紀(jì)倩，宿丹丹，應(yīng)慧妍，陳敬華

（江南大學(xué)藥劑學(xué)與藥劑材料學(xué)研究室，江蘇無錫214122）

豬皮中膠原蛋白的提取與結(jié)構(gòu)鑒定

紀(jì)倩，宿丹丹，應(yīng)慧妍，陳敬華*

（江南大學(xué)藥劑學(xué)與藥劑材料學(xué)研究室，江蘇無錫214122）

以豬皮為原料，使用酶法提取膠原蛋白，對提取條件和過程進行篩選和優(yōu)化，并對膠原產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)進行表征。結(jié)果表明，膠原蛋白產(chǎn)物的提取率為65.33%；純度為87.38%；熱變性溫度在118.79℃；紫外最大吸收波長為203 nm；相對分子質(zhì)量為3.63×105g/mol；紅外光譜和圓二色譜結(jié)果顯示，產(chǎn)物具有典型的膠原蛋白吸收峰，說明提取出的膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)保存完整；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）結(jié)果顯示所得膠原產(chǎn)物主要由3種亞基組分組成。

豬皮；膠原蛋白；提?。患兓?；結(jié)構(gòu)鑒定

膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的主要成分，主要分布于哺乳動物的結(jié)締組織中。三條α鏈纏繞成的螺旋結(jié)構(gòu)是膠原蛋白的最普遍結(jié)構(gòu)特征，其獨特的三重螺旋結(jié)構(gòu)使其分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，而且免疫原性低，生物相容性良好。膠原蛋白在豬皮蛋白質(zhì)中的含量可達87.8%[1]，但我國的豬皮多應(yīng)用于皮革生產(chǎn)，因此，提取豬皮中的膠原蛋白可以提高豬皮的利用價值。

本文使用酶法提取豬皮中的膠原蛋白，通過篩選脫脂條件，鹽析方法與純化方法，確定膠原蛋白提取的條件，并對豬皮提取物的分子量、提取率、純度、熱穩(wěn)定溫度、三股螺旋結(jié)構(gòu)完整性、亞基組成進行測定，旨在提高膠原蛋白品質(zhì)，為豬皮中膠原蛋白的提取及結(jié)構(gòu)表征提供試驗參考。

1 試驗材料、儀器

1.1 材料與試劑

豬皮：無錫市周新農(nóng)貿(mào)市場；過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、考馬斯亮藍、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%丙烯酰胺（丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺質(zhì)量比為29∶1）、Tris、溴酚藍（BPB）：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白（分子量 10 kDa～200 kDa）：美國 Thermo scientific公司；胃蛋白酶（3 000 U/mg）：上海拓旸生物科技有限公司；羥脯氨酸：Biosharp公司；氯化鈉、冰醋酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、乙醚、石油醚、甘氨酸（Glycine）、一水合檸檬酸、醋酸鈉、正丙醇、氯胺 T、對二甲氨基苯甲醛、異丙醇、高氯酸、鹽酸、二水合氯化亞錫、甲醇、疊氮化鈉、十二烷基硫酸鈉（SDS）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

5804R離心機：艾本德中國有限公司；Multifuge X3R離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；BSA 124S分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；AL104電子天平、FE30/EL30實驗室電導(dǎo)率儀：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BL-2200H電子天平、UV-2550分光光度計：日本島津公司；GZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；MS-H280-Pro恒溫磁力攪拌器：美國賽洛捷克公司；Gel Doc XR伯樂凝膠成像儀：美國伯樂BIO-RAD公司；FreeZONE冷凍干燥機：美國Labconco公司；JYLC03V九陽切菜料理機：九陽股份有限公司。

2 試驗方法

2.1 豬皮中膠原蛋白的提取

豬皮塊→去脂→漂洗至中性→酸溶液中酶解→鹽析→純化→冷凍干燥→膠原蛋白產(chǎn)物

2.1.1 前處理

將新鮮豬皮去毛，刮除表皮脂肪，水漂洗3次，將豬皮切成5 mm×5 mm方形小塊，用料理機攪碎豬皮20 g，按照 1 ∶10（g/mL）的比例加入脫脂溶液，于磁力攪拌器上攪拌脫脂數(shù)小時。脫脂結(jié)束后，除去堿溶液，用清水洗滌豬皮至中性。

