劉建民，黃良文，朱旭紅，胡 鵬，袁淮濤（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，廣州 510405）

·實驗研究·

3種活血化瘀中藥復(fù)方含藥血清對神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞JAK/ STAT信號通路的影響Δ

劉建民＊，黃良文，朱旭紅，胡 鵬，袁淮濤（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，廣州 510405）

目的：評價3種活血化瘀中藥復(fù)方含藥血清對神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞侵襲行為及Janus激酶（JAK）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）通路的影響。方法：將大鼠隨機分為生理鹽水組（5m L/kg）、桃紅四物湯組（5.7 g/kg）、血府逐瘀湯組（8.5 g/kg）和抵擋湯組（2.8 g/kg），以生藥計，每天ig給藥1次，連續(xù)10 d，末次給藥2 h后制備10%含藥血清培養(yǎng)液。以10%含藥血清培養(yǎng)液干預(yù)U251細胞1周后，采用Transwell法檢測細胞侵襲率，Western blot法檢測細胞中金屬基質(zhì)蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、磷酸化JAK2（p-JAK2）、磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白表達，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)法檢測細胞中MMP-2、MMP-9mRNA表達。結(jié)果：與空白血清比較，血府逐瘀湯含藥血清能降低細胞侵襲率（P＜0.05），下調(diào)細胞中MMP-2、MMP-9mRNA及其蛋白表達以及細胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達（P＜0.05或P＜0.01）；而桃紅四物湯含藥血清和抵擋湯含藥血清作用后上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：在3種活血化瘀中藥復(fù)方中，血府逐瘀湯具有顯著抑制U251細胞侵襲的能力；其機制可能與抑制JAK2/ STAT3信號通路激活，下調(diào)MMP-2、MMP-9基因及蛋白表達有關(guān)。

活血化瘀；侵襲；Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子信號通路；金屬基質(zhì)蛋白酶；膠質(zhì)瘤U251細胞

惡性膠質(zhì)瘤（Malignant gliomas，MGs）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，因其高度侵襲性生長的特點而缺乏有效的治療措施，患者預(yù)后較差，中位生存時間僅大約1年[1-3]。近年來研究表明，活血化瘀中藥能夠抑制腫瘤侵襲，這給MGs治療帶來了新的希望，但這些活血化瘀中藥抗腫瘤侵襲的作用機制尚缺乏研究[4]。Janus激酶（JAK）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）通路的過度活化與MGs細胞浸潤、擴散密切相關(guān)[5]，然而活血化瘀中藥抗腫瘤侵襲作用是否與調(diào)控JAK/STAT信號通路活化有關(guān)尚不清楚?；诖?，本研究選用桃紅四物湯、血府逐瘀湯、抵擋湯3種不同的活血化瘀作用層次的經(jīng)典中藥復(fù)方，從JAK/STAT信號通路磷酸化方面探討其抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞侵襲的可能機制，為尋求治療MGs的臨床有效藥物提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Qwin550圖像分析軟件系統(tǒng)（德國Leica公司）；MK3酶標(biāo)儀（美國ThermoLabsystems公司）；XSP-4C生物顯微鏡（上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司）；DYY-10C電泳儀、DYCP-33A水平電泳槽（中國北京六一儀器廠）；3K15離心機（美國Sigma公司）；7300System熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）儀（美國Agilent公司）。

1.2 藥材與試劑

方中所用藥材桃仁、紅花、川芎、白芍、當(dāng)歸、熟地、生地、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡、枳殼、炙甘草、水蛭、虻蟲、大黃等均購自廣東康美藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)筆者鑒定均為真品；10%小牛血清（廣州瑞舒生物科技有限公司）；PCR引物（美國Invitrogen公司）；兔源性磷酸化JAK2（p-JAK2）、磷酸化STAT3（p-STAT3）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗均購自美國CellSignaling Technology公司；抗金屬基質(zhì)蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9抗體（美國SantaCruz公司）；基底膜基質(zhì)（Matrigel，美國Sigma公司）。

1.3 細胞與動物

神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞株購自上海生物化學(xué)和細胞生物研究所；SD大鼠75只，SPF級，♂，體質(zhì)量為180～220g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心[許可證號：SCXK（粵）2014-0035]。

