改變，可能與增齡導(dǎo)致的活性氧簇（ROS）在Leydig細(xì)胞蓄積有關(guān)。真核細(xì)胞線粒體是產(chǎn)生ROS的最主要部位。根據(jù)目前較公認(rèn)的“氧自由基衰老學(xué)說”，增齡相關(guān)的細(xì)胞衰老與細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積，氧化應(yīng)激相關(guān)。已有的研究證實(shí)，在衰老進(jìn)程中，ROS在Leydig細(xì)胞內(nèi)蓄積，將導(dǎo)致Leydig細(xì)胞凋亡增加[14]、線粒體功能紊亂[15]；同時(shí)，ROS還可通過介導(dǎo)c-Jun信號(hào)通路抑制Nur77轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而降低睪酮合成酶基因表達(dá)[16]。

另一方面，Leydig細(xì)胞線粒體腫脹等超微結(jié)構(gòu)改變，可能與增齡導(dǎo)致的Leydig細(xì)胞自噬下降有關(guān)。自噬是細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)成分被自身溶酶體包裹降解的過程，能凈化自身多余或受損的細(xì)胞器，維持細(xì)胞自穩(wěn)。早在上世紀(jì)80～90年代，國內(nèi)有研究報(bào)道，生理情況下Leydig細(xì)胞自噬非?；钴S，是研究自噬的很好細(xì)胞模型，并提出自噬可能對Leydig細(xì)胞睪酮的合成有調(diào)節(jié)作用[17]。近年來研究證實(shí)，與青年組（3月齡）大鼠比較，老年組（24月齡）大鼠睪酮水平下降、Leydig細(xì)胞自噬降低、StAR蛋白表達(dá)下調(diào)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲除TM3 Leydig細(xì)胞自噬關(guān)鍵基因Beclin1后，Leydig細(xì)胞自噬顯著降低，LC3-Ⅱ蛋白（LC3-磷脂酰乙醇胺共軛，自噬蛋白標(biāo)志物）和StAR蛋白表達(dá)均下調(diào)[18]。說明自噬降低與老年大鼠Leydig細(xì)胞睪酮合成水平下降直接相關(guān)。

本研究證實(shí)，雄蠶益腎方能提高LOH大鼠血清睪酮水平，顯著降低Leydig細(xì)胞線粒體水腫發(fā)生，是否與影響Leydig細(xì)胞ROS蓄積、增加自噬有關(guān)？具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。因此，圍繞Leydig細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，探索雄蠶益腎方干預(yù)LOH的可能分子機(jī)制研究，將是研究團(tuán)隊(duì)下一步研究的重點(diǎn)。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Xiongcan Yishen Prescription on Pathological Changes and Ultrastructure of Testicular Tissue in the Late-Onset Hypogonadism Rats

ZHOU Xing1,ZHOU Qing1,HE Qinghu2*
(1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China;2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To study the effects of Xiongcan Yishen formula on the pathological changes and the ultrastructure of the testicular tissue in the late-onset hypogonadism (LOH)rats.Methods The LOH rat models were established by using retired mated rats (40 weeks)which fed separately and given various emotional stimulation.The rats were randomly divided into model group,testosterone group,Xiongcan group,and establishment of control group (8 weeks),the medicine intervention was for 4 weeks.The rats were sacrificed 24 hours later after last medication.The serum testosterone and testicle mass index was detected,the ultrastructure and pathological changes of the testicular tissue were observed by opticalmicroscope and transmission electron microscope.ResultsThe rattesticularindexesbetween modelgroup,testosterone group,Xiongcan group were significantly different (P ＞0.05).The LOH model rats have the following pathological changes such as structure disturbance of seminiferous tubules,spermatogenesis loss,testis interstitial loss,and the ultrastructural changes such as mitochondria decreases and obvious edema of mitochondria.The pathological changes and the ultrastructures in Xiongcan group were improved.Conclusion LOH rats appear the pathological changes and the ultrastructural changes of the testicular tissue at the organic level and the cellular level.Xiongcan Yishen prescription could ameliorating its pathological changes and the ultrastructural changes of leydig cells.

Xiongcan Yishen prescription;late-onset hypogonadism;pathological changes;ultrastructure

R285.5；R588

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2017.06.002

2016-08-08

國家自然科學(xué)基金（81202706，81673984）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目（16B200）。

周 興，男，副主任醫(yī)師，博士，從事中西醫(yī)結(jié)合男科學(xué)專業(yè)研究。

* 何清湖，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：hqh1111@tom.com。