許艷麗 鮑蕾 何曉霞 吳振興 靜平 曹文卿 梁成珠*

（1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局山東青島266001；2.青島出入境檢驗(yàn)檢疫局）

生物分子相互作用技術(shù)檢測(cè)黃曲霉毒素B1

許艷麗1鮑蕾1何曉霞2吳振興1靜平1曹文卿1梁成珠1*

（1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局山東青島266001；2.青島出入境檢驗(yàn)檢疫局）

建立一種利用生物分子相互作用技術(shù)檢測(cè)飼料中黃曲霉毒素B1的方法。將黃曲霉毒素B1抗體固化在芯片上，樣品經(jīng)甲醇-水提取、稀釋后通過(guò)固化黃曲霉毒素B1抗體的芯片，從而測(cè)定樣品中的黃曲霉毒素B1含量。方法檢出限為1 μg/kg，檢測(cè)限為2 μg/kg，回收率為67.0%-90.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.57%-7.81%。該方法檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便易行。

生物分子相互作用；黃曲霉毒素；黃曲霉毒素B1抗體

1 前言

黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要是由黃曲霉（A.flavus）、寄生曲霉（A.parasiticus）和集蜂曲霉（A.nonius）等菌株產(chǎn)生。黃曲霉毒素是一種毒性很強(qiáng)的肝毒素，可引起肝臟的急性或慢性損害，此外對(duì)腎臟等其他多種組織器官也能造成嚴(yán)重?fù)p害。更為嚴(yán)重的是黃曲霉毒素已被證實(shí)具有致癌、致畸、致細(xì)胞突變的“三致”作用，黃曲霉毒素B1被公認(rèn)為是目前致癌力最強(qiáng)的天然物質(zhì)，廣泛存在于花生、玉米、麥類、稻谷等農(nóng)產(chǎn)品中，嚴(yán)重危害人、畜、禽類健康[1]，1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ類致癌物[2]。

黃曲霉毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、質(zhì)譜法以及以酶聯(lián)免疫為基礎(chǔ)的免疫分析/免疫親和分析法，如酶聯(lián)免疫吸附法等多種方法[3-7]。生物分子相互作用分析技術(shù)是超微量檢測(cè)領(lǐng)域中一項(xiàng)新興的檢測(cè)技術(shù)，是將表面等離子共振與芯片技術(shù)相結(jié)合而建立的一類微量物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，由于該技術(shù)無(wú)需借助標(biāo)記物進(jìn)行分析，使其廣泛應(yīng)用于各類小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和寡聚糖直至類脂、噬菌體、病毒和細(xì)胞的測(cè)定和診斷[8-11]。與其他分析技術(shù)不同，生物分子相互作用分析技術(shù)是一項(xiàng)通用的檢測(cè)技術(shù)，可以任意耦聯(lián)如上所述任一種生物分子到生物芯片表面，因此生物分子相互作用分析技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域特別廣泛，尤其適合高通量檢測(cè)，在幾分鐘內(nèi)自動(dòng)完成一個(gè)樣品的分析，能在無(wú)人情況下連續(xù)分析幾百個(gè)樣品。

本研究以毒性最大的黃曲霉毒素B1（簡(jiǎn)稱AFB1）為研究對(duì)象，探索利用分子相互作用技術(shù)檢測(cè)AFB1的方法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器

Biacore 3000：美國(guó)GE Healthcare公司；CM-5商品芯片：美國(guó)GE Healthcare公司；ULTRA-TURRAXT-25高速均質(zhì)器：德國(guó)IKA公司。

2.1.2 試劑

EDC、NHS：美國(guó)GE Healthcare公司；AFB1抗體：SIGMA公司；黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）：SIGMA公司；甲醇、乙腈：均為色譜純，德國(guó)默克公司；PBS溶液（10倍濃縮液）：VICAM公司；Glycine-HCl（pH 3.0、pH 2.5和pH 1.5）、0.1 mol/L HAc-NaAc緩沖液（pH=4.5）、1 mol/L鹽酸乙醇胺溶液（pH=8.5）：美國(guó)GE Healthcare公司；水為重蒸水。

2.2 方法

2.2.1 溶液配制

載流緩沖液（PBS）：將PBS溶液用水稀釋10倍，經(jīng)過(guò)濾、脫氣后，4-8℃下保存。

樣品稀釋液：0.1 mol/L HAc-NaAc緩沖液，pH=4.5，無(wú)菌過(guò)濾。

封閉液：1 mol/L鹽酸乙醇胺溶液（pH=8.5），無(wú)菌過(guò)濾。

AFB1抗體：將AFB1抗體溶于100 μL水中，于-20℃下保存。

2.2.2 芯片表面處理方法

芯片表面用0.4 mol/L的EDC和0.1 mol/L NHS等體積混合后上機(jī)，活化10 min后，進(jìn)樣AFB1抗體，設(shè)置流速10 μL/min，進(jìn)樣10 min，然后用封閉液封閉6 min，流速為10 μL/min。

2.2.3 樣品的提取及制備

本樣品選取基質(zhì)效應(yīng)較大的飼料樣品，稱取25.0 g樣品，加入125 mL 60%甲醇-水溶液，用高速均質(zhì)器均質(zhì)2 min提取，以普通濾紙過(guò)濾10 mL，加入20 mL水稀釋，再次以玻纖濾紙過(guò)濾，待用。

2.2.4 測(cè)試條件

載流為PBS，流速為5 μL/min。

3 結(jié)果與分析

3.1 AFB1抗體在傳感芯片表面的固化

本研究采用的標(biāo)準(zhǔn)物為AFB1，分子式C17H12O6，分子量312.27，分子內(nèi)不含有氨基或亞氨基，因此，采用將AFB1抗體偶聯(lián)到羧化后的葡聚糖（CM5）芯片表面。AFB1抗體固化、封閉后的RU增量約為11535.7 RU（RU：Resonance unit共振單位）。