2 方法

2.1 含藥血清的制備

各方藥經(jīng)生藥鑒定后，分別取方中藥材用水煎煮2次，過濾，制成1g/mL的藥液（以生藥計）。將大鼠隨機分為生理鹽水組（5mL/kg，15只）、桃紅四物湯組（5.7 mL/kg，20只）、血府逐瘀湯組（8.5mL/kg，20只）和抵擋湯組（2.8mL/kg，20只），以生藥藥液ig給藥，各給藥組給藥劑量均按體表面積法折算的人臨床等效劑量[6]，每天1次，連續(xù)10d。末次給藥2h后采血，以離心半徑為6.2cm、3000r/min離心20min，合并同組大鼠血清，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，用1640培養(yǎng)基配成10%含藥血清培養(yǎng)液，4冰箱保存，備用。

2.2 細胞培養(yǎng)及含藥血清干預(yù)

將U251細胞接種于含10%小牛血清、100u/mL青霉素和鏈霉素的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細胞密度為2×104個/mL，在37、5%CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，空白血清組加入生理鹽水組大鼠血清培養(yǎng)液，桃紅四物湯血清組、血府逐瘀湯血清組和抵擋湯血清組分別加入已制備的10%相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)液，然后置于37、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，持續(xù)干預(yù)1周收獲細胞繼續(xù)試驗。

2.3 Transwell法檢測細胞侵襲能力

2.4 Westernblot法檢測細胞中MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達

使用含抑肽酶的緩沖液對細胞進行勻漿處理，離心獲取質(zhì)膜碎片，隨后用1%TritonX-100溶解勻漿，采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。將10μg蛋白加入Laemmli樣品緩沖液（1∶1）混合，強力混勻，置100的水浴箱中水浴加熱5min，隨后經(jīng)4%～20%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離。采用半干式電轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)入聚偏二氟乙烯膜，10%脫脂奶室溫封閉轉(zhuǎn)印2h，放入雜交袋中，加入一抗稀釋液（根據(jù)抗體敏感性稀釋），封口，4孵育過夜，隨后洗膜3次，每次10min；加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫放置1h后洗膜3次，每次10min，使用HRP法在KodakX-OmatAR膠片上檢測。用Image-ProPlusVersion6.0軟件進行分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示蛋白表達的水平。試驗重復(fù)6次。

2.5 RT-PCR法檢測細胞中MMP-2、MMP-9mRNA的表達

從細胞中提取總RNA，取80ng總RNA合成cDNA。經(jīng)過95預(yù)變性5min，循環(huán)內(nèi)95變性30s，58退火30s，72延伸30s，PCR反應(yīng)30個循環(huán)后72再延伸10min，然后4保存，完成普通PCR反應(yīng)。RT-PCR檢測反應(yīng)體系：2×MixSYBRGreenⅠ熒光反應(yīng)液10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.25μL，樣品模板1μL，用滅菌水補足體積至20μL。反應(yīng)條件：95預(yù)變性2min；循環(huán)內(nèi)95變性30s，60退火35 s，設(shè)置40個循環(huán)，并在每個循環(huán)延伸末端點收集熒光信號，繪制擴增曲線；40個循環(huán)后設(shè)置（95、15s，60、30 s，95、15 s）反應(yīng)步驟，并對60～95升溫整個過程進行全程熒光信號收集，繪制融解曲線，使用β-actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)2－ΔΔct公式計算目的基因相對表達量[其中，Δct＝目標(biāo)基因ct－內(nèi)參基因ct]，試驗重復(fù)6次。引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

表1 基因引物序列及產(chǎn)物大小Tab 1 Primer sequencesand sizesofgenes

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 活血化瘀中藥復(fù)方含藥血清對U251細胞侵襲的影響

桃紅四物湯含藥血清組、血府逐瘀湯含藥血清組和抵擋湯含藥血清組細胞侵襲率分別為（88.96±3.38）%、（29.61±2.56）%、（95.56±2.07）%（n＝6），與空白血清組比較，血府逐瘀湯含藥血清組細胞侵襲率顯著降低細胞侵襲能力觀察結(jié)果見圖1。

圖1 各組細胞侵襲能力觀察結(jié)果（×200）Fig 1 Resu lts of cell invasive ability in each group（× 200）

3.2 細胞中MMP-2、MMP-9、p-JAK 2、p-STAT3蛋白表達測定結(jié)果

與空白血清組比較，血府逐瘀湯含藥血清組細胞中MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達均顯著減弱（P＜0.05），而桃紅四物湯含藥血清組和抵擋湯含藥血清組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），蛋白表達電泳圖見圖2、測定結(jié)果見表2。

