劉 煒，王曉彤，王建華（.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京 00038；2.解放軍總醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，北京 00853）

載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的制備及抑瘤作用研究

劉 煒1＊，王曉彤1，王建華2#（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京 100038；2.解放軍總醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，北京 100853）

目的：制備載阿霉素聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸-聚乙二醇（PLGA-PLL-PEG）納米粒，并研究其抑瘤作用。方法：應(yīng)用PLGA-PLL和活化PEG聚合而成的PLGA-PLL-PEG為載體包載阿霉素，制得載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒。檢測(cè)納米粒的形態(tài)大小、粒徑分布、阿霉素的含量，計(jì)算載藥量和包封率，比較納米粒和阿霉素在144 h內(nèi)的累積釋放率（Q）和對(duì)乳腺癌HeLa細(xì)胞的增殖抑制率，計(jì)算半數(shù)抑制率（IC50）。結(jié)果：所制載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒為規(guī)則圓形，分散性良好，無黏連，平均粒徑為（136.7±9.3）nm（n＝5），平均包封率為（76.67±8.63）%，平均載藥量為（3.86±0.55）%（n＝3）；阿霉素的Q12h達(dá)100%，載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的Q24h為52.9%、Q144h為81.2%。載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制率較阿霉素增長緩慢，二者的IC50分別為1.844、0.345μg/m L。結(jié)論：成功制得載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒，其具有良好的緩釋效果，其抑瘤作用強(qiáng)于阿霉素。

阿霉素；聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸；聚乙二醇；納米粒；腫瘤細(xì)胞；抑制

阿霉素是蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，通過干擾轉(zhuǎn)錄過程，阻止信使RNA（mRNA）的形成發(fā)揮抗腫瘤作用，目前在臨床上常用于各種實(shí)體腫瘤治療[1]。傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物給藥方法難以使藥物濃度聚集在腫瘤局部，因此臨床療效差，而且對(duì)全身組織器官的毒副作用顯著。本研究旨在應(yīng)用具有緩控釋特點(diǎn)的骨架型高分子材料，通過改變藥物劑型來改變藥物的釋放特點(diǎn)，并應(yīng)用于局部腫瘤治療中，使腫瘤局部持續(xù)緩慢地形成高濃度藥物，以增強(qiáng)抗腫瘤作用，并降低其對(duì)機(jī)體的毒副作用。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）是一類可生物降解的高分子聚合物，聚賴氨酸（PLL）是具有氨基酸重復(fù)單元的多肽，具有帶正電的氨基基團(tuán)，經(jīng)過PLL修飾后的PLGA納米粒，能顯著增加細(xì)胞的攝取率，再通過聚乙二醇（PEG）修飾可以延長納米粒在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。本研究應(yīng)用復(fù)乳法，以PLGA-PLL和活化的PEG聚合而成的PLGA-PLLPEG為載體包載阿霉素，制成載阿霉素PLGA-PLLPEG納米粒，并觀察其體外釋放行為和抗腫瘤作用，旨在為研究抗腫瘤藥物的局部應(yīng)用劑型提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與透析袋

F-7000熒光分光光度計(jì)、JEM-200CX透射電子顯微鏡（日本日立公司）；Zetasizer-3000激光粒度分布測(cè)量儀（英國Malvern公司）；ST16離心機(jī)（美國Thermo公司）；伯樂680全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；透析袋（美國MFPI公司，截留分子量：7 000）。

1.2 藥品與試劑

阿霉素原料藥（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：160219，純度：99.0%）；PLGA-PLL（美國Sigma公司，批號(hào)：16010785，分子量：2 000）；活化PEG（CDI-PEGCDI，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：20160317，分子量：2 000）；聚乙烯醇（PVA）、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）、二氯甲烷（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純）；MTT（上海碧云天生物技術(shù)研究所，分析純）。

1.3 細(xì)胞

乳腺癌HeLa細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。

2 方法

2.1 PLGA-PLL-PEG的制備

取0.5 g CDI-PEG-CDI，溶于無水DMF中，再加入1.0 g PLGA-PLL，攪拌反應(yīng)48 h。CDI-PEG-CDI帶有活潑的?；溥蚧鶊F(tuán)，可以酰胺鍵與PLGA-PLL的氨基酸基團(tuán)相連，生成PLGA-PLL-PEG。反應(yīng)結(jié)束后，用透析袋透析上述反應(yīng)液，共24 h，將透析后的產(chǎn)物真空干燥24 h，得PLGA-PLL-PEG。

2.2 載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的制備

取一定量的PLGA-PLL-PEG溶于2 m L二氯甲烷中，作為油相；取阿霉素溶于聚山梨酯80水溶液（質(zhì)量濃度為60mg/m L）10m L中，作為水相；將水相逐滴加至油相中，超聲形成乳液。將上述乳液加入至50m L PVA水溶液（質(zhì)量濃度為3mg/m L），攪拌2 h，15 000 r/min（離心半徑14 cm）離心30m in，冷凍干燥24 h，得載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒。

