熊科元，萬丹娜，邵 峰，趙海平，劉榮華，黃慧蓮，楊 明（江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實驗室，南昌 330004）

·制劑與工藝·

星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化山楂有機(jī)酸的提取工藝Δ

熊科元＊，萬丹娜，邵 峰#，趙海平，劉榮華，黃慧蓮，楊 明（江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實驗室，南昌 330004）

目的：優(yōu)化山楂有機(jī)酸的提取工藝。方法：在單因素試驗基礎(chǔ)上，以液料比、提取時間及乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，以有機(jī)酸得率為因變量，采用星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化山楂有機(jī)酸提取工藝。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝條件為山楂按液料比18.5∶1加入75%乙醇，回流提取2次，每次2.0 h；驗證試驗的有機(jī)酸得率平均值為5.22%（RSD＝2.70%，n＝3），與模型預(yù)測值（5.13%）的相對誤差為1.75%。結(jié)論：優(yōu)化建立的山楂有機(jī)酸提取工藝方法簡單，重現(xiàn)性和可預(yù)測性較好。

山楂；有機(jī)酸；提取工藝；星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法

山楂為薔薇科山楂屬（Crataegus L.）植物山里紅（Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.）或山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥成熟果實，味酸、甘，性微溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，具有消食健胃、行氣散瘀之功效[1]，臨床常用于治療消化系統(tǒng)與心腦血管系統(tǒng)疾病[2]。山楂主要含有機(jī)酸類、黃酮類、三萜類化合物及其他類成分。現(xiàn)代藥理研究表明，山楂有機(jī)酸具有較好的消食導(dǎo)滯作用[3]。為此，本課題組在參考文獻(xiàn)[4]及2015年版《中國藥典》“山楂”項下相關(guān)內(nèi)容的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗及星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法對山楂有機(jī)酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為山楂有機(jī)酸資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

PHS-25數(shù)顯pH計、E-201-C pH復(fù)合電極（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀[日本東京理化（上海）儀器有限公司]。

1.2 藥材、藥品與試劑

山楂于2015年10月9日購自山東平邑，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)劉榮華教授鑒定為山里紅的干燥成熟果實；枸櫞酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100396-200301，供含量測定用）；乙醇、氫氧化鈉均為分析純，水為自制雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 有機(jī)酸含量測定方法

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取枸櫞酸對照品97.8 mg，用水溶解，定容于250 m L量瓶中，制備成0.391 mg/m L的對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液制備 取30 g山楂粉碎成粗粉，加一定量的乙醇回流提取2次，過濾，合并濾液。取50m L提取液，減壓回收溶劑至無醇味，加水定容于100m L量瓶中，即得，備用。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定曲線建立 參考文獻(xiàn)[1，5]，精密吸取20m L枸櫞酸對照品溶液置于燒杯中，浸入電極，攪拌，用0.05mol/L的氫氧化鈉溶液滴定。開始每滴加1 m L滴定液，攪拌并記錄電位；至近終點(diǎn)時，每滴加0.1 m L滴定液，攪拌并記錄電位；至突躍點(diǎn)已過，仍應(yīng)繼續(xù)滴加幾次滴定液，并記錄電位；同時進(jìn)行空白校正。以電位變化量與體積變化量之間的比值為縱坐標(biāo)（ΔE/ΔV）、電位變化前后所用滴定液體積平均值為橫坐標(biāo)（V）作滴定曲線，曲線的極大值對應(yīng)的滴定液消耗體積為滴定終點(diǎn)消耗值。結(jié)果，消耗的滴定液體積為2.35m L，與理論值（2.44m L）基本吻合。每1m L滴定液（0.1mol/L）相當(dāng)于6.404mg的枸櫞酸。

取“2.1.1”項對照品溶液與“2.1.2”項供試品溶液滴定，2種溶液的滴定曲線見圖1。

圖1滴定曲線

Fig 1 Titration curve

2.1.4 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗 按相關(guān)方法進(jìn)行操作。結(jié)果精密度試驗RSD為1.43%（n＝6），表明該方法精密度良好；重復(fù)性試驗RSD為2.40%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗RSD為0.97%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定；加樣回收率試驗的平均回收率為96.5%（RSD＝2.26%，n＝9）。