圖2 各組細胞中MMP-2、MMP-9、p-JAK 2、p-STAT3蛋白表達的電泳圖Fig 2 Electrophoretogram s of MMP-2，MMP-9，p-JAK 2，p-STAT3 protein expressions in cells of each group

表2 各組細胞中MMP-2、MMP-9、p-JAK 2、p-STAT3蛋白表達測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2 ResultsofMMP-2，MMP-9，p-JAK 2，p-STAT3 protein expressions in cellsof each group（±s，n＝6）

表2 各組細胞中MMP-2、MMP-9、p-JAK 2、p-STAT3蛋白表達測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2 ResultsofMMP-2，MMP-9，p-JAK 2，p-STAT3 protein expressions in cellsof each group（±s，n＝6）

注：與空白血清組比較，＊P＜0.05Note：vs.blank serum group，＊P＜0.05

p-STAT3 0.602±0.019 0.412±0.014 0.127±0.011＊0.411±0.015組別空白血清組桃紅四物湯含藥血清組血府逐瘀湯含藥血清組抵擋湯含藥血清組MMP-2 0.685±0.022 0.458±0.016 0.022±0.009＊0.405±0.022 MMP-9 0.808±0.020 0.613±0.024 0.193±0.015＊0.470±0.024 p-JAK2 1.513±0.028 1.250±0.019 0.265±0.018＊0.943±0.024

3.3 細胞中MMP-2、MMP-9m RNA表達測定結(jié)果

與空白血清組比較，血府逐瘀湯含藥血清組細胞中MMP-2、MMP-9mRNA表達顯著減弱（P＜0.01），桃紅四物湯含藥血清組和抵擋湯含藥血清組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見表3。

表3 各組細胞中MMP-2、MMP-9m RNA表達測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 3 ResultsofMMP-2，MMP-9m RNA expressions in cellsofeach group（±s，n＝6）

表3 各組細胞中MMP-2、MMP-9m RNA表達測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 3 ResultsofMMP-2，MMP-9m RNA expressions in cellsofeach group（±s，n＝6）

注：與空白血清組比較，＊＊P＜0.01Note：vs.blank serum group，＊＊P＜0.01

組別空白血清組桃紅四物湯含藥血清組血府逐瘀湯含藥血清組抵擋湯含藥血清組MMP-9 1.000±0.000 0.719±0.071 0.544±0.029＊＊0.965±0.094 MMP-2 1.000±0.000 0.899±0.066 0.545±0.023＊＊0.924±0.099

4 討論

中藥血清藥理學(xué)是利用含藥血清代替中藥復(fù)方而供實驗研究使用的一種非單體藥物藥理研究的方法，使體外試驗?zāi)M了體內(nèi)過程，達到了體外試驗?zāi)軌蚍从乘幬矬w內(nèi)真實狀態(tài)的目的，現(xiàn)此方法已被廣泛用于抗腫瘤的研究中[7]。本研究選用3種不同的活血化瘀作用層次的經(jīng)典中藥復(fù)方，利用其含藥血清從JAK/STAT信號通路磷酸化方面探討了其抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞侵襲的可能機制。

STAT3通常以無活性的單體形式存在于細胞質(zhì)中，當(dāng)STAT被上游的JAK信號激活后，主要以活化的p-STAT形式進入細胞核內(nèi)，刺激并導(dǎo)致某些與細胞侵襲密切相關(guān)的致癌基因異常表達，調(diào)節(jié)與癌細胞遷移和侵襲等相關(guān)的靶基因（MMP-2、MMP-9）轉(zhuǎn)錄活性[5]。MMP-2、MMP-9作為STAT3活化后引起遷移和侵襲的相關(guān)靶基因，是膠質(zhì)瘤侵襲性預(yù)測的指標(biāo)之一[8-9]。本研究結(jié)果顯示，血府逐瘀湯含藥血清干預(yù)U251細胞后，細胞侵襲能力顯著降低，細胞中p-STAT3、p-JAK 2蛋白以及MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表達均顯著減弱，而桃紅四物湯含藥血清和抵擋湯含藥血清作用不明顯。可見，血府逐瘀湯抑制U251細胞侵襲可能是通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活及下游侵襲相關(guān)靶基因MMP-2、MMP-9的表達而起作用。

綜上，血府逐瘀湯可以作為一種JAK2/STAT3磷酸化的有效抑制劑進一步用于抗膠質(zhì)瘤的研究，同時本研究也為開發(fā)一種新的抗腫瘤藥物或藥物前體提供了一定的參考依據(jù)。

[1] Morgan LL.The epidemiology of glioma in adults：a“state of the science”review[J].Neuro Oncol，2015，17（4）：623-624.