2.3 納米粒的特征

取適量的載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒，用超純水稀釋，滴在載有碳膜的銅網(wǎng)上，應(yīng)用透射電子顯微鏡分析納米粒的形態(tài)大小。同樣取稀釋的納米粒應(yīng)用激光粒度分布測(cè)量儀分析其粒徑分布。

2.4 阿霉素的含量測(cè)定

[2]方法，應(yīng)用熒光分光光度計(jì)對(duì)阿霉素的含量進(jìn)行測(cè)定，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長590 nm。

2.5 納米粒的載藥量與包封率

取一定量冷凍干燥的載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒粉末，溶于定量DMSO溶液中，稀釋至一定濃度，按照“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定納米粒中阿霉素的含量，計(jì)算納米粒的載藥量和包封率。載藥量（%）＝納米粒中阿霉素的質(zhì)量/納米粒的質(zhì)量×100%，包封率（%）＝納米粒中阿霉素的質(zhì)量/阿霉素的加入質(zhì)量×100%。

2.6 納米粒的體外釋放試驗(yàn)

精密量取適量的載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒，分散于pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）中，置于透析袋中，再將透析袋置于200 m L釋放介質(zhì)（pH 7.4 PBS）中，在37恒溫?fù)u床中進(jìn)行釋放試驗(yàn)。分別于2、4、6、8、10、12、24、48、72、96、120、144 h取樣，取樣同時(shí)補(bǔ)加等量等溫釋放介質(zhì)，測(cè)定樣品中阿霉素含量，計(jì)算累積釋放率（Q）。另取阿霉素原料藥作為對(duì)照，按上述方法測(cè)定其Q，比較載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒和阿霉素在不同時(shí)間點(diǎn)的Q。

2.7 納米粒的抑瘤作用

調(diào)整HeLa細(xì)胞密度為2×104個(gè)/m L，接種在96孔板上，試驗(yàn)分為阿霉素組和納米粒組，分別加入阿霉素質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/m L的阿霉素原料藥或載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。作用12、24、48、72、96 h后，移除含藥培養(yǎng)基，每孔加入200μL含10%MTT（0.5mg/m L）的達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄含MTT的培養(yǎng)基，每孔加入200μL的DMSO。用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長下的光密度（OD），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率（%）＝（1－加藥孔OD值）/空白對(duì)照孔OD值×100%。應(yīng)用SPSS 18.0軟件計(jì)算細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50）。

3 結(jié)果

3.1 納米粒的表征

所制載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒為規(guī)則圓形，分散性良好，無黏連，平均粒徑為（136.7±9.3）nm（n＝5）。載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的透射電鏡圖見圖1，粒徑分布見圖2。

圖1 載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的透射電鏡圖Fig 1 TEM images of adriam ycin-loaded PLGAPLL-PEG nanoparticles

圖2 載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的粒徑分布Fig 2 Particle size distribution of adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles

3.2 納米粒的包封率與載藥量

所制3批載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的包封率分別為77.6%、74.9%、77.5%，平均值為（76.67± 8.63）%；載藥量分別為3.85%、3.78%、3.95%，平均值為（3.86±0.55）%。

3.3 體外釋放行為

阿霉素的Q2h為83.6%，Q12h已達(dá)100%；載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的Q12h為41.3%，Q24h為52.9%，Q144h為81.2%。結(jié)果提示阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒具有緩釋作用，可持續(xù)釋放144 h以上。阿霉素和載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的釋放曲線見圖3。

圖3 阿霉素和載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒的釋放曲線Fig 3 Release curves of adriam ycin and adriam ycinloaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles

3.4 抑瘤作用

3.4.1 不同作用時(shí)間下的抑瘤作用 在阿霉素質(zhì)量濃度為0.2μg/m L時(shí)，隨作用時(shí)間延長，阿霉素對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制率增長迅速，作用12 h的增殖抑制率已達(dá)56.2%，作用48 h后增殖抑制率逐漸進(jìn)入平臺(tái)期，作用96 h的增殖抑制率為96.7%。與阿霉素比較，載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制率隨作用時(shí)間的延長緩慢增長，作用12 h的增殖抑制率為19.6%，作用96 h的增殖抑制率為73.1%，提示載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒具有緩釋作用。阿霉素和載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制率-時(shí)間曲線見圖4A。

圖4 阿霉素和載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制曲線Fig 4 Proliferation inhibition curves of adriam ycin and adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticleson HeLa cells

3.4.2 不同藥物濃度下的抑瘤作用 與阿霉素比較，載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制率增加，阿霉素的IC50為0.345μg/m L，載阿霉素PLGAPLL-PEG納米粒的IC50為1.844μg/m L，提示載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒比同濃度的阿霉素表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑瘤作用。阿霉素和載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制率-藥物濃度曲線見圖4B。