2.1.5 含量測定 精密量取20m L供試品溶液置于燒杯中，浸入電極，攪拌，按照“2.1.3”項下方法測定，計算有機(jī)酸含量[C×K×（V－V0）×（100/20）×（V1/50），式中V為滴定樣品消耗氫氧化鈉溶液的體積；V0為空白消耗氫氧化鈉溶液的體積；C為氫氧化鈉溶液濃度（即0.05mol/L）；K為換算成枸櫞酸的系數(shù)（即0.001mol氫氧化鈉相當(dāng)于枸櫞酸的系數(shù)，K＝0.064）；V1為供試品溶液體積]。

2.2 單因素試驗篩選有機(jī)酸提取工藝

分別對影響提取效果的液料比、提取時間、乙醇的體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行單因素考察。

2.2.1 液料比 稱取山楂粗粉3份，每份30 g，分別按液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1加入60%乙醇溶液，回流提取1 h，提取2次，合并濾液，測定有機(jī)酸含量并計算有機(jī)酸得率（Y，有機(jī)酸含量/藥材質(zhì)量×100%），結(jié)果見圖2A。

由圖2A可知，當(dāng)液料比由5∶1升高到10∶1時，Y大幅提高；而當(dāng)液料比由10∶1增加至25∶1時，Y變化并不明顯；當(dāng)液料比為20∶1時，Y最高。因此，確定液料比以20∶1為中心點(diǎn)，在15∶1～25∶1范圍內(nèi)進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計。

2.2.2 提取時間 稱取山楂粗粉3份，每份30 g，加入液料比15∶1的60%乙醇溶液，分別回流提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，提取2次，合并濾液，測定有機(jī)酸含量，計算Y，結(jié)果見圖2B。

由圖2B可知，當(dāng)提取時間由0.5 h延長至1.0 h時，Y增幅最為明顯；當(dāng)提取時間由1.0 h延長至2.5 h時，Y仍繼續(xù)提高，但增幅較前者小。因此，確定提取時間以2.0 h為中心點(diǎn)進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計。2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù) 稱取山楂粗粉3份，每份30 g，按液料比15∶1分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%、45%、60%、75%、90%的乙醇溶液，回流提取1.0 h，提取2次，合并濾液，測定有機(jī)酸含量，計算Y，結(jié)果見圖2C。

圖2 各因素對有機(jī)酸得率的影響Fig 2 Effects of each factor on extraction yield of organic acids

由圖2C可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)從30%到45%時，Y明顯下降；之后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，Y逐步提高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在75%時，Y最高；乙醇體積分?jǐn)?shù)高于75%之后，Y略有降低。因此，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)以75%為中心點(diǎn)進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計。

2.3 星點(diǎn)設(shè)計試驗優(yōu)化有機(jī)酸提取工藝

2.3.1 試驗設(shè)計與結(jié)果 以液料比、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)3個因素分別作為自變量X1、X2、X3，以樣品中Y為響應(yīng)值，每個因素設(shè)5水平，并以－1.682、－1、0、1、1.682表示自變量的高低水平進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計。因素與水平見表1，星點(diǎn)設(shè)計試驗與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factorsand levels

2.3.2 模型擬合 利用Design-Expert8.0軟件，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以Y為響應(yīng)值，分別對X1、X2、X3進(jìn)行二項式方程擬合，得回歸模型方程為

由表3可知，模型P＜0.01，表明上述回歸模型顯著。二項式回歸方程失擬項檢驗不顯著（P＝0.556 2），提示未知因素對試驗結(jié)果干擾較小。提取時間X2的P＜0.05，表明提取時間對Y有顯著影響。3個因素對Y影響順序大小為：X2＞X1＞X3。所有交互項系數(shù)未達(dá)到顯著性（P＞0.05）。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化 利用軟件Design-Expert8.0繪制Y與3個變量的三維響應(yīng)面圖，見圖3。