2.1.2 酶解

按照1∶10（g/mL）的比例配制pH為2.5的醋酸溶液，將脫脂的豬皮浸泡于酸溶液中，再按照酶：豬皮1∶50（質(zhì)量比）的比例加入胃蛋白酶（3 000 U/mg），于4℃酶解24 h，每隔3 h攪拌5 min，酶解過程中用醋酸精密調(diào)節(jié)pH在2。

2.1.3 鹽析

對酶解液抽濾，取濾液。配制2.5 mol/L的NaOH溶液，逐滴加入濾液中，使濾液pH值升至7～8，記錄濾液總體積。再加入一定量的NaCl，使NaCl的終濃度為4 mol/L，置于4℃鹽析1 h，鹽析結(jié)束后于4℃，8 000 r/min離心15 min。收集離心沉淀，即為膠原粗產(chǎn)物。

2.1.4 純化

配制pH 2.5的醋酸溶液，將上步得到的膠原蛋白粗產(chǎn)物溶于少量醋酸溶液，6000r/min，4℃、離心10min，取上清液，裝入分子截留量為8 000 kDa～14 000 kDa的透析袋中，于pH 3.0的醋酸溶液中透析兩天，去離子水透析一天，凍干后即得純化的膠原蛋白樣品。

2.2 豬皮中膠原蛋白含量及膠原蛋白提取率測定

羥脯氨酸存在于膠原蛋白、伸展蛋白和彈性蛋白中，其他蛋白質(zhì)中不含有羥脯氨酸，其占膠原蛋白總質(zhì)量的10%[2]，因此可通過測定樣品中羥脯氨酸的相對含量來確定所提取的膠原蛋白的純度。

2.2.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

稱取2.5 mg羥脯氨酸，溶于500 mL去離子水中。使用去離子水分別將羥脯氨酸濃度稀釋為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 μg/mL。參照張燕婉[3]的試驗方法，分別取4 mL上述溶液于20 mL具塞試管中，先加入2 mL、14.1 mg/mL的氯胺T溶液，搖勻并靜置20 min，使含有吡咯環(huán)的氧化物生成，再加入2 mL對二甲氨基苯甲醛溶液，與羥脯氨酸氧化物反應(yīng)生成紅色化合物，用紫外分光光度計于561 nm波長處測定吸光度，繪制羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 豬皮中膠原蛋白含量的測定

稱取約4 g豬皮，與0.5 g二水合氯化亞錫同時溶于100 mL、6 mol/L的鹽酸溶液中，100℃冷凝回流20 h。提取液過0.45 μm的水膜后，定容至250 mL容量瓶中，取20 mL精密調(diào)節(jié)pH值至8，離心取上清液，定容至250 mL，稀釋10倍后按照2.2.1的顯色方法處理豬皮提取液，測定羥脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并以10.0的換算系數(shù)，按照下式計算膠原蛋白的含量：

式中：c為待測樣的濃度，μg/mL；M為豬皮干重，g；V為調(diào)節(jié)pH值前的體積，mL。

2.2.3 提取物中膠原蛋白含量的測定

稱取5 mg的膠原蛋白樣品，與0.5 g二水合氯化亞錫同時溶于100 mL、6 mol/L的鹽酸溶液中，100℃冷凝回流20 h。提取液過0.45 μm的水膜后，定容至250 mL容量瓶中，取60 mL精密調(diào)節(jié)pH值至8左右，離心取上清液，定容至100 mL，稀釋10倍后按照2.2.1的顯色方法處理樣品提取液，按照下式計算膠原蛋白的含量：

式中：c為待測樣的濃度，μg/mL；M為膠原蛋白樣品重量，mg；V為調(diào)節(jié)pH前的體積，mL。

2.2.4 提取率的計算

根據(jù)下式計算膠原蛋白的提取率：

2.3 膠原蛋白的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 凝膠滲透色譜分析

凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography，GPC）是根據(jù)聚合物分子滲透進入和洗脫流出色譜柱中多孔材料的不同程度來分離的一種液相色譜。以50 mmol/L、pH 5.4的醋酸鈉作為流動相和溶劑，使膠原蛋白濃度處于千分之一至千分之五之間。使用GPC專用砂芯漏斗過濾醋酸鈉溶液。接柱后設(shè)置流速為0.1 mL/min，掃描樣品并計算樣品中膠原蛋白的相對分子質(zhì)量。