4 討論

藥物緩釋系統(tǒng)是將藥物負(fù)載于可降解或不可降解的載體中，從而降低藥物的釋放速度。藥物的擴(kuò)散除自身擴(kuò)散外，還包括通過骨架的生物降解和溶蝕作用、滲透壓作用，達(dá)到緩釋的目的[3-4]。

生物相容性好和生物降解性是緩控釋體系載體材料的主要特點(diǎn)，具有良好的生物降解性的高分子材料如明膠、血清蛋白等具有較好的生物相容性[5-6]。明膠作為一種水溶性高分子材料，可作為藥物微球或微膠囊化的載體，然而此類載體制備困難、成本較高，因此近年來由于合成類的可生物降解聚合物載體對(duì)藥物具有緩釋作用，故逐漸開發(fā)應(yīng)用于緩控釋體系中，如脂肪族聚酯類、聚氨基酸類[7-8]。目前研究最廣泛的合成類聚合物載體是聚乳酸及其衍生物，已有研究應(yīng)用復(fù)乳法制備了各種藥物的聚乳酸微球[9]。然而聚乳酸具有親油疏水性，在水溶液中的懸浮性較差，因此常加入帶羥基化合物如聚乙二醇單甲醚（mPEG）交聯(lián)進(jìn)行改造，mPEG等親水性物質(zhì)能調(diào)節(jié)聚乳酸載體的降解速度[10-11]。PLGA與m PEG交聯(lián)形成的mPEG-PLGA為兩性聚合物，能夠轉(zhuǎn)載親水性藥物或疏水性藥物[12-13]。本研究應(yīng)用復(fù)乳法制備的載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒，阿霉素的包封率為（76.57±8.63）%，載藥量為（3.86±0.55）%（n＝3）。

抗腫瘤藥物的緩慢釋放，能提高藥物的療效，并降低毒副作用，因此藥物的釋放速率是考察藥物緩釋系統(tǒng)的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，制備的載阿霉素PLGAPLL-PEG納米粒Q12h為41.3%，Q24h為52.9%，Q144h為81.2%。這提示24 h內(nèi)為起始突釋期，為藥物從載體表面的釋放或近表面的藥物在幾小時(shí)內(nèi)快速釋放時(shí)期；24 h之后藥物的釋放共包括兩種機(jī)制，即聚合物載體的溶蝕和載體孔道的擴(kuò)散，聚合物載體溶蝕后釋放出部分藥物，載體溶蝕后或形成孔道，藥物從孔道擴(kuò)散釋放，構(gòu)成體外釋放的降解緩釋期。

本研究通過比較不同濃度載阿霉素PLGA-PLLPEG納米粒和阿霉素對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用，發(fā)現(xiàn)載阿霉素PLGA-PLL-PEG納米粒對(duì)細(xì)胞的IC50顯著高于阿霉素，說明PLGA-PLL-PEG納米粒提高了阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，具有更強(qiáng)的抗腫瘤作用。

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（編輯：鄒麗娟）

Study on Preparation and Antitumor Activity of Adriam ycin-loaded PLGA-PLL-PEG Nanoparticles

LIU Wei1，WANG Xiaotong1，WANG Jianhua2（1.Dept.of Pharmacy，Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China；2.Institute of Geriatrics，General Hospital of PLA，Beijing 100853，China）

OBJECTIVE：To prepare adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles，and study its antitumor activity.METHODS：PLGA-PLL-PEG w ith the polymerization of PLGA-PLL and activated polyethylene glycol was used as carrier for adriamycin，and adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticleswere prepared.The shape size，particle size distribution，adriamycin content of nanoparticles were detected，drug loading and encapsulation efficiency were calculated.Cumulative release rate（Q）of nanoparticles and adriamycin w ithin 144 h and its proliferation inhibition rate on breast cancer HeLa cells were compared，and half inhibitory rate（IC50）was calculated.RESULTS：Prepared adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles were regular circular w ith good dispersion and no adhesion.The average particle size was（136.7±9.3）nm（n＝5），average encapsulation efficiency was（76.67±8.63）%，average drug loading was（3.86±0.55）%（n＝3）.Q12hof adriamycin had reached 100%；Q12hof adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles was 52.9%，Q144hwas 81.2%.The inhibitory rate of adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles on HeLa cells increased slow ly than adriamycin；IC50were 1.844，0.345μg/m L，respectively.CONCLUSIONS：Adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles are prepared successfully，show ing good sustained-release effect and more significant inhibitory effect than adriamycin.

Adriamycin；PLGA-PLL；PEG；Nanoparticles；Tumor cells；Inhibitory

R943

A

1001-0408（2017）16-2262-04

2016-11-03

2017-02-17）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：藥劑學(xué)。電話：010-63926411。E-mail：liuwei8090@126.com

#通信作者：副研究員，碩士。研究方向：老年醫(yī)學(xué)。電話：010-66876421。E-mail：rambler973@sohu.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.28