[2] Blacher E，Ben Baruch B，Levy A，etal.Inhibition of glioma progression by a new ly discovered CD38 inhibitor [J].Int JCancer，2015，136（6）：1422-1433.

[3] 李全國，胡永強.替莫唑胺聯(lián)合放療用于惡性腦膠質(zhì)瘤患者的臨床觀察[J].中國藥房，2015，26（26）：3690-3692.

[4] 黃良文，劉建民，袁淮濤.活血化瘀中藥抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的研究進展[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2014，4（6）：37-39、67.

[5] Chen F，Xu Y，Luo Y，etal.Down-regulation of STAT3 decreases invasion activity and induces apoptosis of human glioma cells[J].JMol Neurosci，2010，40（3）：353-359.

[6] 陳賜慧，花寶金.關(guān)于中藥血清藥理學(xué)實驗的幾個問題和探討[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（1）：46-48.

[7] 陳健媚，郭姣.中藥血清藥理學(xué)研究進展[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2016，32（3）：390-393.

[8] Hagemann C，Anacker J，Ernestus RI，etal.A complete compilation ofmatrixmetalloproteinase expression in humanmalignant gliomas[J].World JClin Oncol，2012，13（5）：67-79.

[9] Shim KN，Jung SA，Joo YH，etal.Clinical significance of tissue levels ofmatrixmetalloproteinases and tissue inhibitors ofmetalloproteinases in gastric cancer[J].JGastroenterol，2000，42（2）：120-128.

Effects of 3 Kinds of Serum Containning Blood-activating and Stasis-elim inating TCM Com pound Formulas on JAK/STAT Signal Pathway of Glioma U251 Cells

LIU Jianmin，HUANG Liangwen，ZHU Xuhong，HU Peng，YUAN Huaitao（Dept.of Neurosurgery，the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

OBJECTIVE：To evaluate the effects of 3 kinds of serum containing blood-activating and stasis-elim inating TCM compound formulas on aggressive behavior，Janus kinase（JAK）/signal transduction and transcriptional activator（STAT）pathway of glioma U251 cells.METHODS：Rats were random ly divided into normal saline group（5 m L/kg），Taohong Siwu decoction group（5.7 g/kg），Xuefu Zhuyu decoction（8.5 g/kg）and Didang decoction（2.8 g/kg），calculated by crude drug，intragastrically adm inistrated once a day，for 10 d.10%drug-containing serum culturemedium was prepared after 2 h of last adm inistration.A fter 10%drug-containing serum culturemedium intervening U251 cells for 1 week，Transwellmethod was conducted to detect the cell invasion rate，Western blot was adopted to detect the metal matrix protease 2（MMP-2），MMP-9，phosphorylated JAK2（p-JAK2），phosphorylated STAT3（p-STAT3）protein expression；and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction method was used to detect MMP-2，MMP-9 mRNA expression.RESULTS：Compared w ith blank serum，Xuefu Zhuyu decoction drug-containing serum can reduce cell invasion rate（P＜0.05），decrease the MMP-2，MMP-9 mRNA and its protein expression，and p-JAK2，p-STAT3 protein expression in cells（P＜0.05 or P＜0.01），while there was no significant difference in above-mentioned indexes in Taohong Siwu decoction drug-containing serum group and Didang drug-containing serum group（P＞0.05）.CONCLUSIONS：In the 3 kinds of blood-activating and stasis-elim inating TCM compound formulas，Xuefu Zhuyu decoction shows significant invasive effect on inhibiting U251 cells；the mechanism may be related to inhibiting the activation of JAK2/STAT3 signal pathway and decreasing MMP-2，MMP-9 gene and protein expressions.

Blood-activating and stasis-elim inating；Invasion；Janus kinase/signal transduction and transcriptional activator pathway；Metalmatrix protease；Glioma U251 cells

R966；R285

A

1001-0408（2017）16-2176-04

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81072907）；廣州市科技計劃基金項目（No.201607010365）；廣州中醫(yī)藥大學(xué)“高水平大學(xué)建設(shè)”項目（No.A1-AFD018171Z11072）

＊副教授，博士。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究。電話：020-36591396。E-mail：jm l_liu@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.04