2.3.2 差示量熱掃描分析

稱取3 mg～5 mg樣品，放置于40 μL專用坩堝內(nèi)，壓蓋，空白坩堝作為參比池。設(shè)置DSC分析儀升溫速率為10℃/min，溫度掃描范圍為20℃～200℃，記錄吸熱曲線。

2.3.3 紫外光譜分析

以0.5 mol/L的醋酸溶液溶解膠原蛋白樣品，醋酸溶液作為空白對照，掃描波長設(shè)置為190 nm～300 nm。

2.3.4 紅外光譜分析

由于膠原蛋白不易與溴化鉀共同研磨成細粉狀，因此取少量膠原蛋白樣品，使用全反射法對樣品進行檢測。在25℃，450 cm-1～4 000 cm-1的范圍進行掃描。

2.3.5 圓二色譜分析

以0.5 mol/L的醋酸溶液為溶劑，配制濃度為0.1 mg/mL的膠原蛋白樣品溶液10 mL，充分溶解，平衡12h，離心取上清液[4]。設(shè)置波長范圍190 nm～240 nm，比色皿光程1 mm，掃描速度0.5 nm/s；檢測環(huán)境25℃，氮氣。以0.5 mol/L的醋酸溶液作為空白對照。

2.3.6 SDS-PAGE凝膠電泳

溶解膠原蛋白樣品，與上樣緩沖液混合，于沸水中水浴5 min，冷卻。配制8%的分離膠，5%的濃縮膠。將膠板放入電泳儀，上樣量20 μL。設(shè)置電壓80 V，觀察樣品跑至分離膠上邊緣，再調(diào)節(jié)電壓到120 V。電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍染色，洗脫液洗凈后進行電泳圖譜拍攝及分析。

3 試驗結(jié)果分析

3.1 脫脂處理對膠原蛋白提取的影響

3.1.1 脫脂溶劑的選擇

豬皮前處理，經(jīng)過預(yù)試驗，分別選用濃度為0.1mol/L 的氫氧化鈉溶液[5]、8%（g/mL）的碳酸鈉溶液[6]、乙醚與石油醚（體積比1∶1）[7]混合液脫脂4 h，豬皮重量：溶劑體積為1∶10（g/mL），未經(jīng)脫脂的豬皮作為空白對照，烘干稱重，用索氏提取法提取脂肪，分析不同脫脂溶劑的去脂效果。0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡4 h，豬皮上的脂肪多半從真皮上脫落，并漂浮在溶液中，少部分脂肪通過外力也易被刮除，溶劑對脫脂效果的影響見圖1。

圖1 溶劑對脫脂效果的影響Fig.1 Effects of different degreasing solvents

如圖1所示，0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液的脫脂效果最好，因此選用氫氧化鈉溶液對豬皮進行脫脂。

3.1.2 脫脂時間的選擇

選取脫脂效果最好的0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液作時間的單因素試驗，浸泡時間分別為：2、4、6、8 h，烘干稱重，用索氏提取法提取脂肪，分析時間對脫脂效果的影響。時間對脫脂效果的影響見圖2。

圖2 時間對脫脂效果的影響Fig.2 Effects of different degreasing time

如圖2所示，隨著脫脂時間的增長，脫脂效果也隨之增加，但脫脂時間超過6 h后，脫脂率沒有明顯的提高，而脫脂時間過長，會增加豬皮變性的程度。因此，采用脫脂時間為6 h，每間隔2 h攪拌5 min。

3.2 鹽析方式對鹽析效果的影響

鹽析步驟中氯化鈉的加入方式對鹽析效果有明顯影響，通過兩種方式：一種是逐漸加入氯化鈉固體達到鹽析濃度，另一種是使用所需鹽濃度的氯化鈉溶液。試驗結(jié)果表明，直接加入氯化鈉固體會導(dǎo)致鹽的局部濃度過大，從而使得膠原蛋白局部大量析出，影響膠原蛋白品質(zhì)（圖3b）；可以通過透析的方法避免這種現(xiàn)象，但是透析所需要的鹽質(zhì)量和透析體積非常大，而且必須考慮氯化鈉的溶解度問題，所以此方法可行性不高；采用滴管逐滴加入溶解完全的氯化鈉溶液[8]，既能避免局部濃度過大的問題，也能控制溶液體積，凍干后得到的膠原蛋白疏松均勻，外觀良好（圖3a）。因此，氯化鈉的加入方式對膠原蛋白的提取有重要影響。