本研究測(cè)試了在不同pH值醋酸鈉溶液里進(jìn)行偶聯(lián)的效果，如圖1所示。a（pH 4.0）、b（pH 4.5）、c（pH 5.0）都可以實(shí)現(xiàn)需要的偶聯(lián)水平，c與b偶聯(lián)量相差不多，但c偶聯(lián)量達(dá)到了飽和狀態(tài)，因此，選用b（pH 4.5）的10 mmol/L醋酸鈉進(jìn)行抗體偶聯(lián)。

圖1 不同pH的醋酸鈉偶聯(lián)量

3.2 芯片再生實(shí)驗(yàn)

分別采用3種pH值（pH 3.0、pH 2.5和pH 1.5）的Glycine-HCl再生溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖2。

圖2再生條件試驗(yàn)

圖2 顯示，在pH值3.0時(shí)，Sample response值與初始值（starting levels）相比明顯降低，說(shuō)明再生條件過(guò)于溫和，芯片上結(jié)合的化合物可能未完全洗脫；在pH值1.5時(shí)，baseline值與初始值（starting levels）相比明顯降低，表明再生條件過(guò)于嚴(yán)苛，芯片上偶聯(lián)的抗體受到損傷。綜合上述考慮，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇pH 2.5的Glycine-HCl再生溶液。

固化AFB1抗體芯片檢測(cè)溶液中AFB1的實(shí)驗(yàn)如圖3所示。選擇再生條件為pH 2.5的Glycine-HCl溶液，10 μL，流速為5 μL/min。由圖3可以看出，采用這一再生條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和一致性都很好。

圖3 芯片再生實(shí)驗(yàn)

3.3 偶聯(lián)后芯片的穩(wěn)定性

將CM5芯片偶聯(lián)AFB1抗體后，存于PBS緩沖液中，置于4℃冰箱保存，每隔2-5 d取出，檢測(cè)芯片的共振響應(yīng)，結(jié)果如圖4所示。在30 d內(nèi)共振響應(yīng)無(wú)明顯改變，檢測(cè)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%，可見該偶聯(lián)條件下AFB1抗體穩(wěn)定性較好。

圖4 偶聯(lián)后芯片穩(wěn)定性測(cè)試

3.4 方法的建立及標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)以上確定的實(shí)驗(yàn)條件，采用固化AFB1抗體芯片檢測(cè)一組梯度AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）顯示線性較好。

圖5 不同濃度的AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.5 方法的檢出限和檢測(cè)限

根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖的信噪比（S/N）確定方法的檢出限和檢測(cè)限，方法的檢出限為1 μg/kg（S/N≥3），檢測(cè)限為2 μg/kg（S/N≥10）。

3.6 方法的回收率及精密度測(cè)定

本方法的精密度實(shí)驗(yàn)是在空白飼料中添加AFB1抗體標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為1水平（2 μg/kg）、2水平（4 μg/kg）、3水平（8 μg/kg）共3個(gè)水平，每水平進(jìn)行10次平行實(shí)驗(yàn)，回收率范圍在67.0%-90.1%；精密度為6.57%-7.81%。

3.7 方法的特異性

本實(shí)驗(yàn)向被測(cè)樣品添加不同濃度的AFB2、AFG1、AFG2等與AFB1結(jié)構(gòu)類似的生物毒素作為競(jìng)爭(zhēng)干擾物，檢測(cè)其對(duì)AFB1的影響。結(jié)果顯示，AFB2、AFG1、AFG2作為干擾物，沒(méi)有對(duì)AFB1的檢測(cè)產(chǎn)生顯著影響，說(shuō)明該方法具有良好的選擇性和專一性。

4 結(jié)論

本研究利用生物分子相互作用技術(shù)，在芯片表面固化AFB1抗體后直接檢測(cè)樣品中的AFB1含量。對(duì)該方法的試劑穩(wěn)定性、方法特異性、回收率等進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，該方法的檢測(cè)靈敏度高，有機(jī)溶劑使用量少，每個(gè)芯片的每個(gè)通道可重復(fù)利用，降低了檢測(cè)成本；檢測(cè)時(shí)間短，一般5 min內(nèi)即可檢測(cè)出結(jié)果，降低了檢測(cè)人員的工作強(qiáng)度；該方法操作簡(jiǎn)便易行，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作，易于推廣；通過(guò)SPR檢測(cè)器的自動(dòng)記錄，減少主觀性，可以用于不同樣品的大批量檢測(cè)，應(yīng)用于不同的檢測(cè)需求中。

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Determination of Aflatoxin B1by Biomolecular Interaction Analysis

XU Yanli1，BAO Lei1，HE Xiaoxia2，WU Zhenxing1，JING Ping1，CAO Wenqing1，LIANG Chengzhu1*
（1.Shandong Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau，Shandong，Qingdao，266001；2.Qingdao Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau）

The concentration of aflatoxin B1in feed was determined by the surface plasmon resonance technique.The chip immobilized by anti-AFB1body to determine the AFB1in the sample solution.The LOD of method is 1 μg/kg and LOQ is 2 μg/kg，the recoveries of AFB1are 67.0%-90.1%，and the relative standard deviations are 6.57%-7.81%.This method is of high sensitivity，convenience operation.

Biomolecular Interaction Analysis；Aflatoxin B1；Aflatoxin B1Anti-Body

TS207.4

E-mail：evillive1124@163.com；*通訊作者E-mail：liangcz@163.com

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012IK174）

2016-11-15