表2 星點(diǎn)設(shè)計試驗與結(jié)果Tab 2 Central com posite design test and results

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Resultsof varianceanalysis

圖3 各因素的三維響應(yīng)面圖Fig 3 Three-dimensional response surface graph of each factor

利用數(shù)學(xué)模型，預(yù)測最優(yōu)提取工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)76.56%、液料比18.56∶1、提取時間2.13 h，回流提取2次。Y預(yù)測值為5.13%。

2.3.4 模型檢驗 從實際生產(chǎn)出發(fā)，最終確定工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、液料比18.5∶1、提取時間2.0 h，回流提取2次。按此工藝試驗3次，結(jié)果Y分別為5.07%、5.19%、5.41%，平均值為5.22%（RSD＝2.70%，n＝3）。實測值與預(yù)測值比較，相對誤差為1.75%，表明所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性良好，優(yōu)化后工藝重現(xiàn)性較好。

3 討論

有機(jī)酸類成分是酸味藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[6]?，F(xiàn)代研究表明，山楂藥材中含有蘋果酸、枸櫞酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、沒食子酸、阿魏酸、山楂酸、齊墩果酸及熊果酸等25種有機(jī)酸類成分[7]，這些成分大多數(shù)具有良好的生物活性[8]。然而，這些成分的水溶性強(qiáng)弱不同。為此，本課題組采用乙醇替代水作為提取溶劑，使得上述有機(jī)酸成分均能夠被充分提取出來。

目前，山楂提取工藝優(yōu)化研究常以總黃酮得率作為評價指標(biāo)[9]，而將總有機(jī)酸得率作為評價指標(biāo)的山楂提取工藝研究報道較少，且大部分采用正交設(shè)計方法對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化[10]。由于正交試驗法在預(yù)測性與精確度方面均存在不足[11]，為此，本課題組選用預(yù)測性較好、精確度較高的星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法對山楂有機(jī)酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過驗證試驗，發(fā)現(xiàn)實測值與預(yù)測值的相對誤差較小。本研究結(jié)果可為山楂資源的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)參考。

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Extraction Technology Optim ization for Organic Acids in Crataegi Fructus by Central Com posite Designresponse Surface M ethod

XIONG Keyuan，WAN Danna，SHAO Feng，ZHAO Haiping，LIU Ronghua，HUANG Huilian，YANG M ing（Key Laboratory of Modern Preparation of TCM，M inistry of Education，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China）

OBJECTIVE：To optim ize the extraction technology for organic acids in Crataegi fructus.METHODS：Based on single factor test，using liquid-solid ratio，extraction time and ethanol volume fraction as independent variables，extraction yield of organic acids as dependent variable，central composite design-response surfacemethod was used to optim ize the extraction technology of organic acids in Crataegi fructus.RESULTS：The optimal extraction technology was as follow as liquid-solid ratio of 18.5∶1，adding 75%ethanol，reflux extraction tw ice，2.0 h each time.Average extraction yield of organic acids in verification test was 5.22%（RSD＝2.70%，n＝3），w ith 1.75%relative error of the predicted value（5.13%）.CONCLUSIONS：Optim ized extraction technology for organic acids in Crataegi fructus is simple，w ith good reproducibility and predictability.

Crataegi fructus；Organic acids；Extraction technology；Central composite design-response surfacemethod

R284.2

A

1001-0408（2017）16-2241-03

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81260638）；江西省自然科學(xué)基金資助項目（No.20161BAB205220）；江西省衛(wèi)生計生委中醫(yī)藥科研計劃課題（No.2016A053）；江西省研究生創(chuàng)新專項資金項目（No.YC2016-B079）；江西中醫(yī)藥大學(xué)校級研究生創(chuàng)新專項資金項目（No.JZYC16B02）

＊講師。研究方向：中藥質(zhì)量評價。E-mail：258561309@qq.com

#通信作者：副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥質(zhì)量評價。E-mail：shaofeng0729@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.22