圖3 凍干后的膠原蛋白形態(tài)Fig.3 The form of collagen after freeze drying

3.3 膠原蛋白提取率的測定

3.3.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

在561 nm波長處測定羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到公式y(tǒng)=0.175 9x+0.059 6，y為吸光度，x為濃度 μg/mL，方差 R2為 0.999 9，準(zhǔn)確度高，可用于計算樣品中羥脯氨酸含量，再轉(zhuǎn)換為膠原蛋白含量。

3.3.2 豬皮中膠原蛋白的提取率

有報道指出蛋白質(zhì)在豬皮中的含量約有33%，其中大部分為膠原蛋白，含量在87.8%[9]。本試驗測出膠原蛋白在豬皮中含量為42.80%，可能是由于選取了膠原含量較高的豬背脊皮膚作為原料的原因。提取的膠原蛋白純度達到87.38%，提取率為65.33%。

3.4 膠原蛋白結(jié)構(gòu)鑒定

3.4.1 GPC

膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)是由三條肽鏈組成的，分子量約為300 kDa[10]。本試驗中產(chǎn)物的分子量分布在300 kDa～400 kDa之間，膠原蛋白的GPC圖譜見圖4。

如圖4所示，符合膠原蛋白最普遍的結(jié)構(gòu)特征，通過計算得到膠原產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量為3.63×105g/mol。

3.4.2 膠原蛋白的熱穩(wěn)定分析

通常膠原蛋白的熱收縮溫度（Ts）反映膠原蛋白的熱穩(wěn)定性，指的是膠原纖維收縮到原來長度三分之一時的溫度[11]。差示量熱掃描（DSC）不僅可以確定試樣的熔點，也能測定樣品的純度，樣品用量少而且操作簡便。當(dāng)物質(zhì)含有雜質(zhì)時，DSC峰會變寬，熔點降低[12]。膠原蛋白的DSC圖譜見圖5。

圖4 膠原蛋白的GPC圖譜Fig.4 GPC chromatogram of collagen

圖5 膠原蛋白的DSC圖譜Fig.5 DSC thermogram of collagen

如圖5所示，本試驗中產(chǎn)物的熱變性溫度為118.79℃，比之前報道中的膠原蛋白熱變性溫度（77.27℃）有所提高[4]，說明膠原蛋白熱穩(wěn)定性良好，三股螺旋結(jié)構(gòu)保持較為完整。

3.4.3 紫外光譜分析結(jié)果

膠原蛋白的紫外圖譜見圖6。

圖6 膠原蛋白的紫外圖譜Fig.6 UV spectrum of collagen

如圖6所示，胃蛋白酶法提取豬皮中膠原蛋白樣品在200 nm～300 nm波長處的紫外吸收（A），樣品中膠原蛋白的最大吸收峰在203 nm處，與文獻報道膠原蛋白最大紫外吸收在225 nm有差異[5]，但也符合膠原特征。

3.4.4 紅外光譜分析

膠原蛋白的紅外圖譜見圖7。

圖7 膠原蛋白的紅外圖譜Fig.7 Infrared spectrogram of collagen

如圖7所示，3 200 cm-1～3 600 cm-1代表酰胺A帶的N-H伸縮振動（氫鍵）峰[13]；2 929 cm-1代表酰胺B帶N-H和C-H伸縮振動吸收峰，二者都表明肽鍵間氫鍵的存在[14]；1 630 cm-1代表酰胺Ⅰ帶，是形成三股螺旋內(nèi)氫鏈的C=O基團的伸縮振動強峰，表征膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的存在；1 549 cm-1代表酰胺Ⅱ帶的υ N-H彎曲振動、υ C-N伸縮振動吸收峰；1 463 cm-1處的吸收峰表征了肽鍵的順式構(gòu)型，說明膠原蛋白分子中含有大量脯氨酸和羥脯氨酸。因為脯氨酸殘基的肽單位之外，絕大多數(shù)多肽鏈中肽單位的N-H和C=O都是反式排列；1 338 cm-1代表酰胺Ⅳ帶C-H伸縮，N-H變形或NH2搖擺峰；1 238 cm-1代表酰胺Ⅲ帶的N-H變形峰；1 081 cm-1是C-O或C-H-C伸縮振動峰。其中，1 450 cm-1～1 230 cm-1附近存在吸收峰，表明樣品中膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)保存完整[15]。

3.4.5 圓二色譜

在蛋白質(zhì)中，氨基酸的α-碳原子是不對稱碳原子，具有光學(xué)活性，蛋白質(zhì)的肽鏈走向也是不對稱的結(jié)構(gòu)，也具有光學(xué)活性，當(dāng)平面圓偏振光通過這些光活性的生色基團時，光活性中心對平面圓偏振光中的左右圓偏振光的吸收不相同，產(chǎn)生了吸收差值，由于這種吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圓偏振光變成了橢圓偏振光，這就是蛋白質(zhì)的圓二色性。一般蛋白質(zhì)的圓二色光譜分成兩段，波長范圍在185 nm～245 nm稱為遠紫外區(qū)，245 nm～320 nm稱為近紫外區(qū)。遠紫外區(qū)是蛋白質(zhì)肽鏈的吸收峰，反映了主鏈的構(gòu)象。

豬皮中提取的膠原蛋白在遠紫外區(qū)的圓二色譜圖見圖8。

圖8 膠原蛋白的圓二色光譜圖Fig.8 Circular dichroism spectrum of collagen

如圖8所示，193 nm處存在一個負峰，220 nm處存在一個正峰，正負峰強度比值為0.142，說明膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)保持得較好，符合膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的典型特征圓二色譜峰型[16]。

3.4.6 膠原蛋白的亞基組成

Ⅰ型膠原蛋白有兩條α1鏈，一條α2鏈；Ⅲ型膠原蛋白有三條α1鏈；α2鏈?zhǔn)洽裥湍z原蛋白的特征鏈，所以α2鏈的存在說明Ⅰ型膠原蛋白的存在[8]。膠原蛋白SDS-PAGE圖見圖9。

如圖9所示，明顯的α2鏈表明Ⅰ型膠原蛋白的存在；位于120 kDa附近的是Ⅰ型膠原蛋白的α1、α2鏈；位于200 kDa附近的是α鏈的一種二聚體-β鏈；位于200 kDa上方的是α鏈的三聚體-γ鏈。120 kDa以下并沒有其他條帶，說明膠原蛋白的結(jié)構(gòu)保存較好，沒有被分解成多肽，也沒有小分子水解膠原的生成[17]。

圖9 膠原蛋白SDS-PAGE圖Fig.9 SDS-PAGE electrophoresis of collagen

4 結(jié)論

確定豬皮中膠原蛋白提取的工藝：按照1∶10（g/mL）的比例加入0.1 mol/L NaOH溶液浸泡除脂6 h，酶解24 h后，逐滴加入溶解完全的氯化鈉溶液鹽析，采用醋酸溶液透析的方法純化膠原蛋白粗品，去離子水透析后凍干即得膠原蛋白樣品。結(jié)構(gòu)鑒定表明，本試驗提取的樣品符合膠原蛋白的紫外、紅外、圓二色譜吸收特征，三股螺旋結(jié)構(gòu)保持完整；其由α，β和γ三種亞基組分組成；熱變性溫度高達118.79℃，熱穩(wěn)定性好；分子量在300 kDa～400 kDa之間；樣品純度高，提取率好。因此，本研究提取的豬皮膠原蛋白具有高質(zhì)量高純度，適用于生物醫(yī)用材料。

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Extraction of Pigskin Collagen and Its Structural Identification

JI Qian，SU Dan-dan，YING Hui-yan，CHEN Jing-hua*
（Laboratory of Pharmaceutics and Pharmaceutical Materials Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

The research used pigskin as raw material，which was treated by enzymes，to extract collagen.To confirm and optimize the best extraction condition and process，the structural properties of collagen product were characterized.The experiment results showed that the extraction yield of collagen product was 65.33%and the purity was 87.38%.The thermal denaturation temperature was 118.79℃.The maximum UV absorption wavelength was 203 nm.The relative molecular mass was 3.63×105g/mol.Infrared spectrum and round two chromatographic experiments showed that the product had a typical collagen absorption peak，indicating the three helical structure of collagen extracted was intact；SDS-PAGE gel electrophoresis test showed that the product was mainly composed of three sub components.

pigskin；collagen；extraction；purification；structural characterization

2017-03-31

江蘇省產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新資金項目（BY2014023-17）

紀(jì)倩（1989—），女（漢），實驗師，碩士，主要從事藥劑學(xué)及生物醫(yī)用材料研究。

*通信作者：陳敬華（1971—），男（漢），教授，博士生導(dǎo)師，主要從事藥劑學(xué)與藥物材料研究。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.010